Штамм бактерий corynebacterium pseudotubeculosis, используемый в качестве референтного и для изготовления диагностических препаратов при казеозном лимфадените овец

 

Использование: биотехнология, микробиология, диагностические препараты, казеозный лимфаденит овец. Сущность изобретения: получение штамма C. pseudotuberculosis ВГНКИ N 70 R - ДЕП для ускорения идентификации возбудителя казеозного лимфаденита при бактериологической, аллергической и серологической диагностике инфекции у овец. Молекулярные характеристики ДНК штамма: спектральная характеристика А 260/280 - 2,0, А 260/230 - 2,4, концентрация - 1400 мкг/мл, температура плавления - 83,3^oС величина содержания Г + Ц - 71,8 мол.%. По гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК среди штаммов этого вида отнесен к группе I. При постановке диагноза на заболевание овцам внутрикожно в одну из подхвостовых складок вводат аллерген, приготовленный из данного штамма. Через 24 ч проводят учет реакции. Если животное больное, у него появляется воспалительная реакция в месте введения диагностикума. У здоровых животных воспаления в месте введения препарата не наблюдают. Данным методом в неблагополучных по казеозному лимфадениту овец хозяйствах удается дополнительно выявлять до 80% инфицированных животных, по сравнению с общеизвестным методом диагностики (пальпацией поверхностных лимфатических узлов).

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, эпизотологии и может быть использовано в практике бактериологических лабораторий.

Целью изобретения является изыскания штамма бактерий, легко и быстро размножающегося на естественных и искусственных питательных средах и продуцирующего токсин.

Штаммы Corynebacterium pseudotuberсulosis в отечественных коллекциях отсутствуют, хотя были выделены и изучились многими исследователями, но применения им не нашли [1, 4] В зарубежной литературе имеются сведения о штаммах С. pseudotuberсulosis выделенных Carne H.R. Onon E.O. Actipn of Cor. ovis exotoxin on ondotelial calls of blod vessels // Nature (London). 1978, 271, p. 246-248. Cassamagnaghi A. The Diagnosis of coseous Lymphadenitis in sheep buthe Intradermal heaction to Preiznocardin // Bull. Acod. Vet. de France. 1931, 4, p. 328. Cameron C. M. Buchan L. Identification of protective od toxic Antigens of Corynebacterium pseudotuberculosis // Onderstepord I. Vet. Res. 1966, 33, p. 39-48.

Из них были приготовлены аллерген "Прейснокордин" и вакцины, но из-за высокой специфичности и иммуногенности они не были использованы.

В отечественных коллекциях микроорганизмов данный возбудитель инфекции C preudotuberculosis отсутствует. В специальной отечественной и зарубежной литературе имеются сведения об этом виде микроорганизма, которые указывают на огромную вариабильность его свойств. В этой связи достаточно наглядным примером может служить определитель микробов Берги, где из указанных пяти свойств четыре не постоянны [3] Согласно, тому же определителю микробов, содержания Г + Ц в ДНК данного вида 67,5 мол. а для патогенных микроорганизмов рода коринебактерий от 57 до 60 мол.

Штамм получен 06.11.85 из гнойного содержимого поверхностного шейного лимфатического узла барана, принадлежавшего совхозу "Екатеринославский" Щербакульского района Омской области.

Морфологические признаки. Штамм обладает выраженным полиморфизом. В мазках из культур микроорганизм присутствует в виде мелких кокков, овоидов, коротких толстых палочек с закругленными концами. Размер клеток в длину в среднем составляет 0,865 ± 0,03, а толщина 0,488 ± 0,02 ммк.

В мазках из молодых культур клетки часто располагаются под углом друг к другу, что свидетельствует о разламывающимся типе деления.

Культуральные, физиолого-биохимические признаки. На кровяном теллуритовом агаре штамм микроорганизмов восстанавливают металлический теллур в результате колонии приобретают черный цвет, матовые, хрупкие, сдвигаются на поверхности среды.

На МПА колонии R-формы серо-белого цвета (при добавлении к среде сыворотки крови с высоким содержанием каротина приобретают желтый цвет), круглые, с неровными краями, с матовой шероховатой поверхностью, хрупкие сдвигаются по поверхности среды.

В старых культурах колонии приобретают радиальную и концентрическую исчерченность с приподнятым в виде купола центром.

На МПБ растет в виде серо-белой, тонкой, ломкой, пленки. На дне образует зернистый осадок, увеличивающийся за счет обламавшейся и осевшей пленки.

Максимальный рост на питательных средах отмечается на 2-3 сутки, культивирования при 37^оС в аэробных условиях.

При росте на МПБ штамм микроорганизмов продуцирует экзотоксин, обладающий сильными летальными и гемолитическими свойствами. При культивировании на МПБ с коэффициентом аэрации 0,96 и температуре 37^оС на 3-4 сутки снижается рН среды на 0,76-1,0, это совпадает с максимальным накоплением экзотоксина в среде, 1 мл которой при внутрибрюшинном введении вызывает гибель морской свинки через 8-10 дней, а у кролика гиперчувствительность кожи, в разведении центрифугата среды в соотношении 1 4.

Штамм содержит каталазу, не содержит уреазу и желатиназу, редуцирует нитраты в нитриты, ферментирует глюкозу.

При внутрибрюшинном заражении морских свинок в дозе 10 МЕМ / мл вызывает поражение внутренних органов: гемморагические очаги в легких, некротические узелки на печени и селезенке, орхит.

У восприимчивых животных овец (при подкожном заражении) в области шей в дозе 125 млн микробных тел через 4 месяца на убое можно обнаружить специфические-некротические очаги (с зеленовато-желтым, сметанообразным содержимым, без запаха) в регионарных месту заражения лимфатических узлах, легких, печени и подкожной клетчатке.

Дополнительные сведения о штамме. Микробные клетки по грамму окрашиваются положительно, однако, окраска концов более интенсивна, чем средняя ее часть.

Молекулярные характеристики штамма. 1. Спектральная характеристика А 260 / 280 2,0 А 260 / 230 2,4 2. Концентрация 1400 мкг/мл 3. Температура плавления /Т. пл./ 83,3^оС 4. Величина содержания Г + Ц 71,8 мол.

Особенностью штамма является сложность выделения нуклеиновых кислот из ДНК.

При изучении гомологий нуклеотидных последовательностей ДНК нескольких десятков штаммов C. pseudotuberculosis выделенных от больных овец Омской области, штамм N 70 отнесен к группе I [1] Многократные пассажи на исскуственных питательных средах штамма N 70 приводит к трансформации его в S-форму, однако это не влияет на характеристики ДНК.

Штамм относительно слабо устойчив к повышенным температурам при 55^оС сохраняет жизнеспособность в течение 10 мин, при 60^оС 0,5 мин с биологической защитой в виде 20% сыворотки крови выдерживает 55^оС в течение 15 мин, 60^оС 2-3 мин.

Штамм не чувствителен in vitro к полимиксину, однако на него губительно действуют: бензилпенициллин, метициллин, канамицин, стрептомицин, тетрациклин, эритромицин, гентамицин, оксациллин, ристомицин, карбенициллин, олеандомицин, мономицин, неомицин, ампициллин, левомицетин.

В виду наличия у предлагаемого штамма ряда отличительных свойств, от описанных в зарубежной литературе аналогов, таких как: свойства R-формы, высокое содержание Г + Ц в ДНК 71,8 мол. отношение к определенной (I) группе микроорганизмов данного вида по гомологии нуклеотидных последовательностей ДНК, он может быть использован в качестве референс-штамма.

Кроме того, штамм 70, может быть использован для приготовления диагностикумов (антигенов и аллергенов).

Штамму присвоен регистрационный номер Corunebacterium pseudotuberculosis 70 R-ДЕП в коллекции микроорганизмов лаборатории контроля и стандартизации препаратов против туберкулеза, псевдо- и паратуберкулеза ВГНКИ вет-препаратов (123022, г. Москва, Звенигородское шоссе, 5), где он находится на хранении.

Формула изобретения

Штамп бактерий Corynebacterium pseudotubeculosis ВГНКИ N 70R-ДЕП, используемый в качестве референтного и для изготовления диагностических препаратов при казеозном лимфадените овец.