Питательная среда для выращивания микроорганизмов и способ получения панкреатического гидролизата казеина

 

Использование: в микробиологической, медицинской, ветеринарной промышленности, в частности при производстве лечебных бакпрепаратов, а также ветеринарных пробиотиков. Сущность изобретения: питательная среда для выращивания бифидумбактерий, лактобактерий и стрептококков содержит источник углерода - лактозу, экстракт пекарских дрожжей, в качестве источника азота - панкреатический гидролизат казеина, цистин, водопроводную воду и дополнительно сернокислые соли марганца и магния и аскорбиновую кислоту при следующем соотношени компонентов, г/л: панкреатический гидролизат казеина 0,14 - 0,16, экстракт пекарских дрожжей 4,5 - 5,5, лактоза 19,0 - 21,0, цистин 0,15 - 0,25, MgSO₄·7H₂O 0,15 - 0,25, MnSO₄·4H₂O 0,04 - 0,06, аскорбиновая кислота 0,4 - 0,6, водопроводная вода до 1. Для получения панкреатического гидролизата казеина готовят раствор казеина, нагревают при 79 - 81°С и величине рН 8,0 - 8,2 в течение 2 ч, охлаждают его и проводят гидролиз панкреатином при 49 - 51°С в течение 2 ч при рН 8,0 - 8,2, подкисляют его до рН 4,0 - 4,5, прогревают до 100°С в течение 5 - 10 мин, охлаждают до 75 - 85°С и подвергают ультрафильтрации на мембране с размерами пор 50 мкм. 2 с.п. ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к микробиологической, медицинской, ветеринарной промышленности и может быть использовано при производстве лечебных бакпрепаратов, а также ветеринарных пробиотиков.

Известна производственная печеночная питательная среда Блаурокка, содержащая печоночный бульон, пептон, лактозу и цистин.

Однако эта среда дорога, состоит из дефицитных компонентов и нестабильна по ростовым свойствам.

Питательная среда на основе панкреатического гидролизата казеина с добавлением витаминов, аминокислот и гидролизата РНК, с источником углерода - лактозой содержит ряд дорогих и дефицитных компонентов, технология ее приготовления довольно трудоемка и длительна, что затрудняет ее промышленное использование.

Наиболее близкой к предлагаемой является среда на основе гидролизата казеина и автолизата дрожжей.

Однако отмечается нестабильность ее ростовых характеристик, выход клеток при выращивании на этой среде не превышает 2-3 млрд/мл. Указанная среда применима только для выращивания бифидумбактерий.

Цель изобретения - расширение технологических возможностей среды и повышение выхода биомассы микроорганизмов.

Для этого питательная среда для выращивания микроорганизмов содержит источник углерода - лактозу, источник витаминов - экстракт пекарских дрожжей, в качестве источника азота - панкреатический гидролизат казеина, цистин и дополнительно соли марганца и магния, аскорбиновую кислоту при следующем соотношении компонентов, г/л: Панкреатический гидролизат казеи- на (N_ам) 0,14-0,16 Экстракт пекарских дрожжей 4,5-5,5 Лактоза 19,0-21,0 Цистин 0,15-0,25 MgSO₄ ˙7H₂O 0,15-0,25 MnSO₄ ˙4H₂O 0,04-0,06 Аскорбиновая кис- лота 0,4-0,6 Водопроводная вода до 1 л Содержание гидролизата казеина, как общепринято, приведено в пересчете на аминный азот.

Известна технология приготовления панкреатического гидролизата казеина.

Однако она довольно трудоемка и длительна - до 2 недель. Отмечается также вариабельность характеристик получаемых гидролизатов. В этой связи актуальным представляется совершенствование технологического процесса приготовления панкреатического гидролизата казеина с высокой воспроизводимостью его основных характеристик и существенным сокращением продолжительности приготовления гидролизата.

Приготовление гидролизата казеина проводят с его предварительным прогревом при 79-81^оС в течение 2 ч. Казеин гидролизуют панкреатином (соотношение казеина и панкреатина 20:1) при 49-51^оС в течение 2 ч при рН 8,0-8,2. Затем подкисленный до рН 4,0-4,5 гидролизат прогревают до 100^оС в течение 5-10 мин и охлажденный до 75-85^оС подвергают ультрафильтрации на мембране с размерами пор 50 мкм. Осветленный фильтрат повторно прогревают до 100^оС, выдерживают 5-10 мин, охлаждают до 85-95^оС и фильтруют, затем вносят хлороформ. Содержание аминного азота должно быть не менее 450 мг.%, а общего - не менее 1500 мг.%, сухой остаток - не менее 18%.

Отличием предлагаемой питательной среды является использование панкреатического гидролизата казеина, приготовленного по оригинальному способу.

П р и м е р 1. Приготовление панкреатического гидролизата казеина (ПГК). Берут 15 кг навески казеина и растворяют в 75 кг питьевой воды. Нагревают до 79^оС и доводят рН до 8,0 40%-ным раствором NaOH при постоянном перемешивании. Смесь выдерживают в течение 2 ч. (постоянно перемешивать) при 79^оС, затем охлаждают до 49^оС. Вносят навеску панкреатина (0,75 кг), разведенную в 2,0 дм воды с температурой 40^оС. Гидролиз ведут в течение 2 ч при температуре 49^оС и рН 8,0 при постоянном перемешивании. После окончания процесса гидролизат подкисляют до рН 4,0 (концентрированной HCl), подогревают до 100^оС, выдерживают 5 мин, охлаждают до 75^оС и фильтруют на ультрафильтрационной установке с размером пор 50 мкм. Осветленный в кислой зоне фильтрат доводят до 100^оС, выдерживают 5 мин, охлаждают до 75^оС и фильтруют через картон. Для хранения ПГК вносят 10 мл/л хлороформа. Хранят при 2^оС до 1 г. Содержание аминного азота должно быть > 450 мг.%, а общего > 1500 мг.% -, сухой остаток - не менее 18%.

Приготовление ростовой питательной среды на основе ПГК.

Готовят среду следующего состава, г/л: Панкреатический гидролизат казеи- на (N_ам) 0,14 Экстракт пекарских дрожжей 4,5 Лактоза 19,0 Цистин 0,15 MgSO₄ ˙7H₂O 0,15 MnSO₄ ˙4H₂O 0,04 Аскорбиновая кис- лота 0,4 Водопроводная вода до 1 л причем каждый компонент стерилизуют раздельно при 110^оС 30 мин, а аскорбиновую кислоту - при 100^оС 5 мин.

Полученную питательную среду используют для выращивания бифидумбактерий (штаммы N 1 ГИСК и БФ - 4 ВГНКИ ВП). Процесс ведут в ферментере. Температура культивирования 37^оС, при рН = 6,8 в течение 15 ч. Посевную дозу дают из расчета 5% от объема среды. Выход клеток обоих изученных штаммов выше, чем на контрольной среде прототипа. Результаты представлены в таблице.

П р и м е р 2. Берут 15 кг навески казеина и растворяют в 75 кг питьевой воды, нагревают до 81^оС и доводят рН до 8,5 40%-ным раствором NaOH при постоянном перемешивании. Смесь выдерживают в течение 2 ч (постоянно перемешивать) при 81^оС, а затем охлаждают до 51^оС. Вносят навеску панкреатина (0,75 кг), разведенную в 2,0 дм воды с температурой 55^оС. Гидролиз ведут в течение 2 ч при температуре 51^оС и рН 8,2 при постоянном перемешивании. После окончания процесса гидролизат подкисляют до рН 4,5 (концентрированной HCl), подогревают до 100^оС, выдерживают 10 мин, охлаждают до 85^оС и фильтруют на ультрафильтрационной установке с размером пор 50 мкм. Осветленный в кислой зоне фильтрат доводят до 100^оС, выдерживают 10 мин, охлаждают до 95^оС и фильтруют через картон. Для хранения ПГК вносят 10 мл/л хлороформ и хранят при 8^оС до 1 г. Содержание аминного азота должно быть > 450 мг.%, а общего > 1500 мг.%, сухой остаток - не менее 18%.

Питательную среду готовят как в примере 1. Полученную среду следующего состава, г/л: Панкреатический гидролизат казеи- на (N_ам) 0,16 Экстракт пекарс- ких дрожжей 5,5 Лактоза 21,0 Цистин 0,25 MgSO₄ ˙7H₂O 0,25 MnSO₄ ˙4H₂O 0,06 Аскорбиновая кислота 0,6 Водопроводная вода до 1 л используют для выращивания Lactobacillus plantarum штамма 8-РА-3 в ферментере при рН = 6,8 и температуре 37^оС в течение 15 ч при аэрации 0,2 объема воздуха на объем среды в минуту и скорости вращения мешалки 200-500 об/мин. Посевную дозу дают из расчета 5% от объема среды. Выход клеток выше, чем на контрольной среде прототипа. Результаты представлены в таблице.

П р и м е р 3. Питательную среду готовят как в примере 1. Полученную среду следующего состава, г/л: Панкреатический гидролизат казеи- на (N_ам) 0,15 Экстракт пекарс- ких дрожжей 5,5 Лактоза 21,0 Цистин 0,25 MgSO₄ ˙7H₂O 0,25 MnSO₄ ˙4H₂O 0,06 рН среды 7,2 Водопроводная вода до 1 л используют для выращивания глубинной культуры Streptocоccus faecium штамм С-74 в ферментере при рН = 6,8 и температуре 37^оС в течение 15 ч при аэрации 0,2 объема воздуха на объем среды в минуту и оборотах мешалки 200-500 об/мин. Посевную дозу вносят из расчета 5% от объема среды. Результаты представлены в таблице.

П р и м е р 4. Питательную среду готовят как в примере 1. Полученную среду следующего состава, г/л: Панкреатический гидролизат казеи- на (N_ам) 0,15 Экстракт пекарс- ких дрожжей 5,5 Лактоза 21,0 Цистин 0,25 MgSO₄ ˙7H₂O 0,25 MnSO₄ ˙4H₂O 0,06 рН среды 7,2 Водопроводная вода до 1 л используют для выращивания глубинной культуры Lactobacillus acidophilus штамм 2585 ВГНКИ ВП в ферментере при рН = 6,6 и температуре 39^оС в течение 1 ч при аэрации 0,2 объема воздуха на объем среды в минуту и оборотах мешалки 200-400 об/мин. Посевную дозу вносят из расчета 5% от объема среды. Результаты представлены в таблице.

Результаты примеров 1- свидетельствуют о том, что предлагаемая питательная среда позволяет повысить выход клеток в 2-3 раза.

П р и м е р 5. Получают питательную среду, в которой в качестве источника азота используют гидролизат казеина, полученный по прототипу. Готовят среду по прописи как в примере 1. Проводят культивирование B. bifidum шт. 1. Выход клеток на среде с использованием гидролизата казеина, приготовленного как в прототипе, составляет 5 млрд/мл, что значительно ниже, чем на предлагаемой питательной среде. Следовательно, для ростовых характеристик среды существенную роль играет гидролизат казеина, полученный по предлагаемому способу.

Таким образом, предлагаемая среда и способ приготовления панкреатического гидролизата казеина позволяют унифицировать технологию получения ряда лечебно-профилактических препаратов, содержащих несколько видов микроорганизмов. Кроме того, предлагаемая среда позволяет повысить выход клеток, а также исключить использование ряда дорогостоящих и дефицитных компонентов - печени, витаминов, аминокислот.

Формула изобретения

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫРАЩИВАНИЯ МИКРООРГАНИЗМОВ И СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПАНКРЕАТИЧЕСКОГО ГИДРОЛИЗАТА КАЗЕИНА.

1. Питательная среда для выращивания микроорганизмов, содержащая источник азота - панкреатический гидролизат козеина, источник углерода - лактозу, источник витаминов - экстракт пекарских дрожжей, цистин и водопроводную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит сернокислые соли марганца и магния и аскорбиновую кислоту при следующем соотношении компонентов, г/л: Панкреатический гидролизат казеина - 0,14 - 0,16 Экстракт пекарских дрожжей - 4,5 - 5,5 Лактоза - 19 - 21 Цистин - 0,15 - 0,25 MgSO₄·7H₂O - 0,15 - 0,25 MnSO₄·4H₂O - 0,04 - 0,06 Аскорбиновая кислота - 0,4 - 0,6
Водопроводная вода, л - До 1
2. Способ получения панкреатического гидролизата казеина, предусматривающий растворение казеина в воде, термическую обработку полученного раствора, охлаждение до температуры гидролиза, внесение панкреатина и гидролиз при заданных температуре и величине pH с последующей его фильтрацией, отличающийся тем, что термическую обработку раствора казеина ведут при 79 - 81^oС и pH 8,0 - 8,2 в течение 2 ч, гидролиз проводят при 49 - 51^oС в течение 2 ч при pH 8,0 - 8,2, полученный гидролизат подкисляют до pH 4,0 -4,5, прогревают до 100^oС в течение 5 - 10 мин, охлаждают до 75 - 85 ^oС и подвергают ультрафильтрации на мембране с размерами пор 50 мкм.

РИСУНКИ

Рисунок 1