Способ очистки и стерилизации культурального вируса ящура
Использование: при приготовлении биологических средств специфической профилактики и диагностики ящура. Сущность применения: в суспензию культурального вируса ящура добавляют при перемешивании 5-или 10-%-ный водный раствор флокулянта полигуанидина до конечной концентрации 0,005 - 0,03%, pH 7,6 - 8,0; флокулированные балластные белки отделяют центрифугированием, сепарированием или отстоем. 6 табл.
Изобретение относится к вирусологии, а более конкретно к способам очистки вирусных суспензий от балластных белков и жиров, и может быть использовано при изготовлении биологических средств специфической профилактики и диагностики ящура у сельскохозяйственных животных.
Известные способы очистки вируссодержащих суспензий подразделяются на три группы физические, химические и физико-химические с использованием хлорированных и фторированных углеводородов в двухфазных системах полимеров [1] Недостатком указанных методов является или низкая производительность, или высокая сложность исполнения; или незначительная степень очистки. Известен способ очистки культурального вируса ящура от балластных белков и жиров с помощью флокулянта полиглюкина, который добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,7-1,0% [2] Недостаток данного способа состоит в его низкой эффективности, так как в вируссодержащей суспензии после ее обработки полиглюкином остается значительное количество балластных веществ, которые придают вакцине нежелательную аллергенность. Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату при использовании является способ очистки вируса ящура, репродуцированного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, путем обработки вируссодержащей суспензии органическим растворителем хлороформом, который добавляют в объеме 2% от количества суспензии при постоянной работе мешалки и центробежного насоса, и последующего удаления денатурированных белков и жиров центрифугированием или сепарированием [3] Способ-прототип имеет следующие недостатки: 1) низкое качество очистки вируссодержащей суспензии от балластных веществ, так как эффективность очистки зависит от количества добавляемого хлороформа и степени его эмульгирования в суспензии; 2) обработка суспензии хлороформом не устраняет обсемененности суспензии микрофлорой; 3) хлороформ обладает высокой летучестью и токсичностью, поэтому работа с хлороформом опасна и вредна для обслуживающего персонала; 4) хлороформ является экологически вредным препаратом. В задачу создания настоящего изобретения входил поиск химического препарата, позволяющего повысить экологичность и эффективность способа очистки от балластных веществ промышленных объемов суспензии культурального вируса ящура с одновременной инактивацией контаминирующей суспензию микрофлоры и сохранением антигенных и иммуногенных свойств вируса ящура. Поставленная задача решена тем, что в известном способе стерилизующей очистки культурального вируса ящура, включающем добавление в вирусную суспензию флокулянта и последующее отделение флокулированных балластных веществ в соответствии с изобретением в качестве флокулянта используют полигуанидин (ПГ) в конечной концентрации 0,005-0,03% Для стерилизующей очистки суспензии культурального вируса ящура используют препараты ПГ мол.м. 20000-30000Д и 30000-100000Д, полученные из института нефтехимического синтеза АН СССР от П.А.Гембицкого и Покровского завода биопрепаратов. ПГ-препарат эмпирической формулы (С7Н16N3CI)n, выпускаемый промышленностью под торговой маркой "Полисепт", представляет собой водорастворимый полимерный продукт, который благодаря качествам катионного электролита в сочетании с полимерностью, а также наличию полярной гуанидиновой и неполярной гексаметиленовой группировкам, придающим адгезивные и поверхностно-активные свойства, имеет широкий спектр применения в народном хозяйстве. ПГ обладает высокой бактерицидной и фунгицидной активностью. Растворы препарата в 0,05%-ной концентрации вызывают гибель грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов в течение 5-25 мин. ПГ является абсолютно безопасным для здоровья людей и животных и экологически безвредным для окружающей среды. По сравнению с прототипом предлагаемый способ отличается тем, что в качестве флокулянта используют ПГ в конечной концентрации 0,005-0,03% Указанные отличия являются существенными, так как они достаточны во всех случаях для достижения обеспечиваемого изобретением технического результата. В результате проведенных исследований впервые установлены новые свойства ПГ: в используемых концентрациях он не разрушает вирус, флокулирует балластные белки и жиры. Новые свойства ПГ использованы для очистки вируссодержащей суспензии с одновременной инактивацией контаминирующей суспензию микрофлоры и сохранением исходных биологических свойств вируса ящура, что позволяет повысить экологичность предлагаемого способа и качество очистки. Признаки, отличающие предлагаемый способ от прототипа, не выявлены в других известных решениях при изучении данной и смежных областей знаний. Благодаря использованию новой совокупности известных и отличительных признаков, характеризующих предлагаемый способ, достигается технический результат, указанный в задаче создания изобретения, что подтверждено результатами многочисленных исследований, сведения с которых приведены ниже. П р и м е р 1. По окончании культивирования вируса ящура А22 в суспензионной культуре клеток ВНК-21 в рубашку реактора подают хладагент. Одновременно в вируссодержащую суспензию, стерильную или контаминированную микрофлорой, добавляют при перемешивании 5 или 10%-ный водный раствор ПГ рН 7,6-8,0 до конечной концентрации 0,005%При обработке ПГ вируссодержащей суспензии объемом до 10 л перемешивание осуществляют вручную в течение 5 мин. В этом случае флокулированные балластные белки отделяют в центрифуге в течение 20 мин при 1000 g. При объеме вируссодержащей суспензии до 2000 л перемешивание последней после добавления ПГ проводят с помощью мешалки реактора в течение 20 мин. После охлаждения вируссодержащей суспензии до 4-10оС отделяют флокулированные балластные белки и микробные клетки центрифугированием, сепарированием или отстоем. Для центрифугирования вируссодержащей суспензии используют проточную центрифугу ОТР-101К-01. Режим центрифугирования 200-300 л/ч. Для сепарирования используют сепаратор фирмы Альфа-Лаваль. Режим сепарирования 1000 л/ч. Длительность отстоя зависит от объема суспензии и определяется индивидуально для каждого случая. Очищенную таким образом вируссодержащую суспензию проверяют на количество балластных веществ, стерильность, инфекционность и компонентный состав вируса. П р и м е р 2. Очистку вируса ящура А22, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что 5 или 10%-ный водный раствор ПГ добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,01%
П р и м е р 3. Очистку вируса ящура А22, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1. Отличие состоит в том, что 5 или 10%-ный водный раствор ПГ добавляют в вируссодержащую суспензию до конечной концентрации 0,03%
П р и м е р 4. Очистку вируса ящура О1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 1. П р и м е р 5. Очистку вируса ящура О1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 2. П р и м е р 6. Очистку вируса ящура О1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примере 3. П р и м е р 7. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 1 или 4. П р и м е р 8. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 2 или 5. П р и м е р 9. Очистку вируса ящура Азия-1, выращенного в суспензионной культуре клеток ВНК-21, осуществляют так, как описано в примерах 3 или 6. Эффективность предлагаемого способа в сравнении с прототипом подтверждены результатами многочисленных экспериментов, сведения о которых представлены в табл. 1-6. В опытах использовали 5 или 10%-ные водные растворы ПГ, рН которых устанавливали раствором уксусной кислоты или аммиака в пределах 7,6-8,0. Исследования по обработке суспензии культурального вируса ящура различными образцами ПГ показали, что с увеличением молекулярной массы возрастала флокулирующая активность препарата в отношении нерастворенной взвеси и растворенных балластных белков. При самоосаждении флокул или при отделении их с помощью центрифугирования надосадочная жидкость становилась более прозрачной. Предлагаемый способ очистки испытан в лабораторных и промышленных условиях. При этом определяли количество балластного белка, титр инфекционности вируса, стерильность очищенной суспензии, количество 146S компонента и иммуногенную активность вируса в составе адсорбатвакцины. Содержание растворенного балластного белка в неочищенной суспензии, а также в суспензиях, обработанных ПГ и хлороформом, определяли по калибровочной кривой, построенной по известным концентрациям бычьего сывороточного альбумина. Оптическую плотность образцов суспензии измеряли на спектрофотометре СФ-26 при длине волны 280 нм. Инфекционность вируса в суспензии до и после очистки определяли методом бляшек на культуре клеток свиной почки. Наличие и количество бактериальной и грибковой микрофлоры определяли по методу высевом суспензии и ее разведений на среды МПА, МППБ, тиогликолевую среду и агар Сабуро. Анализ компонентного состава вируса ящура после его обработки хлороформом или ПГ проводили спектрофотометрическим методом. Очищенный предлагаемым способом вирус инактивировали 0,03% концентрацией аминоэтиленимина в течение 24 ч при 27-28оС. Авирулентность инактивированного вируса проверяли, инфицируя монослой клеток свиной почки неразведенной суспензией вируса. Целостность монослоя и отсутствие цитопатических изменений подтверждали авирулентность инактивированного препарата вируса. Иммуногенную активность вируса проверяли в составе адсорбатвакцины с сапонином. Иммуногенность вакцин определяли по 50% иммунизирующей дозе для взрослых белых мышей массой 18-22 г, которую вычисляли согласно формуле Кербера-Ашмарина. Опыты проводили с использованием суспензии вируса ящура типа А, О1 и Азия-1, контаминированной микрофлорой. Результаты исследований представлены в табл. 1-6. В результате проведенных исследований установлено, что количество растворенного балластного белка в суспензиях, обработанных ПГ м.м. 20000-30000Д и ПГ м. м. 30000-100000Д отличается между собой незначительно, но суспензии вируса, очищенные ПГ м.м. 20000-30000Д, содержат мелкую взвесь белковых флокул. Низкоскоростное центрифугирование и сепарирование не удаляет такую взвесь и очищенные суспензии обладают слабой прозрачностью. ПГ м. м. 30000-100000Д вызывает образование более крупных белковых флокул, обеспечивающих получение прозрачных суспензий при центрифугировании и сепарировании. В табл. 1 показаны результаты обработки вируссодержащей суспензии ПГ в концентрации 0,005-0,030% Использование меньшей концентрации ПГ, а именно 0,0025% для очистки вирусной суспензии не позволяет получить удовлетворительное качество очистки суспензии. Увеличение концентрации ПГ в суспензии свыше 0,03% приводит к значительным потерям вируса. Наблюдается снижение титра инфекционности вируса и количества 146S компонента вируса. В табл. 1 показано, что обработка суспензии вируса ящура ПГ позволяет уменьшить количество растворенных балластных белков на 23% по сравнению с неочищенной суспензией, а обработка суспензии хлороформом лишь на 14%
В табл. 2 показано, что контаминированные микрофлорой суспензии вируса ящура после 5-часового контакта с ПГ в концентрации 0,01% а также после 20-часового контакта с ПГ в концентрации 0,005% при исследовании были стерильными. В табл. 3 показано, что инфекционность вируса ящура типа А, О и Азия-1 в образцах очищенной ПГ суспензии оставалась на прежнем уровне. В табл. 4 показано, что количество 146S компонента вируса ящура в суспензии, очищенной ПГ, не отличалось от такового при обработке суспензии 2% хлороформа. В табл. 5 показано, что иммуногенность вакцин из вируса ящура, обработанного ПГ, была равной 0,03 мл для типа А и 0,18-0,22 для типа О и не уступала активности вакцин из вируса, обработанного хлороформом. Данные табл. 6 показывают стабильность иммуногенных свойств культурального вируса ящура А и О типов в течение 6-12 мес при хранении вакцины при 4-8оС. Таким образом, предложен способ стерилизующей очистки культурального вируса ящура, использование которого обеспечивает по сравнению с прототипом следующие преимущества:
1. Количество растворенного белка в очищенной суспензии снижается в 1,6 раза. 2. Исключается выбраковка вируссодержащей суспензии, контаминированной микрофлорой в период репродукции вируса. 3. Исключается использование антибиотиков в период репродукции вируса и при составлении вакцины. 4. Технологический цикл получения очищенной суспензии культурального вируса ящура сокращается по времени на 1-1,5 ч и не требует оборудования для интенсивного эмульгирования хлороформа в суспензии вируса, например, насосов центробежного типа. 5. Замена хлороформа на ПГ при очистке вируссодержащей суспензии делает эту операцию безвредной для обслуживающего персонала, а технологию производства вакцин более экологически чистой. 6. Благодаря снижению концентрации балластного белка, отсутствию антибиотиков и микрофлоры уменьшается аллергенность и реактогенность вакцины. Предлагаемый способ найдет промышленное применение при изготовлении средств специфической профилактики ящура сельскохозяйственных животных.
Формула изобретения
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе
Дата прекращения действия патента: 08.02.2004
Извещение опубликовано: 27.11.2004 БИ: 33/2004