Биодатчик для определения биологически активных веществ, взаимодействующих с двухцепочечными молекулами нуклеиновых кислот

 

Использование: медицинская и клиническая биохимия, фармацевтическая промышленность. Сущность изобретения: в водно-солевом растворе, содержащем проксанол, формируют жидкокристаллическую дисперсию ДНК холестерического типа, затем к смеси добавляют раствор мономеров акриламида и вызывают их полимеризацию, которая сопровождается образованием синтетического полимерного матрикса во всем объеме раствора. Пространственное расположение молекул проксанола, сшитых полиакриламидом, обеспечивает формирование псевдокапсул с заключенной внутри жидкокристаллической дисперсией ДНК холестерического типа. Характерной особенностью нового биодатчика является высокая прозрачность полимерного матрикса. 5 ил.

Изобретение относится к медицинской технике, биотехнологии и фармацевтической промышленности.

Изобретение может быть использовано в медицинской и клинической биохимии, а также молекулярной фармакологии при исследовании биологически активных веществ и препаратов, "мишенью" которых является генетический материал клеток.

Известны две группы методов, используемых при скрининге биологических активных веществ (БАВ) .

Первую группу составляют биологические методы , заключающиеся в том, что на хорошо изученных генетических системах бактерий и бактериофагов проверяют действие веществ, вызывающих прямые и обратные мутации.

Недостаток этой группы методов состоит в том, что на пути проникновения вещества в клетку (от клеточной мембраны до генетического материала) происходит модификация структуры вещества, снижающая точность установления корреляции между структурой вещества и его биологической активностью. Еще одним недостатком этой группы методов является длительность проведения экспериментов (от суток до недель).

Вторую группу составляют физико-химические методы. Один из них - оптический . В этом методе, в его общепринятой постановке анализируются изменения спектральных свойств линейных, двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, вызываемые действием БАВ в растворе.

Относительно невысокая чувствительность такого варианта оптического метода, учитывающего изменение электронных свойств азотистых оснований нуклеиновых кислот, ограничивает его применение. Еще одним недостатком физико-химических методов в их, традиционной постановке является то обстоятельство, что молекулы нуклеиновых кислот в составе биологических объектов (вирусах и хромосомах) могут находиться в особом состоянии, свойства которого отличаются от свойств линейных выделенных из ядер клеток или вирусных частиц молекул нуклеиновых кислот. Поэтому данные, полученные при изучении взаимодействия БАВ с линейными молекулами нуклеиновых кислот, зачастую нельзя переносить на свойства молекул нуклеиновых кислот в клетке.

Отмеченные выше недостатки методом, используемых при скрининге БАВ, в настоящее время достаточно успешно устраняются при помощи биодатчиков, создаваемых на основе лиотропных жидкокристаллических кислот холестерического типа, псевдокапсулированных в состав синтетического полимерного матрикса.

Известен жидкокристаллический биодатчик данного типа (биодатчик 1-го поколения) , принятый за прототип, представляющий собой синтетический полимерный матрикс, содержащий в своем составе псевдокапсулированные жидкие кристаллы нуклеиновых кислот холестерического типа.

Синтетический полимерный матрикс, созданный на основе одного из полигликолей и применяемый в биодатчиках 1-го поколения, проницаем для БАВ (например, антибиотиков и т.д.) и оптически изотропен. Однако этот матрикс является полупрозрачным. Это обстоятельство влияет на точность результатов измерений аномальной оптической активности холестерических жидких кристаллов нуклеиновых кислот.

Целью изобретения является повышение точности и воспроизводимости результатов измерений аномальной оптической активности холестерических жидких кристаллов нуклеиновых кислот при скрининге БАВ.

Это достигается в результате использования в качестве одного из компонентов синтетического полимерного матрикса водорастворимого полимера "проксанола", представляющего собой блоксополимер окиси этилена и окиси пропилена.

Сначала в водно-солевом растворе, содержащем проксанол, формируют жидкокристаллическую дисперсию ДНК холестерического типа.Затем к полученной смеси добавляют раствор мономеров акриламида и вызывают их полимеризацию. Полимеризация мономеров акриламида, приводящая к образованию полиакриламида, сопровождается формированием синтетического полимерного матрикса во всем объеме раствора. Отличительная особенность подобранной реакции состоит в том, что при достижении определенной степени полимеризации мономеров акриламида в состав полимерного матрикса включаются молекулы проксанола. При этом чередование остатков окиси этилена и окиси пропилена обеспечивает высокую прозрачность полимерного матрикса. Пространственное расположение молекул проксанола, сшитых полиакриламидом, вокруг частиц жидкокристаллической дисперсии ДНК создает "псевдокапсулу". Формирование "псевдокапсул" во всем объеме раствора обеспечивает консервацию жидкокристаллической дисперсии ДНК холестерического типа.

Важная особенность предлагаемого синтетического полимерного матрикса состоит в том, что подобранные условия создания полимерного матрикса обеспечивают сохранение аномальной оптической активности холестерической жидкокристаллической дисперсии ДНК, которая, как показано ранее , выступает в качестве критерия, позволяющего детектировать взаимодействие различных БАВ с ДНК. Еще одной важной особенностью синтетического полимерного матрикса, формируемого на основе проксанола, является его прозрачность, что в сочетании с доступностью препаратов проксанола увеличивает точность и воспроизводимость результатов измерения аномальной оптической активности.

Принцип действия предлагаемого датчика не отличается от принципа действия датчика, предложенного ранее , и состоит в том, что молекулы БАВ, диффундируя в синтетический полимерный матрикс, взаимодействуют с молекулами ДНК, образующими холестерические жидкие кристаллы, "законсервированные" в синтетическом полимерном матриксе. Изменения в спектрах кругового дихроизма (КД), регистрируемые при взаимодействии БАВ с молекулами ДНК, позволяют детектировать наличие БАВ в исследуемом растворе, а характер этих изменений - определить типа взаимодействия БАВ с ДНК, т.е. эти изменения позволяют "ранжировать" БАВ по эффективности их взаимодействия с ДНК.

П р и м е р 1. Приготовление на основе проксанола синтетического полимерного матрикса, не содержащего жидких кристаллов нуклеиновых кислот.

1.1 Навески NаН₂РО₄˙2Н₂О (78 г) и Nа₂НРО₄˙12Н₂О (1,79 г) помещают в мерную колбу (V=1000 мл) и растворяют в дистиллированной воде; доводят объем раствора до метки.

1.2 Навески NаCL (29,22 г), NаН₂РО₄˙2Н₂О (0,39 г) и Na₂НРО₄˙12Н₂О (0,895 г) помещают в мерную колбу (V=500 мл) и растворяют в дистиллированной воде; доводят объем раствора до метки.

1.3 7,5 мл 100%-ного раствора проксанола ЦЛ-3 *(проксанол ЦЛ-3, изготовитель НПО "Химволокно", Мытищи, Россия) помещают в мерную колбу и растворяют в растворе 1.2; доводят объем раствора до метки.

1.4 В мерную колбу (V=25 мл) помещают 67,5 мкл раствора N,N,N ',N '-тетраметилэтилендиамина (ТЕМЕД), 7,5 мл 100%-ного раствора "проксанола ЦЛ-3" и 5 мл раствора 1.1; доводят объем раствора до метки раствором 1.2.

1.5 В мерную колбу (V=25 мл) помещают 2,35 г акриламида, 0,061 г N,N' -метиленбисакриламида, 7,5 мл 100%-ного раствора проксанола ЦЛ-3 и растворяют в 12,5 мл раствора 1.2; доводят объем раствора до метки раствором 1.1.

1.6 Смешивают 8 мл раствора 1.3, 1,25 мл раствора 1.4 и 2,5к мл раствора 1.5.

1.7. Полученную смесь обезгаживают при комнатной температуре (водоструйный насос; перемешивание; время обезгаживания 15 мин).

1.8 В обезгаженную смесь (1.7) добавляют на кончике шпателя персульфат аммония.

1.9. Обезгаженную смесь (1.8) разливают в оптические кюветы, имеющие толщину слоя и форму, удобную для экспериментатора.

1.10. Для выравнивания верхнего уровня синтетического полимерного матрикса на поверхность смеси 1.9 до начала полимеризации наслаивают 0,1-0,5 мл раствора 1,1.

1.11 Смесь 1.10 в оптической кювете оставляют стоять при комнатной температуре на свету. Через 30-40 мин после добавления персульфата аммония происходит полимеризация, приводящая к получению практически прозрачного синтетического полимерного матрикса.

1.12 Отмытый в растворе 1.3 от побочных и остаточных продуктов реакции полимеризации, полученный по операциям 1.6-1.11 синтетический полимерный матрикс, является оптически изотропным.

На фиг.1 приведены фотографии полиакриламидного геля (А) и синтетических полимерных матриксов (Б,В), сформированных на основе проксанола ЦЛ-3 (Б) и полиэтиленгликоля (В). Нетрудно видеть, что синтетический полимерный матрикс, формируемый на основе проксанола ЦЛ-3, более прозрачен по сравнению с синтетическим полимерным матриксом, сформированном на основе полиэтиленгликоля. По этому параметру он достаточно близок к полиакриламидному гелю.

П р и м е р 2. Формирование жидкокристаллической дисперсии ДНК в водно-солевом растворе проксанола ЦЛ-3.

2.1 Навеску лиофильно высушенного препарата ДНК из эритроцитов цыплят (12,5 мг) помещают в мерную колбу (V=25 мл) и растворяют в растворе 1.1; доводят объем до метки, дополнительно очищают от примесей, деполимеризуют (УЗ-дезинтегратор УЗДН-1 УЧ. 2, частота 35 кГц, время УЗ-обработки 1 мин; 4^оС) и диализуют против раствора 1.1 для удаления низкомолекулярных продуктов УЗ-деполимеризации.

2.2 В пробирке (V=5 мл) смешивают 0,24 мл раствора 2.1, 0,9 мл 100%-ного раствора проксанола ЦЛ-3 и 1,86 мл раствора 1.1. Таким образом, получают проксанолсодержащий (С_ЦЛ-3 ≃ 30%) раствор ДНК низкой ионной силы.

2.3 В пробирке (V=5 мл) смешивают 0,9 мл 100%-ного раствора проксанола ЦЛ-3 и 2,1 мл раствора 1.2. Таким образом получают водно-солевой раствор проксанола ЦЛ-3 (С_ЦЛ-3 ≃ 30%) высокой ионной силы.

2.4 В пробирке (V=5 мл) смешивают 1,5 мл раствора 2.2 и 1,5 раствора 2.3; интенсивно перемешивают в течение 30 с. В результате этой операции в растворе 2.4 формируется жидкокристаллическая дисперсия ДНК, свойства которой можно контролировать при помощи оптических методов.

На фиг.2 сопоставлены спектры поглощения водно-солевого раствора исходной ДНК (кривая 1) и проксанолсодержащего водно-солевого раствора ДНК высокой ионной силы (кривая 2). Видно, что в водно-солевом растворе проксанола оптическая плотность в полосе поглощения ДНК (λ≃260 нм) уменьшается, а в области длин волн, превышающих 320 нм, увеличивается. Поскольку при длинах волн, превышающих 320 нм ни ДНК, ни проксанол ЦЛ-3 не обладают собственным поглощением, увеличение оптической плотности в этой области спектра обусловлено рассеянием УФ-излучения на частицах дисперсии ДНК (так называемая "кажущаяся" оптическая плотность).

Таким образом, в водно-солевом растворе проксанола ЦЛ-3 двухцепочечные молекулы ДНК низкой молекулярной массы образуют дисперсную фазу.

Для выяснения вопроса о характере укладки молекул ДНК в частицах дисперсной фазы, образующейся в водно-солевом растворе проксанола ЦЛ-3, была использована КД-спектроскопия.

На фиг.3 спектр КД водно-солевого раствора исходной ДНК (кривая 1) сопоставлен со спектром КД-дисперсии, сформованной в одно-солевом растворе проксанола ЦЛ-3 высокой ионной силы (кривая 2). Интенсивная полоса в спектре КД расположена в области поглощения азотистых оснований ( λ≃270 нм), форма этой полосы аналогичная форме полосы поглощения ДНК, и значение величины Δε₂₇₀, характеризующее дооптическую активность азотистых оснований в составе частиц дисперсной фазы ДНК, во много раз превышает величину Δε₂₇₀ , характеризующую молекулярную оптическую активность азотистых оснований в составе исходных линейных молекул ДНК.

Сочетание полученных результатов с результатами, полученными ранее другими авторами , дает основание считать, что упаковка молекул ДНК в составе частиц дисперсной фазы, формируемой в водно-солевом растворе проксанола ЦЛ-3, не отличается от упаковки этих молекул в составе холестерических жидких кристаллов.

П р и м е р 3. Приготовление синтетического полимерного матрикса на основе проксанола ЦЛ-3, содержащего частицы жидкокристаллической дисперсии ДНК холестерического типа.

3.1 Смешивают 0,72 мл раствора 2.1, 2,7 мл 100%-ного раствора проксанола ЦЛ-3 и 5,58 мл раствора 1.1. Таким образом получают 9 мл проксанолсодержащего водно-солевого раствора ДНК низкой ионной силы.

3.2 Смешивают 2,7 мл 100%-ного раствора проксанола ЦЛ-3 и 6,3 мл раствора 1.2. Таким образом получают 9 мл водно-солевого раствора проксанола ЦЛ-3 высокой ионной силы.

3.3 В течение 30 с интенсивно перемешивают 5 мл раствора 3.1 и 5 мл раствора 3.2. В результате этой операции получают 10 мл раствора жидкокристаллической дисперсии ДНК холестерического типа, свойства которой контролируют при помощи оптических методов (спектрофотометрия, круговой дихроизм).

3.4 Для приготовления жидких кристаллов ДНК, включенных в состав синтетического полимерного матрикса, формируемого на основе проксанола ЦЛ-3, смешивают 8 мл раствора 3.3, 1,25 мл раствора 1.4 и 2,5 мл раствора 1,5.

3.5 Дальнейшая обработка полученной смеси ведется по примеру 1 (пункты 1.7-1.11).

3.6 Контролируют свойства частиц жидкокристаллической дисперсии ДНК, включенных в состав синтетического полимерного матрикса, при помощи отмеченных выше оптических методов.

На фиг. 4 сопоставлены спектры КД, характерные для раствора проксанола ЦЛ-3, содержащего частицы дисперсной жидкокристаллической фазы ДНК (кривая 1), и для синтетического полимерного матрикса, содержащего в своем составе жидкие кристаллы ДНК (кривая 2). Соответствие между кривыми 1 и 2 свидетельсвтует о том, что свойства жидких, кристаллов ДНК не меняются в процессе псевдокапсулирования.

П р и м е р 4. Применение жидкокристаллического биодатчика для определения наличия и способа ориентации БАВ, взаимодействующих с двухцепочечными нуклеиновыми кислотами.

4.1 Синтетический полимерный матрикс, содержащий частицы жидкокристаллической дисперсии ДНК холестерического типа, приготовленный по примеру 3, помещают в раствор 2.3, в который добавлено противоопухолевое соединение бисантрен - 9,10-антрацендикарбоксальдегид-бис-(4,5-дигидрокси-1Н-имидазол-2-ил) гидразон дигидрохлорид (ВS).

4.2 Через 30 мин регистрируют спектр КД.

Полученные результаты представлены на фиг.5. Обращают на себя внимание два эффекта. Во-первых, амплитуда интенсивной отрицательной полосы ( λ =270 нм), характерной для синтетического полимерного матрикса, содержащего частицы жидкокристаллической дисперсии ДНК холестерического типа, практически не меняется в присутствии ВS. Во-вторых, в спектре КД в области поглощения ВS появляется дополнительная отрицательная полоса ( λ =415 нм), форма которой напоминает форму полосы поглощения ВS. Появление дополнительной полосы в спектре КД свидетельствует, во-первых, о том, что синтетический полимерный матрикс на основе проксанола ЦЛ-3 полностью проницаем для молекул ВS и, во-вторых, отражает факт взаимодействия этого соединения с молекулами ДНК, образующими частицы жидкокристаллической дисперсии, расположенными в "псевдокапсулах".

Кроме того, в полном соответствии с теоретическими представлениями отрицательный знак полосы в спектре КД в области поглощения ВS свидетельствует также о том, что молекулы ВS располагаются на молекуле ДНК таким образом, при котором угол наклона составляет ≃ 90^о. Это возможно в том случае, когда молекулы ВS располагаются между парами азотистых оснований ДНК, т.е. являются интеркаляторами.

Наконец, как видно из фиг.5, измеряемая на опыте амплитуда отрицательной полосы в спектре КД в области поглощения ВS прямопропорциональна концентрации молекул ВS, связанных с ДНК.

Таким образом, полученные результаты означают, что предлагаемый на основе проксанола ЦЛ-3 синтетический полимерный матрикс сохраняет все положительные особенности полимерного матрикса, созданного ранее , и характеризуется более высокой по сравнению с ним степенью прозрачности.

Формула изобретения

БИОДАТЧИК ДЛЯ ОПРЕДЕЛЕНИЯ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ВЕЩЕСТВ, ВЗАИМОДЕЙСТВУЮЩИХ С ДВУХЦЕПОЧЕЧНЫМИ МОЛЕКУЛАМИ НУКЛЕИНОВЫХ КИСЛОТ, представляющий собой жидкокристаллическую дисперсию холестерического типа линейных двухцепочечных молекул нуклеиновых кислот, псевдокапсулированную в состав синтетического полимерного матрикса, отличающийся тем, что синтетический полимерный матрикс формируют на основе блоксополимера этилена и окиси пропилена.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5