Способ культивирования микроорганизмов и аппарат для его осуществления

 

Использование: микробиологическая промышленность, культивирование микроорганизмов в суспензиях с использованием ферментаторов с инокуляторами. Сущность изобретения: способ включает культивирование в емкости с аэрацией среды и использованием в качестве посевного материала культуральной жидкости предыдущей генерации микроорганизмов на стадии их экспоненциального развития путем подачи этой жидкости из рабочего объема в инокулятор посредством эрлифта при одновременной пульсации потока воздуха 10 - 30 Гц и последующее захолаживание культуральной жидкости до 5 - 10С для исключения инактивации микроорганизмов. Аппарат содержит корпус с встроенным в верхней его части инокулятором в виде обечайки с днищем. Средство для подачи в инокулятор посевного материала представляет собой сифон, верхний участок которого размещен в полости обечайки, а нижний у дна корпуса, при этом сифон снабжен пульсатором воздуха, а инокулятор - автономным теплообменным устройством. 2 с. п. ф-лы, 2 ил. , 1 табл.

Изобретение относится к микробиологии, а именно к способам и устройствам для культивирования микроорганизмов, и может быть использовано в медицинской, химической, пищевой и других отраслях промышленности при проведении процессов в асептических условиях, когда к ним предъявляются повышенные требования по предупреждению проникновения в стерильные полости аппаратов и коммуникаций посторонней микрофлоры и окружающей среды.

Известен способ культивирования микроорганизмов, при котором часть культуральной жидкости периодически удаляется из основного объема ферментатора при постепенном добавлении свежей среды [1] .

Данный способ культивирования является промежуточным между периодическим и непрерывным, приемлем он не для всех продуцентов и не обеспечивает чистоты отбора посевного материала. По истечении определенного количества генераций "отъема-долива" процесс вырождается. Для перекачивания культуральной жидкости используют насосы. При этом к культуральной жидкости, находящейся в магистрали, прекращается подача кислорода, что приводит к инактивации продуцентов, а воздействие насосов оказывает травмирующее действие на культуру микроорганизма.

Известен аппарат для культивирования микроорганизмов, содержащий ферментатор и размещенные в нем инокулятор и посевной аппарат [2] .

Недостатком аппарата является наличие большого количества запорной арматуры, устройств для прокачивания, что увеличивает вероятность инфицирования культуры посторонней микрофлорой и инактивации продуцента.

Наиболее близким к предлагаемому устройству является аппарат для выращивания микроорганизмов, содержащий вертикальный корпус, инокулятор, размещенный в его верхней части, теплообменные, аэрирующие устройства и средства для подачи посевного материала в инокулятор.

Недостатками указанного аппарата являются также недостаточно высокая степень поддержания асептических условий в процессе культивирования и возможность травмирования культуры микроорганизмов при перекачивании культуральной жидкости с помощью насосов.

Целью предлагаемых способа и устройства является повышение выхода продукта за счет исключения инактивации продуцентов и повышения асептических показателей.

Для достижения этой цели в известном способе культивирования микроорганизмов в ферментаторе с размещенным внутри рабочего объема инокулятором в качестве посевного материала используется культуральная жидкость предыдущей генерации на стадии экспоненциального развития, подаваемая из рабочего объема ферментатора в инокулятор эрлифтом путем пульсационной подачи воздуха с частотой 10-30 Гц под уровень заполнения ферментатора с дальнейшим захолаживанием.

Для достижения поставленной цели в известном устройстве для глубинного культивирования микроорганизмов, содержащем вертикальный корпус, размещенный в его верхней части инокулятор, теплообменные, аэрирующие устройства и средство для подачи посевного материала в инокулятор, последнее выполнено в виде сифона, верхний изогнутый конец которого опущен во внутреннюю полость инокулятора, а нижний расположен с зазором от дна ферментатора и соединен с пульсатором посредством воздухопровода, расположенного ниже уровня заполнения ферментатора.

Из научно-технической и патентной литературы авторам не известны источники, содержащие совокупность признаков, изложенных в формуле, что позволяет сделать вывод о соответствии предложений критерию "существенные отличия".

На фиг. 1 представлен аппарат для культивирования микроорганизмов, продольный разрез.

Аппарат для выращивания микроорганизмов содержит вертикальный цилиндрический корпус 1, аэрирующее устройство, состоящее из воздухоподводящей трубы 2 с аэратором 3, и перемешивающее устройство, содержащее вал 4 с мешалками 5. В верхней части аппарата коаксиально корпусу 1 установлена обечайка 6 с днищем 7, прикрепленным к стенке корпуса, образующая инокулятор. В днище 7 вварены патрубки 8 для перелива культуральной жидкости из рабочего объема инокулятора в рабочий объем аппарата или для отбора проб. Между корпусом аппарата и обечайкой 6 с зазором к днищу 7 размещена вертикальная кольцевая циркуляционная перегородка 9. Верхняя кромка перегородки 9 находится ниже верхней кромки обечайки 6. В нижней части инокулятора между стенкой корпуса и циркуляционной перегородкой 9 размещено кольцевое аэрирующее устройство (аэратор) 10. Магистрали 11 и 12 для подачи питательной среды подключены соответственно к инокулятору и аппарату. Подача культуральной жидкости из рабочего объема ферментатора в инокулятор осуществляется с помощью сифона 13. Сифон соединен с пульсатором 14 посредством воздухопровода 15. Воздухопровод 15 расположен ниже уровня заполнения ферментатора. Теплообменное устройство 16 создает автономную систему охлаждения для инокулятора, теплообменное устройство 17 - для ферментатора.

Работа аппарата осуществляется следующим образом.

После стерилизации подается питательная среда через магистраль 11 и инокулятор и через магистраль 12 в основной аппарат. При этом заполнение питательной средой инокулятора происходит за несколько минут, а заполнение основного аппарата продолжается около 2 ч. После заполнения инокулятора производят его засев чистой культурой микроорганизмов, при этом заполнение основного аппарата продолжается. Включаются аэратор 10 и теплообменное устройство 16, и начинается процесс биосинтеза в инокуляторе.

К моменту достижения максимальной концентрации микроорганизмов в инокуляторе питательная среда заполняет требуемый объем основного аппарата. Производят доведение ее температуры до оптимальной температуры культивирования. После этого осуществляют отбор пробы из инокулятора с целью проверки на микробиологический анализ и передачу культуральной жидкости из инокулятора в рабочий объем аппарата. Подается воздух в барботер, и включается мешалка 5. Проводится процесс культивирования в основном аппарате. При достижении стадии экспоненциального развития культуры в основном аппарате культуральная жидкость подается из рабочего объема в инокулятор. Для этого сжатый воздух с частотой 10-30 Гц подается с помощью пульсатора 14 по воздухопроводу 15 к сифону 13. Культуральная жидкость из рабочего объема ферментатора эжектируется через нижний конец сифона. Подъем образующейся газожидкостной смеси происходит за счет эрлифтного эффекта. В инокуляторе культуральная жидкость захолаживается с целью исключения инактивации до температуры 5-10^оС и хранится до следующего посевного периода, в котором используется в качестве посевного материала. В дальнейшем цикл повторяется.

Использование в качестве посевного материала культуральной жидкости предыдущей генерации на стадии экспоненциального развития создает преимущество перед известным способом, поскольку дает возможность использовать молодую культуру с большим коэффициентом генераций и большой скоростью размножения и позволяет повысить выход продукта и улучшить асептические показатели процесса.

Подача культуральной жидкости из рабочего объема ферментатора в инокулятор эрлифтом путем пульсационной подачи воздуха также способствует достижению поставленной цели, что подтверждается данными проведенных экспериментальных исследований.

На фиг. 2 представлен график зависимости роста экзопротеазной активности бактерий Bac. thuring. var kenyae при культивировании по известному способу в известном устройстве (а), согласно предлагаемому способу в предлагаемом устройстве (б).

Из приведенного графика видно, что максимум экзопротезной активности наблюдается при культивировании в известном устройстве согласно известному способу на 14 часу, в предлагаемом - на 12 часу культивирования и составляет соответственно 96,8 и 432,6 мкг/мл.

Скачкообразное увеличение производительности аппарата от частоты пульсационной подачи воздуха наблюдается в диапазоне 10-30 Гц (таблица). (56) 1. Яковлев В. И. Технология микробиологического синтеза. М. : Химия, 1987, с. 26.

2. Авторское свидетельство СССР N 1161545, кл. C 12 M 1/04, 1985.

3. Авторское свидетельство СССР N 1010122, кл. C 12 M 1/04, 1983.

Формула изобретения

1. Способ культивирования микроорганизмов, включающий их выращивание в емкости ферментатора с использованием инокулятора, расположенного в рабочем объеме среды культивирования, и предусматривающий аэрацию культуральной жидкости, отличающийся тем, что в качестве посевного материала используют культуральную жидкость предыдущей генерации микроорганизмов на стадии их экспоненциального развития путем подачи этой жидкости из рабочего объема ферментатора в инокулятор посредством эрлифта при одновременной пульсационной подаче аэрирующего воздуха с частотой пульсации 10 - 30 Гц под уровень заполнения емкости и последующим захолаживанием культуральной жидкости до температуры 5 - 10^oС для исключения инактивации микроорганизмов.

2. Аппарат для культивирования микроорганизмов, содержащий вертикальный корпус, размещенный в нем инокулятор, аэрирующее устройство, теплообменное устройство и средство для подачи посевного материала в инокулятор, отличающийся тем, что инокулятор размещен в верхней части емкости и выполнен в виде обечайки с днищем, а средство для подачи посевного материала представляет собой сифон, верхний изогнутый участок которого размещен во внутренней полости указанной обечайки и нижний расположен у дна ферментатора с зазором, при этом сифон снабжен пульсатором подаваемого воздуха, подключенным к нему воздухопроводом в нижней своей части, причем инокулятор снабжен автономным теплообменным устройством.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4