Способ анализа хлорофилла фитопланктона в водной среде

 

Использование: при исследовании водных масс водоемов. Способ анализа хлорофила фитопланктона в водной среде включает подачу анализируемой среды в проточную кювету флуориметра, регистрацию интенсивности флуоресценции анализируемой среды, определение поправочного коэффициента, учитывающего загрязнение стенок проточной кюветы. По способу после подачи в кювету среды и измерении ее флуоресценции в кювету подают эталон и измеряют световой сигнал от эталона. Далее подают эталон в чистую кювету и определяют световой сигнал от эталона в чистой кювете. Поправочный коэффициент рассчитывают по величинам указанных световых сигналов. 3 з.п. ф-лы, 1 ил.

Изобретение относится к технике исследования водных масс водоемов и может быть использовано в лимнологии и океанологии при измерении в водной среде концентрации растворенных веществ и взвешенных частиц, а также в любой другой области науки, техники и охраны окружающей среды, где необходимо проводить непрерывный анализ водной среды с использованием флуориметров с проточными кюветами.

С учетом имеющегося опыта эксплуатации флуориметров с проточными кюветами и различных систем прокачки можно утверждать, что налет на стенках кюветы образуется часто не только и не столько за счет ржавеющих частей насоса и системы прокачки. Основной причиной этого является растворенное органическое вещество, присутствующее в водной среде. При этом в очень грязных водах (даже природных) такой налет образуется уже через 0,5-1,0 ч и может существенно влиять на результаты измерений, так как в результате показания падают на 10% и более.

Известен способ определения хлорофилла в водной среде [1], заключающийся в проведении возбуждения флуоресценции водной среды и измерении сигнала интенсивности флуоресценции, по которой проводят определение. Способ не позволяет учитывать загрязнение стенок кюветы флуориметра.

Известен также способ определения хлорофилла фитопланктона в водной среде [2], по которому учитывается загрязнение стенок кюветы. В ходе работ по определению содержания хлорофилла фитопланктона в водной среде было показано, что стенки проточной кюветы флуориметра покрывались налетом, который непрерывно ухудшал ее оптические свойства.

Этот способ имеет следующие недостатки: большая длительность и сложность процесса получения оценки влияния налета на результаты измерения, так как для выполнения необходимых измерений интенсивности флуоресценции требуется от нескольких часов до одного-двух дней; низкая точность учета влияния загрязнения на конечный результат. Дела в том, что между нативной флуоресценцией хлорофилла и его концентрацией нет жесткой однозначной связи; на отношение интенсивность нативной флуоресценции/концентрация хлорофилла влияют многие факторы, в том числе видовой состав, освещенность минеральное питание клеток фитопланктона. Поэтому истинное значение поправочного коэффициента, обусловленного налетом в кювете, может быть сильно искажено указанными факторами; введение одного поправочного коэффициента для группы измерений, тогда как на самом деле происходит непрерывное образование налета и, следовательно, для каждого отдельного измерения необходимо введение своей поправки.

Цель изобретения - повышение точности и сокращение времени учета загрязнений стенок кюветы.

Указанная цель достигается тем, что в способе на основе измерения светового сигнала интенсивности флуоресценции от содержимого кюветы с последующим введением поправочного коэффициента на результат измерения интенсивности флуоресценции исследуемой среды согласно изобретению и в чистую и в загрязненную кюветы помещают эталон, оба раза определяют интенсивность светового сигнала от него для тех же условий облучения и регистрации, что и для исследуемой среды, и поправочный коэффициент определяют на основании полученных данных. В качестве эталона используют или вещество, сходное по спектральным свойствам с исследуемой средой, или дистиллированную воду с одной и той же температурой для обоих измерений, или зеркало с возможностью отражения им света в направлении измерения интенсивности флуоресценции исследуемой среды. При этом, если используют два последних эталона, то кювету облучают первый раз в спектральной полосе, являющейся полосой возбуждения для исследуемой среды, и регистpируют свет в этой полосе, второй раз облучают в спектральной полосе, являющейся полосой регистрации для исследуемой среды, и регистрируют свет в этой же полосе.

Определение поправочного коэффициента на основании результатов измерения интенсивности светового сигнала от эталона обеспечивает по сравнению с прототипом повышение точности учета загрязнений стенок кюветы, так как его можно определять для каждого измерения, что необходимо в связи с непрерывным образованием налета. Для загрязненной кюветы K(t_к)= Φ_этt_к/ Φ _эт(t_o) (2) где К(t_к) - поправочный коэффициент для времени измерения t_к; Φ_эт(t_к) - интенсивность светового сигнала (флуоресценция) от эталона для момента времени измерения t_к; Φ _эт(t_o) - интенсивность светового сигнала в начальный момент измерения t_o от эталона, помещенного в чистую кювету.

Поправочный коэффициент для времени измерения t_o, т.е. К(t_o) соответственно равен единице. При этом значения величины К(t) для измеряемых сигналов при t_o<t определяют путем интерполяции с использованием значений К(t_o) и К(t_к).

При использовании в качестве эталона зеркала или дистиллированной воды K(t_к) = где Φλ ^I ( t_o) , Φλ ^I (t _k) - интенсивность светового сигнала в момент времени t_o или t_к cоответственно ( λI означает, что измерения выполняются в полосе возбуждения флуоресценции анализируемой среды; Φλ ^II ( t_o) , Φλ ^II (t _k) - то же, но для полосы регистрации анализируемой жидкости, что обозначено как λII.

По сравнению с прототипом сокращается также время учета, так как для определения поправочного коэффициента на каждое измерение параметров исследуемой среды необходимо выполнить всего два измерения интенсивности светового сигнала от помещенного в кювету эталона. К тому же учет в соответствии с предлагаемым решением выполняется проще, так как нет необходимости выполнять параллельную серию измерений независимым способом.

На чертеже показана запись сигнала интенсивности флуоресценции хлорофилла фитопланктона, полученная на флуориметре "Квант-4" в рейсе НИС "Профессор Марти" летом 1987 г. (штриховая линия), и истинная кривая, рассчитанная на основе поправочных коэффициентов (сплошная линия), где обозначены по оси абсцисс - время в часах; по оси ординат - интенсивность флуоресценции исследуемой поверхности воды в относительных единицах.

Способ осуществляется следующим образом.

Закончив измерения анализируемой жидкости, проводившиеся за период времени от t_o до t_к, сливают ее из проточной кюветы. Затем в кювету помещают эталонное вещество, сходное по спектральным свойствам с исследуемой средой, жидкое (например, раствор родамина, флуоресцина, тионина) или твердое (раствор родамина в полиметилметакрилате).

Далее определяют интенсивность светового сигнала (интенсивность флуоресценции) эталона для тех же условий облучения и регистрации, что и для исследуемой среды Φ_эт(t_к), здесь t_к - время окончания измерения анализируемой жидкости. Далее кювету тщательно моют, в нее вновь помещают эталон и замеряют Φ_эт(t_o), т.е. интенсивность флуоресценции эталона в чистой кювете, здесь t_o соответствует времени начала измерения анализируемой жидкости. Это может быть и на 1, 2, 24 ч и более ранний момент, чем t_к. Эталон, помещенный в чистую кювету, всегда дает величину Φ_эт(t_o) равную одному и тому же значению, а величина Φ_эт(t_к) каждый раз новая. Так как условия измерения эталона такие же, как и анализируемой жидкости, то, если Φ_эт(t_к) меньше Φ_эт(t_o) на 5-10% и более, то, следовательно, все значения интенсивности флуоресценции анализируемой жидкости, полученные в промежуток от t_o до t_к требуют корректировки, так как это означает, что зарегистрированный сигнал на самом деле был частично ослаблен. Для пересчета его в истинное значение корректируют величину зарегистрированного сигнала интенсивности флуоресценции анализируемой жидкости именно на столько на сколько ее ослабил налет на стенках кюветы: делят полезный сигнал для момента t=t_кна величину коэффициента К(t_к)= Φ _эт(t_к)/ Φ _эт(t_o). Для t=t_oK(t_o)=1, так как кювета была чистая. Промежуточные значения полезного сигнала для момента t_o<t делят на значения К(t), полученные интерполяцией К(t) с учетом хода зависимости К от t и значений К(t_o) и К(t_к). Вследствие того, что обычно результаты измерений заносят на магнитный носитель, введение такой поправки не представляет большой трудности. С учетом того, что при этом и первичный (по возбуждению) и вторичный (по регистрации) светофильтры при измерениях эталона такие же, как и при измерениях анализируемой жидкости, такая поправка учитывает как ослабление возбуждающего света в соответствующем диапазоне с длиной волны максимума интенсивности или характерной длиной волны λ I, так и ослабление интенсивности света флуоресценции, проходящего через другую стенку кюветы и ослабляющегося на другую величину, так как излучение флуоресценции регистрируют в другом спектральном участке, определяемом светофильтрами регистрации и имеющем другую длину волны максимума интенсивности или характерную длину волны, обозначаемую λII.

Способ можно осуществлять также при следующей очередности операций: до начала измерений параметров исследуемой среды в чистую кювету помещают эталон и измеряют Φ_эт(t_о). Далее выполняют исследования и по их окончании помещают эталон в загрязненную кювету без исследуемой жидкости, после чего измеряют Φ _эт(t_к).

В качестве эталона для достижения цели изобретения используют также зеркало, которое отражает луч, падающий в кювету, под углом, равным углу измерения интенсивности флуоресценции. При этом измеряют интенсивность света Φ _зер(t), отраженного от зеркала последовательно при двух условиях. Один раз при условии облучения кюветы с зеркалом светом в спектральной полосе, являющейся полосой возбуждения при рабочих флуориметрических измерениях (с длиной волны максимума интенсивности или характерной длиной волны λI) и регистрации отраженного света в той же полосе, и сразу второй раз, когда спектральные полосы по каналам возбуждения и регистрации устанавливаются равными полос регистрации (с длиной волны максимума интенсивности или характерной длиной волны λII) при рабочих флуориметрических измерениях, для которых выполняется указанный учет. При этом поправочный коэффициент К(t) для t=t_квычисляется как K(t_к) = а для t=t_o он также равен 1.

В качестве эталона можно использовать также чистую анализируемую жидкость (не содержащую исследуемой примеси и какой-либо взвеси). Для морской воды это может быть обычная дистиллированная вода.

Поправочный коэффициент при этом определяют той же формулой, но вместо интенсивности отраженного зеркалом светового сигнала Φ_зерλ ^I (t) и Φ_зерλ ^II , используют интенсивность упругого рассеяния света Φ_расλ ^I (t) и Φ_расλ ^II , которые подставляют в аналогичную формулу K(t_к) = , алгоритм использования К(t) прежний.

Для последнего случая следует отметить, что упругое рассеяние прямо пропорционально температуре жидкости, поэтому при подобных измерениях температура жидкости в моменты времени t_o и t_к при измерении поправочного коэффициента К(t) по упругому рассеянию света должна быть одинаковой или различаться незначительно.

В ходе рейса НИС "Профессор Марти" летом 1987 г. определения поправочного коэффициента были сделаны на основе измерений интенсивности упругого рассеяния света для дистиллированной воды, наливаемой в загрязненную кювету. Измерения выполнялись на флуориметре "Квант-4" производства Барнаульского ОКБА НПО "Химавтоматика" с использованием штатной системы прокачки судна.

Интенсивность флуоресценции хлорофилла фитопланктона измерялась при возбуждении через светофильтры СЗС-22 плюс СС-5; регистрировалась через светофильтр КС-15. Для оценки поправочного коэффициента по упругому рассеянию в синей области (в полосе возбуждения) дополнительно использовался нейтральный светофильтр НС-11, в красной области (полосе регистрации) - нейтральный светофильтр НС-13. Флуориметр с системой прокачки работал непрерывно в течение 5 дн. Измерения поправочного коэффициента проводились ежедневно. Для красной области спектра (полоса регистрации λ II) его значения остались практически неизменными и равными 1 в течение всех 5 дн. Для синей области (полосы возбуждения λ I) были получены следующие значения интенсивности упругого рассеяния и поправочные коэффициенты
Φ_расλ ^I (t_o)=133 K(t_o)=1
Φ^λI_рас(t₁) = 77 K (t₁) = = 0,76
Φ_расλ ^I (t₂)=53 K(t₂)=0,63
Φ_расλ ^I (t₃)=40 K(t₃)=0,55
Φ_расλ ^I (t₄)=33 K(t₄)=0,48
В течение всего 5- дневного измерения кювета не мылась. Анализ полученных данных показал, что в данное время в этом районе проточную кювету нужно либо обязательно мыть через каждые 8 ч (только в этом случае поправка составляет менее 10% и ее можно не учитывать), либо необходимо вводить соответствующую поправку.

Предлагаемый способ более точен по сравнению с прототипом, так как позволяет определять поправочные коэффициенты для каждого измерения с учетом постоянно образующегося налета.

Формула изобретения

1. СПОСОБ АНАЛИЗА ХЛОРОФИЛЛА ФИТОПЛАНКТОНА В ВОДНОЙ СРЕДЕ, включающий подачу анализируемой среды в проточную кювету флуориметра, облучение кюветы светом в полосе возбуждения анализируемой среды, измерение интенсивности флуоресценции среды, определение поправочного коэффициента, учитывающего загрязнение стенок проточной кюветы, определение содержания хлорофилла фитопланктона по величине интенсивности флуоресценции, скорректированной с учетом поправочного коэффициента, отличающийся тем, что, с целью повышения точности анализа путем определения поправочного коэффициента с учетом меняющегося во времени загрязнения стенок кюветы и сокращения времени анализа, измеряют интенсивность флуоресценции среды Ф(t_к) в фиксированный момент времени t_к после подачи среды в кювету, затем подают в кювету эталон, сходный по спектральным свойствам с анализируемой средой и не содержащий хлорофилла фитопланктона и взвешенных примесей, сохраняя условия возбуждения и регистрации светового сигнала, в момент времени t_к, облучают светом и измеряют интенсивность светового сигнала от эталона в загрязненной кювете Ф_этt_к, после этого подают эталон в незагрязненную кювету, облучают ее и измеряют интенсивность светового сигнала от эталона в чистой кювете Ф_эт при тех же спектральных условиях, для момента времени t_к рассчитывают поправочный коэффициент K(t_к) = Ф_эт (t_к) / Ф_эт и определяют скорректированное значение интенсивности флуоресценции анализируемой пробы
Ф'(t_к) = Ф(t_к) / Ф' (t_к).

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что в проточную кювету помещают зеркало для отражения света в направлении измерения интенсивности флуоресценции анализируемой среды.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что в качестве эталона используют дистиллированную воду с одной и той же температурой при регистрации Ф_эт(t_к) и Ф_эт соответственно.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что при облучении кюветы с эталоном проводят регистрацию светового сигнала от эталона в спектральной области возбуждения среды, а при измерении сигнала от эталона облучение проводят светом с длиной волны из области регистрации флуоресценции среды.

РИСУНКИ

Рисунок 1