Способ определения активности каталазы в биологических объектах

 

Сущность изобретения: пробу биологического материала обрабатывают перекисью водорода и смесью ацетона и йодистого калия в отношении 1 : 1, причем анализ проводят фотоколориметрированием пробы на светофильтре с длиной волны 435 - 445 мм. 2 табл.

Изобретение относится к энзимологии и может быть использовано в сельском хозяйстве, медицине и пищевой промышленности.

Известен газометрический способ определения активности каталазы по Варбургу и его модификации. Сущность этого способа заключается в улавливании и измерении объема выделившегося кислорода после прибавления к водному раствору перекиси водорода экстракта каталазы [1].

Недостатками этого способа являются необходимость расчета и учета постоянного объема сосуда, зависимость от внешних условий (температуры, высоты местности над уровнем моря и атмосферным давлением), необходимость в приспособлении для механического взбалтывания прибора и по возможности исключения прикосновения руками к колбе или склянке.

Известен способ выявления каталазной активности в биологических объектах, основанный на формировании в качестве поддерживающей среды для электрофореза полиакриламидного геля (ПААГ) с использованием крахмала, проведении электрофореза и последующего окрашивания геля иодистым калием. Отличие способа состоит в том, что крахмал вводят в количестве, не превышающем 0,5 мас.%, на стадии подготовки раствора надсернокислого аммония при приготовлении разделяющего геля, а окрашивание осуществляют обработкой в 1%-ном растворе перекиси водорода рН 7,0 с последующей инкубацией в 1%-ном растворе уксусной кислоты, при этом время выдерживания в каждом из этих растворов составляет 3-10 мин [2].

Недостатками способа является наличие оборудования для проведения электрофореза, необходимость в соответствующих реактивах для приготовления ПААГ, длительность проведения анализа.

Известен титрометрический способ определения активности каталазы по А. Н.Баху и А.И.Опарину, основанный на учете неразложившейся перекиси водорода с помощью перманганата калия, который был выбран нами в качестве прототипа. Сущность его заключается в следующем. Берут навеску пробы 1-2 г и растирают с кварцевым песком в ступке, добавляя постепенно 2-3 мл воды. Для уменьшения кислой реакции добавляют на кончике шпателя карбонат кальция до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. Растертую массу количественно переносят в мерную колбу и доводят водой до 100 мл. Смесь оставляют стоять в течение 30-60 мин, после чего ее фильтруют. В коническую колбу на 200 мл берут пипеткой 25 мл 0,1 н. раствора пероксида водорода и добавляют туда же пипеткой 20 мл вытяжки фермента. Через 30 мин действие фермента прекращают прибавлением 5 мл 10%-ного раствора серной кислоты и титруют смесь 0,1 н. раствором перманганата калия (до образования устойчивого в течение 1 мин розового окрашивания). Одновременно ставят контроль с инактивированным нагреванием в кипящей бане в течение 5 мин ферментным раствором (20 мл). К этому раствору после охлаждения добавляют 25 мл 0,1 н. раствора Н₂О₂. Смесь оставляют стоять на 30 мин, после чего добавляют 5 мл 10% -ного раствора серной кислоты и титруют 0,1 н. раствором перманганата калия. Отмечают количество миллилитров перманганата калия, израсходованного на титрование всего количества пероксида водорода. По разнице между опытным и контрольным титрованиями находят количество перманганата, эквивалентное количеству разложенного ферментов пероксида водорода.

Расчет количества пероксида водорода, разложенного ферментом, ведут, исходя из того, что 1 мл 0,1 н. раствора перманганата калия соответствует 1,7 мл пероксида водорода [3].

Недостатками способа являются получение субъективных результатов в процессе титрации, необходимость постоянной проверки титра перманганата калия щавелевокислым аммонием, необходимость ежедневной проверки титра пероксида водорода, сложность расчета.

Целью изобретения является упрощение способа определения активности каталазы.

Цель достигается тем, что в способе определения активности каталазы в биологических объектах путем окрашивания пробы раствором, содержащим йодистый калий, с последующим анализом, пробу биологического материала обрабатывают перекисью водорода и смесью (ацетона и йодистого калия в отношении 1:1), причем анализ проводят путем фотоколориметрирования пробы на ФЭК - 56 М при длине волны 435-445 нм, а активность каталазы определяют по формуле A=D:0,02, где A - активность каталазы в пробе; D - оптическая плотность исследуемой пробы; 0,02 - коэффициент перевода в условные единицы активности (Е).

Предлагаемое изобретение основано на взаимодействии перекиси водорода с иодистым калием по уравнениям: 2H₂O₂ 2H₂O + O₂ H₂O + 2KI ___→ 2 KOH+I₂ Сопоставительный анализ с прототипом показывает, что заявляемый способ отличается тем, что для определения активности каталазы используют перекись водорода и смесь иодистого калия и ацетона в отношении 1:1, а по прототипу активность каталазы определяют титрованием перманганатом калия пероксида водорода, разложенного ферментом, по разности между опытным и контрольным титрованиями, а в предлагаемом способе - колориметрированием пробы.

В предлагаемом способе упрощение определения активности достигается за счет отсутствия, во-первых, субъективизма в оценке результатов анализа, во-вторых, необходимости в ежедневном титровании перекиси водорода и, в-третьих, исключения раствора перманганата калия, для установления титра которого необходимо 5-6 дней.

При проведении патентно-информационного поиска не было обнаружено технических решений с признаками сходными с признаками, отличающимися заявляемое изобретение от прототипа.

Таким образом, предлагаемое решение обладает новизной и существенными отличиями.

Предлагаемый способ осуществляют следующим образом.

3% -ный раствор иодистого калия в 50%-ном ацетоне готовят следующим образом. 50 мл 3%-ного раствора иодистого калия растворяют в 50 мл ацетона, т. е. в отношении 1:1. Берут навеску 0,1 г исследуемой пробы и растирают в ступке со стеклянным порошком. Для уменьшения кислотности к растертой пробе добавляют на кончике шпателя СаCО₃, после чего приливают 10 мл 3%-ной перекиси водорода и 10 мл 3%-ного раствора иодистого калия в 50%-ном ацетоне. Смесь фильтруют, центрифугируют и фотоколориметрируют на ФЭК-56М, на синем светофильтре с длиной волны 435-445 нм в кювете 10 мм.

Активность каталазы определяют по формуле A=D:0,02 , где A - активность каталазы в пробе; D - оптическая плотность исследуемой пробы; 0,02 - коэффициент перевода в условные единицы каталазы (Е).

П р и м е р 1. Для опыта готовим 3%-ный раствор перекиси водорода, а также смесь йодистого калия с ацетоном, для чего берем 50 мл водного 3%-ного раствора йодистого калия и смешиваем с 50 мл ацетона в отношении 1:1. Затем берем 0,1 г саксаула, добавляем стеклянного порошка и растираем в фарфоровой ступке. Для понижения кислотности на кончике шпателя добавляет СаСО₃ до прекращения выделения пузырьков углекислого газа. После этого к растертой навеске прибавляем 10 мл 3%-ной Н₂О₂ и 10 мл приготовленного раствора йодистого калия в ацетоне. После выпадения осадка смесь фильтруют, центрифугируют при 8000 об/мин в течение 5 мин и фотоколориметрируют на ФЭК-56М (светофильтр синий, длина волны 440 нм). Величина оптической плотности равна 0,69. Подставляя в формулу, получаем:
A=0,69:0,02=34,5 E.

П р и м е р 2. Берем 0,1 г люцерны, растираем ее в фарфоровой ступке с добавлением стеклянного порошка. Затем прибавляем СаСО₃ на кончике шпателя и приливаем 10 мл 3%-ной Н₂О₂ и 10 мл приготовленного раствора йодистого калия в 50%-ном ацетоне, как в примере 1, осаждаем и фильтруем полученную смесь, после чего центрифугируем при 8000 об/мин в течение 5 мин, затем фотоколориметрируем исследуемую пробу на синем светофильтре при 440 нм на кювете 10 мм. Величина оптической плотности равна 0,57.

Подставляя в формулу, получаем:
A=0,57:0,02=28,5 E.

В табл. 1 приведены данные по активности каталазы в картофеле, яблоках, люцерне, саксауле, терескене и полыни, определенные базовым и предлагаемым способами.

Результаты табл. 1 показывают, что величина ошибки лежит в пределах 3-4% в среднем.

В табл. 2 представлены данные о соответствии величины оптической плотности и активности каталазы.

По табл. 2, не проводя математических расчетов, можно определять активность каталазы, зная оптическую плотность раствора. Для картофеля мы получили оптическую плотность 0,6, после расчета получаем 30,1. Если найти в табл. 2 данную оптическую плотность, то ей соответствует активность каталазы, равная 30 Е.

При лабораторных испытаниях способа установлено, что он позволяет упростить определение активности каталазы за счет исключения операции титрования и повысить точность на 5-10%, а также снизить время определения с 1,5 ч до 30 мин, повышая при этом производительность труда в 2-3 раза.

Способ позволяет также сократить затраты на реактивы в 1,5-2 раза.

Формула изобретения

СПОСОБ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АКТИВНОСТИ КАТАЛАЗЫ В БИОЛОГИЧЕСКИХ ОБЪЕКТАХ путем обработки пробы раствором, содержащим иодистый кальций, с последующим анализом, отличающийся тем, что пробу обрабатывают 3%-ной перекисью водорода и смесью ацетона и иодистого калия, взятых в отношении 1:1, измеряют оптическую плотность полученного раствора Д при длине волны 435-445 нм, а активность каталазы А определяют по формуле
А = Д : 0,02,
где 0,02 - коэффициент перевода в условиях единицы активности, Е.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3