Штамм paramyxovirus, используемый для изготовления вакцины против ньюкастлской болезни кур

 

Использование: ветеринарная вирусология, в частности новый штамм вируса. Сущность изобретения: штамм вируса ньюкастлской болезни кур депонирован в коллекции вирусов и микроорганизмов ВГНКИ ветеринарных препаратов под N ГАМ-61. Вакцина, изготовленная из штамма Paramyxovirus ГАМ-61 ВГНКИ, безвредна для цыплят 1 - 60-ти дневного возраста. Сохранность среди цыплят яичных пород после ее применения составляет в среднем 99,3%, а среди цыплят-бройлеров - 83,0%. Средний геометрический титр антител в сыворотках крови у данных категорий птицы составляет соответственно . Вакцину, содержащую антиген из штамма Paramyxovirus ГАМ-61 ВГНКИ, используют с профилактической целью против ньюкастлской болезни однократно интраназально, энтерально, внутримышечно или аэрозольно в эффективных дозах. 8 табл.

Изобретение относится к ветеринарной вирусологии, в частности к новому штамму Paramixovirus ГАМ-61 ВГНКИ, используемого для изготовления вакцины против ньюкаслской болезни кур.

Для профилактики и ликвидации ньюкаслской болезни кур (НБ) используют ряд биопрепаратов на основе лентогенных и мезогенных штаммов парамиксовируса I серогруппы. Для лентогенных штаммов этой серогруппы: "В₁", "F", "Ла Сота", "Бор-74 ВГНКИ" характерно содержание крупных и нитевидных форм вирусных частиц. Штаммы обладают выраженными гемагглютинирующими свойствами с предельными титрами 1: 512, вызывают образование мелко и среднезернистой реакции гемагглютинации. Предельные инфекционные титры 10^8,0-10^9,0 ЭИД_50/см3.

Вакцины, полученные из этих штаммов, иммуногенны, не реактогенны для цыплят, применяются как индивидуальным, так и групповым методами: с водой и аэрозольно. Однако они имеют ряд существенных недостатков: формируют невосприимчивость не ранее, чем через 2-3 недели после иммунизации; непродолжительный срок иммунитета 3-5 мес. применяют только для профилактики НБ в неблагополучных и угрожаемых хозяйствах.

Мезогенным штаммам парамиксовируса 1 серогруппы, таким как "В" ("Роакин"), "МК-107", "Комаров", "Н" и др. присущи основные свойства лентогенных штаммов, но обладают некоторой остаточной вирулентностью: индекс внутримозговой патогенности (ИВМП) находится в пределах 0,50-1,8 0; а величина среднего времени гибели РЭК, вызванная минимальной летальной дозой 72-90 ч.

Вакцины, изготовленные из мезогенных штаммов, высокоиммуногенны, создают невосприимчивость через 48 ч и защищают птицу от заболевания в течение одного года, обрывая начавшуюся эпизоотию. Но в то же время они обладают реактогенностью для цыплят моложе 2-х месячного возраста, вызывая их переболевание с признаками НБ и значительную гибель.

Целью изобретения является получения нового штамма вируса ньюкаслской болезни, обладающего меньшей реактогенностью и высокой иммуногенностью и предназначенного для изготовления вакцины против ньюкаслской болезни.

Штамм вируса ньюкаслской болезни получен из эпизоотического, выделенного в 1968 году от больной птицы путем перемежающихся последовательных пассажей на гетерогенной культуре клеток почки теленка и куриных эмбрионов с идентификацией в РТГА и РН со специфическими сыворотками против эталонных вакцинных штаммов вирусов НБ, селекцией вариантов по признакам безвредности для цыплят 1-60 суточного возраста, иммуногенности при различных методах аппликации и интенсивности его репродукции в чувствительной системе (куриные эмбрионы).

Штамм вируса ньюкаслской болезни депонирован в коллекции Всероссийского Государственного научно-исследовательского института контроля, стандартизации и сертификации ветеринарных препаратов и имеет регистрационный N ГАМ-61.

Штамм Paramyxovirus ГАМ-61 ВГНКИ характеризуется следующими признаками и свойствами.

Морфологические признаки.

При электронноскопическом исследовании штамм "ГАМ-61 ВГНКИ" представлен типичным для парамиксовирусов сферическими и полиморфными скоплениями вирионов округло-овальной формы с пепломерами по всей поверхности мембраны и отдельными частицами филаментозной, округлой и неправильной формы. Матрикс вириона средней электронной плотности, зернистой структуры. Физический титр частиц не превышает 7,6-8,0 мкг/см³.

Культуральные признаки.

Штамм "ГАМ-61 ВГНКИ" хорошо размножается в 9-10 дневных куриных эмбрионах, зараженных в аллантоисную полость дозой вируса 10^5,0 Э Л Д_{50/0,1 см}3. При этом биологическая активность через 72-96 ч, инкубации при 37^оС достигает значения 10^9,0 -10^9,25 Э Л Д_50/см3.

В первичных и перевиваемых культурах клеток (ПТ-80, ФЭК, ФЭУ) штамм цитопатического действия не вызывает.

Вирулентные и антигенные свойства.

Штамм "ГАМ-61 ВГНКИ" при интрацеребральном введении суточным цыплятам в дозе 0,05х 10^8,0 Э Л Д_50/см3 вызывает их клиническое переболевание и гибель в течение 5-7 дней. Внутривенное введение вируса в дозе 10⁸ Э Л Д_50/см3 приводит только к переболеванию НБ 40-дневных цыплят в течение 5-10 дней.

Индекс внутримозговой патогенности (ИВМП) 1,5.

Индекс внутривенной патогенности (ИВВП) меньше 1,0.

Величина среднего времени гибели, вызванная минимальной летальной дозой (СВГ/МЛД) 72-90 ч.

Антигенные свойства.

Штамм "ГАМ/61 ВГНКИ" антигенно родственен парамиксовирусу первой антигенной подгруппы (ПМВ-1).

При введении в организм птиц вызывает формирование клеточного и гуморального иммунитета. Вируснейтрализующие и антигемагглютинирующие антитела накапливаются в титрах 3,0-8,0 лог₂. Клеточный иммунитет, оцениваемый по уровню Т-лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования, формируется к окончанию 1 недели после вакцинации на фоне низкого уровня антигемагглютининов. Цыплята, однократно привитые вакциной из штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" интраназально, перорально, внутримышечно, аэрозольно через 48-72 ч и через 14 дней были иммунны в 100% случаев.

Иммуногенность.

Абсолютная невосприимчивость вакцинированной птицы при интраназальном методе введения в дозе 10^5,0 Э Л Д₅₀, при энтеральном 10^6,0 Э Л Д₅₀, при внутримышечном 10^6,0 Э Л Д₅₀, при аэрозольном 800 Э Л Д₅₀ для цыплят; 1600 Э Л Д₅₀ для взрослой птицы.

Серологические свойства.

Штамм "ГАМ-61 ВГНКИ" вируса НБ обладает способностью агглютинировать эритроциты птиц и животных, гемагглютинирующий титр 1:512. Реакция гемагглютинации мелкозернистая, элюция вируса через 10-15 мин.

Тропизм.

Выраженным тропизмом штамм не обладает, хотя имеет тенденцию к преимущественному размножению в клетках головного мозга и селезенке, накапливаясь в титрах 4,25-7,55 lg Э Л Д_50/см3. Длительный период обнаружения вируса в трахее и помете свидетельствует об аэрогенном и алиментарном путях распространения штамма.

Безвредность.

Штамм "ГАМ-61 ВГНКИ" вируса НБ безвреден для цыплят всех возрастных групп при энтеральном и парентеральном введении в 10-100 кратной профилактической дозе, не способен к реверсии, не вызывает заболевания и гибели кроликов, белых мышей, морских свинок и белых крыс.

П р и м е р 1. Вирулентность штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" определяют по индексам патогенности для восприимчивых цыплят при внутримозговой и внутривенной инокуляции вируса и тесту эмбриональной чувствительности.

Индекс внутримозговой патогенности штамма (ИВМП) определяют на двух группах суточных СПФ-цыплятах, которым вводят культуры вакцинных штаммов "ГАМ-61 ВГНКИ" и "Н". Вирусы в дозе 10^8,0 Э Л Д_{50/0,05 см}3 инъецируют в правое полушарие головного мозга. Группе контрольных цыплят в том же объеме (0,05 см³) интрацеребрально вводят физиологический раствор. Срок наблюдения 8 дней. В результате у цыплят, зараженных культурой штамма "Н", на вторые сутки отмечают угнетение, затрудненное дыхание с открытым клювом, дрожание головы и гибель через 48-72 ч.

У цыплят, инфицированных штаммом "ГАМ-61 ВГНКИ", проявление аналогичных клинических признаков заболевания наступает на 4-е сутки и гибель через 5-7 дней. При вскрытии у павшей птицы обнаруживают признаки энтерита, гастрита, кровоизлияний в бифуркации и на границе между мышечным и железистым желудком.

Индекс внутримозговой патогенности рассчитывают по методу Хансона. Расчетный ИВМП для шт. "ГАМ-61 ВГНКИ" и контрольного шт. "Н" составляют соответственно 1,5 и 1,8, что свидетельствует с принадлежности штаммов к группе мезогенных вирусов.

П р и м е р 2. Индекс внутривенной патогенности (ИВВП) определяют на 40-дн. цыплятах, полученных из хозяйств, где птица не вакцинируется против НБ. Культуру штамма вируса "ГАМ-61 ВГНКИ" вводят в правую подкрыльцовую вену в дозе 10^8,0 Э Л Д_{50/0,1 см}3. Контролем служат две группы цыплят-аналогов, которым внутривенно вводят физиологический раствор и культуру штамма вируса НБ "Н" в дозе 10^8,0 Э Л Д_{50/0,1 см}3.

Устанавливают: у цыплят, зараженных культурой штамма "Н", признаки заболевания проявляются через 48 ч и отмечают на протяжении 5-ти суток гибель 40% птицы. У цыплят, инфицированных шт. "ГАМ-61 ВГНКИ", признаки заболевания проявляются лишь на 5-е сутки и переболевание продолжается в течение 8 суток (срок наблюдения).

Индекс внутривенной патогенности: (ИВВП), рассчитанный по методу Хансона для "ГАМ-61 ВГНКИ" и "Н" составил соответственно < 1 и > 1.

Таким образом: штамм вируса "ГАМ-61 ВГНКИ" по данному критерию в большей степени соответствует группе лентогенных вирусов.

П р и м е р 3. Определяют вирулентность штамма вируса "ГАМ-61 ВГНКИ" в тесте эмбриональной чувствительности по среднему времени гибели РЭК, вызванной минимальной летальной дозой вируса (СВГ/МЛД).

Для этого готовят серию 10-ти кратных разведений исследуемого вируса (10^-1-10^-10), пять из них (10^-1, 10^-7, 10^-8, 10^-9, 10^-10) используют для заражения 10-ти дневных куриных эмбрионов (КЭ) в аллантоисную полость в объеме 0,1 см³. Наблюдение проводят 2 раза в день через 8 ч в течение 120 ч. Регистрируют, а затем суммируют величину времени гибели эмбрионов от минимальной дозы, находят ее среднюю величину делением на количество погибших эмбрионов. Величина СВГ/МЛД 72-90 ч для данного штамма соответствует параметрам вирусов мезогенной группы.

П р и м е р 4. Антигенную активность штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" изучают в лабораторных опытах по уровню формирования гуморального иммунитета, т.е. по способности штамма индуцировать образование специфических антигемагглютининов.

60 голов 30-ти дневных цыплят иммунизируют внутримышечно, энтерально культурой вируса в дозе 10^7,0 ЭЛД₅₀ в объеме 0,2; 0,5 см³ соответственно. До постановки опыта (для определения материнского иммунитета) и на 7, 14, 21 сутки после прививки от 10 голов каждой группы птиц, иммунизированных определенным методом, получают сыворотки крови и исследуют в РТГА с 0,7%-ным раствором эритроцитов петуха, определяя уровень специфических антител к вирусу НБ.

Контролем служат 60 голов цыплят того же возраста, вакцинированные культурой штамма "Н" в тех же дозах.

Динамика образования антигемагглютининов, индицируемых штаммами "Н" и "ГАМ-61 ВГНКИ", представлена в табл. 1.

Из табл. 1 видно, что оба штамма, использованные для иммунизации цыплят, при внутримышечном и энтеральных методах введения обеспечивают образование высокого уровня антител, но при иммунизации культурой штамма "Н" у цыплят отмечают сильную поствакцинальную реакцию: отказ от корма, сильное отставание в росте и развитии. Применение же штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" поствакцинальных осложнений не вызывает.

Для подтверждения надежности иммунитета, создаваемого штаммами "Н" и "ГАМ-61 ВГНКИ" птицу, прошедшую серотест, подвергают контрольному заражению высоковирулентным штаммом "Т-53" вируса ньюкаслской болезни в дозе 1000 Л Д_{50/0,2 см}3 на 7, 14 и 21 сутки.

Результаты контрольного заражения представлены в табл. 2.

Из табл. 2 следует, что иммунизация цыплят 30-дневного возраста культурой штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" обеспечивает, по сравнению с аналогичным применением культуры штамма "Н", наиболее высокую степень защиты поголовья при его контрольном заражении вирулентным штаммом "Т-53" (выживаемость 93,3-100%).

П р и м е р 5. Изучают антигенную активность штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" в лабораторных условиях по уровню формирования клеточного и гуморального иммунитета при интраназальной иммунизации.

Для этого цыплятам 30-дневного возраста опытной группы интраназально вводят культуру штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" в дозе 10^7,0 ЭЛД₅₀ в объеме 0,1 см³. Контрольную группу не прививают. Титр материнских антител 2,0-2,4 лог₂.

На 7, 14, 21 сутки от 10 цыплят опытной и контрольной групп берут кровь для параллельного определения: в крови уровня Т- лимфоцитов в реакции спонтанного розеткообразования, а в сыворотке крови уровня специфических антител в реакции торможения гемагглютинации.

Одновременно со взятием крови птицу заражают высоковирулентным штаммом "Т-53" для подтверждения надежности создаваемого иммунитета.

Динамика формирования гуморального и клеточного иммунитета у цыплят, привитых штаммом "ГАМ-61 ВГНКИ", представлена в табл. 3.

Данные табл. 3 показывают, что при интраназальном методе иммунизации культурой штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" у птицы на 7 сутки формируется недостаточно напряженный гуморальный иммунитет, что компенсируется в эти сроки выработкой необходимого количества ответственных за клеточный иммунитет Т-лимфоцитов, способствующих высокой степени защиты поголовья к контрольному заражению вирулентным штаммом "Т-53" вируса НБ.

П р и м е р 6. Иммуногенность вакцинного штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" оценивают на 180 цыплятах 15-17 дневного возраста, которых прививают различными способами с последующим их инфицированием через 14 дней культурой высоковирулентного штамма "Т-53" ВНБ в дозе 10^3,0 Э Л Д_50/0,2 Контрольных цыплят не прививают.

Результаты проверки иммунногенности штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" представлены в табл. 4.

Как видно из табл. 4, все опытные цыплята, вакцинированные вирусом "ГАМ-61 ВГНКИ" различными методами, после контрольного заражения оказались абсолютно устойчивыми при 100% гибели контрольных, что свидетельствует о высокой иммуногенности штамма.

П р и м е р 7. В острых камеральных и производственных опытах на 25-дневных цыплятах и взрослых курах определяют эффективную иммунизирующую дозу штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" вируса НБ.

Серийными разведениями штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" в дозах 10^7,0 10^1,0 ЭЛД₅₀ прививают интраназально, перорально, внутримышечно, а аэрозольно в дозах от 400 до 1600 ЭЛД₅₀ группы подопытных птиц и через 14 дней заражают вирулентным штаммом вируса НБ "Т-53" в дозе 1000 Л Д_{50/0,2 см}3.

Результаты опытов представлены в табл. 5.

Из табл. 5 видно, что использование вируссодержащей жидкости из штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" вызывает невосприимчивость у 100% вакцинированной птицы при интраназальном методе введения в дозе 10^5,0 Э Л Д_{50/0,1 см}3. при энтеральном 10^6,0 Э Л Д_{50/10,0 см}3 при внутримышечном 10^6,0 Э Л Д_{50/0,5 см}3 при аэрозольном 800 ЭЛД₅₀ для цыплят 1600 ЭЛД₅₀ для взрослой птицы.

П р и м е р 8. Изучают репродуктивную способность штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" в организме птицы на СПФ-цыплятах 30-дневного возраста, которых прививают внутримышечно культурой штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" в дозе 0,2х10^7,0 Э Л Д_50/см3. Через 3, 5, 7, 10, 30 дней от 10-ти цыплят отбирают пробы для вирусологических исследований и определяют в них наличие вируса методом титрования на КЭ.

Динамика выделения вакцинного штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" вируса НБ из внутренних органов привитых цыплят представлена в табл. 6.

Как видно из табл. 6, вирус реизолируется из всех исследуемых материалов с 3 по 9 день после заражения. Через 7 дней после иммунизации интенсивность репродукции штамма достигает максимума (суммарная инфекционная активность выделенного вируса 19,4 лог.). Подавляющее его количество находят в головном мозге (7,65 лог), что свидетельствует о проявлении признаков нейтротропности, характерной для представителей велогенной группы ньюкаслских вирусов.

Данные табл. также показывают, что распространение вакцинного вируса среди восприимчивого поголовья может осуществляться как воздушно-капельным, так и фекально-оральным путем.

П р и м е р 9. Изучают способность штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" сохранять исходную степень аттенуации на 10 суточных СПФ цыплятах, путем последовательных 10-кратных пассажей вируссодержащего материала. Аллантоисную жидкость, содержащую культуру штамма "ГАМ-61 ВГНКИ", вводят цыплятам внутримышечно в дозе 10^7,0 Э Л Д_50/0,2 Через 7 дней цыплят убивают, отбирают пробы головного мозга, готовят 10% суспензию, в которой определяют количество вируса методом титрования на КЭ и используют для инфицирования следующей партии цыплят.

Результаты изучения реверсибельности штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" представлены в табл. 7.

Как видно из табл. 7 многократное пассирование штамма на чувствительной биологической модели свидетельствует с его высокой стабильности и неспособности к реверсии в вирулентную форму.

П р и м е р 10. Вакцину готовят следующим образом: хорошо развитые 9-дневные эмбрионы кур заражают культурой штамма вируса "ГАМ-61 ВГНКИ" в аллантоисную полость в дозе 10⁴-10⁵ Э Л Д_{50/0,1 см}3. Павшие эмбрионы после 72-96 ч инкубации в течение 4 ч охлаждают при 4^оС, а затем выдерживают при комнатной темпеpатуре в течение 2-3 ч до испарения конденсата. В условиях асептики эмбрионы вскрывают, собирают экстраэмбриональную жидкость с последующим ее контролем на стерильность, биологическую активность вируса. Экстраэмбриональную жидкость штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" с биологической активностью не ниже 10^8,5 ЭЛД₅₀ смешивают с защитной средой из расчета 1-1-2, добавляют антибиотики, преимущественно пенициллин и стрептомицин по 100-200 ЕД/см³ и шуттелируют в течение 10-15 мин.

После шуттелирования вируссодержащую вакцинную суспензию разливают в стерильные ампулы по 1; 2 см³ или во флаконы по 3 см³. Ампулы и флаконы с препаратом немедленно закрывают двухслойной марлевой салфеткой или стерильно гигроскопической ватой, которые промораживают в низкотемпературных аппаратах при температуре 40-50^оС в течение 6-10 ч. Быстро загружают замороженную вакцину в стерильные вакуум-камеры, где ее лиофильно высушивают до достижения влажности 2-3% По окончании лиофилизации в асептических условиях проводят запайку ампул и закатку флаконов колпачками с последующим контролем всех изготовленных серий вакцины на стерильность, безвредность, иммуногенность, остаточную влажность.

Готовая вакцина представляет собой сухую мелко-пористую массу серо-желтого цвета в виде таблетки, не рассыпающейся при встряхивании. Биологическая активность не ниже 10^8,0 Э Л Д_{50/0,1 см}3.

П р и м е р 11. Вакцину, содержащую в основе экстраэмбриональную жидкость из штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" с биологической активностью 10^8,0 Э Л Д_{50/ см}3, приготовленную по примеру 9, вводят в организм подопытных групп цыплят 15-25 дн. возраста с профилактической целью против ньюкаслской болезни однократно интраназально, энтерально, внутримышечно и аэрозольно в эффективных дозах. Сроки ревакцинации определяют по показаниям РТГА.

Эффективность каждой вакцинации контролируют через 7 дней серологическими исследованиями сыворотки крови в РТГА и путем заражения цыплят культурой вирулентного штамма НБ "Т-53" в дозе 1000 ЭЛД₅₀.

Результаты иммунизации цыплят штаммом "ГАМ-61 ВГНКИ" представлены в табл. 8.

Как видно из табл. 8 иммунизация птицы вакциной, содержащей в основе антиген из штамма вируса "ГАМ-61 ВГНКИ", обеспечивает надежную защиту цыплят от заражения высоковирулентным штаммом "Т-53" вируса ньюкаслской болезни.

П р и м е р 12. Вакцину против НБ с биологической активностью 10^8,0 Э Л Д_{50/ см}3 испытывают в птицеводческих хозяйствах неблагополучных по НБ с профилактической целью.

Вакцину вводят 1 млн, голов цыплят яичных пород 65-70 дневного возраста внутримышечно в дозе 10^6,0 ЭЛД_50/мл в объеме 0,5-1,0 мл и 8,1 млн. голов 12-17 дневных цыплят-бройлеров аэрозольно в дозе 600-800 Э Л Д_{50/ см}3 после предварительной иммунизации аналогичными препаратами из лентогенных штаммов ("Ла Сота", "Бор-74 ВГНКИ"). Учитывают результаты сохранности. Проводят серологическое исследование сывороток крови через 14 дней после вакцинации в РТГА.

Сохранность среди цыплят яичных пород после применения вакцины на основе антигена из штамма "ГАМ-61 ВГНКИ" составляет в среднем 99,3% а среди цыплят-бройлеров 83,0% Средний геометрический титр антител у цыплят-бройлеров 7,6 log₂; у цыплят яичных пород 6,4 log₂, что свидетельствует о достаточно напряженном иммунитете.

Проведенные исследования и испытания показывают, что полученный штамм Paramixovirus "ГАМ-61 ВГНКИ" высокоиммуногенен, безвреден для цыплят 1-60 дневного возраста, что позволяет рекомендовать его для изготовления эффективного биопрепарата против ньюкаслской болезни.

Экономический эффект от использования штамма для получения вакцины против ньюкаслской болезни будет складываться за счет расширения арсенала высокоэффективных биопрепаратов, снижения затрат на проведение профилактических мероприятий.

Формула изобретения

Штамм Paramyxovirus ВГНКИ ГАМ-61, используемый для изготовления вакцины против ньюкастлской болезни кур.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7