Средство, обладающее противошоковой активностью

 

Изобретение относится к медицине и касается применения известного препарата эмоксипина (гидрохлорида 2-этил-6-метил-3-оксипиридина) по новому назначению, а именно в качестве противошокового средства. Ранее эмоксипин применялся в офтальмологии для лечения, например, ожогов сетчатки глаза различной этиологии. 8 табл.

Изобретение относится к медицине, в частности к фармакологии, и может быть использовано при лечении шока различной этиологии.

В настоящее время известен ряд соединений, препятствующих развитию эндотоксинового шока. Однако ни одно из них не обладает высоким лечебным эффектом на фоне развившегося шока.

Сложность патогенетической картины эндотоксинового шока, возникающего в результате внедрения в организм патогенной микрофлоры или продуктов ее жизнедеятельности самой различной природы, а также быстрота развития и многообразие клинических проявлений рассматриваются как главные препятствия на пути создания фармакологических средств с эффективными лечебными свойствами.

В последние годы большие надежды возлагаются на блокаторы синтеза простагландинов, прежде всего циклооксигеназы (ацетилсалициловая кислота, индометацин) и тромбоксан-синтетазы (имидазол, ибупрофен).

Работами Halushka et al. показано, что введение ацетилсалициловой кислоты за 30 мин до индукции эндотоксинового шока сублетальными дозами Salmonella enteritidis увеличивает выживаемость животных до 70% Применение в те же сроки ибупрофена и имидазола увеличивает выживаемость до 80% [1] В более поздние сроки ни аспирин, ни другие ингибиторы синтеза простагландинов не тормозят развития эндотоксинового шока и не оказывают существенного влияния на процент гибели животных, что, вероятно, связано не только с быстрым развертыванием клинической картины шока, но и включением в патогенетическую цепь механизмов, независимых от продуктов циклооксигеназного каскада.

В настоящее время остается актуальной и проблема лечения острых отравлений, сопровождающихся возникновением экзотоксического шока.

Острые отравления химическими веществами, по данным разных авторов, составляют от 40 до 85% всех случаев отравлений. К химическим веществам, наиболее часто вызывающим отравления, относятся, например, сильнодействующие кислоты, щелочи, лекарственные препараты, средства бытовой химии. Терапия при шоке носит симптоматический характер.

В настоящее время при шоке проводят комплекс лечебных мероприятий, включающий применение: глюкокортикоидов для лечения сердечно-сосудистых нарушений, например, преднизолона, дексаметазона; наркотических анальгетиков для обезболивания; буферных растворов для коррекции водно-электролитного баланса; кровезаменителей для воспаления циркулирующей крови, а также гемодиализ, метод форсированного диуреза, перитонеальный диализ.

На данный момент в медицинской практике не существует противошоковых препаратов.

Цель изобретения противошоковое средство.

Цель достигается применением известного лекарственного вещества гидрохлорида 2-этил-6-метил-3-оксипирида (международное название эмоксипин) формулы I: HCl (I) по новому назначению, а именно в качестве противошокового средства.

В настоящее время эмоксипин находит применение в глазной практике, например для лечения ожогов сетчатой оболочки глаза.

Механизм известного терапевтического действия эмоксипина связывают с подавлением агрегации тромбоцитов в результате блокады в них активности фосфодиэстеразы циклического 3,5-АМФ. Наши исследования впервые показали, что эмоксипин способен тормозить также и развитие эндотоксинового и токсического шока. В основе противошокового действия препарата лежат совершенно иные механизмы: ингибиция агрегации нейтрофилов и подавление в них биосинтеза липоксигеназных продуктов арахидонового каскада, в частности, лейкотриенов ЛТВ₄, являющихся мощными индукторами септического процесса.

В связи с тем, что в медицинской практике отсутствуют средства для патогенетической терапии шока, сравнение заявляемого препарата проводят с преднизолоном, дексаметазоном, препаратами, используемыми при симптоматической терапии шока.

Нижеследующие примеры иллюстрируют противошоковое действие эмоксипина.

П р и м е р 1. Противошоковая активность эмоксипина на модели эндотоксинового шока. Опыты ставились на двух видах животных: мышах (массой 20-24 г) и кроликах (массой 2,5-3,0 кг), содержащихся в виварии на обычном рационе питания.

Модель эндотоксинового шока создавалась по методу (I) внутривенным введением сублетальных доз липополисахарида В (ЛПС) Salmonella typhimurium L-3629 "Sigma" (США), вызывавших 90% гибель животных в течение 24 ч. Мыши получали ЛПС в дозе 30 мг/кг, кролики 7,5 мг/кг. ЛПС растворяли в физиологическом растворе хлористого натрия, рН среды доводилось до 7,5.

Стерильный раствор эмоксипина вводили внутривенно: мышам в дозах 50 и 100 мг/кг (в хвостовую вену), кроликам в дозах 20 и 50 мг/кг (в ушную вену) в объемах соответственно 0,1 мл и 1,0 мл через 1 ч после введения токсина.

Контрольные животные получали адекватные дозы аспирина, солюбилизированного в растворе ТВИН-80 (или ТВИН-80 с физиологическим раствором хлористого натрия), ибупрофен ("Upjohn Company", США; 5 и 20 мг/кг) или дексаметазон (0,5 и 5,0 мг/кг).

Противошоковая активность препаратов оценивалась по проценту выживаемости животных через 24 ч после начала эксперимента, а также визуально (по изменению поведения животных) и данным гистологического исследования. В опытах на кроликах проводилась непрерывная регистрация показателей центральной и периферической гемодинамики на протяжении 5 ч от начала эксперимента при помощи специальных датчиков, соединенных с мингографом-34 ("Siemens"). Данные экспериментов обрабатывались статистически. Первые клинические признаки эндотоксинового шока развивались у животных к концу 1 ч после введения эндотоксина.

Субъективно это проявлялось резким торможением двигательной активности (в отдельных случаях судорожными подергиваниями), одышкой, обильной дефекацией в виде жидкого стула, потерей аппетита.

Объективно у кроликов регистрировалось падение артериального давления более, чем на 20% урежение ритма сердечных сокращений в среднем на 15% Падеж животных начинался с 3-5 ч. В этот период в контрольной группе погибло 24% мышей и 30% кроликов (табл. 1 и 2).

Через 12 ч летальность мышей достигала 47% а к концу эксперимента (через 24 ч) 92% В группе кроликов летальность в те же сроки составила соответственно 50 и 90% При вскрытии животных выявлялись полнокровие паренхиматозных органов, вздутие легких, множественные кровоизлияния во внутренних органах.

При введении эмоксипина через 1 ч после развития шока в дозе 50 мг/кг падеж мышей к 5 часу не превышал 12% а к исходу суток 30% (табл. 1). В более высокой дозе (100 мг/кг) эмоксипин оказался гораздо менее эффективным.

Противошоковая активность аспирина в дозах 50 и 100 мг/кг не превышала 30% а ибупрофена в дозах 5 и 20 мг/кг 35% в обеих группах мышей, леченых дексаметазоном (0,5 и 5 мг/кг), выживаемость через 24 ч составила 29,4% (табл. 1).

В опытах на кроликах оптимальный терапевтический эффект эмоксипина наблюдался в дозе 20 мг/кг (табл. 2). Артериальное давление при этом начинало стабилизироваться уже через час после введения препарата и к 4 ч приближалось практически к норме (рис.).

Падеж кроликов, получавших эмоксипин и аспирин в дозе 20 мг/кг, составлял в первые 5-8 ч после развития шока 20% а через 24 ч не превышал 33% для группы животных, получавших эмоксипин, а для группы животных, получавших аспирин и ибупрофен, гибель животных составляла 80% (табл. 2).

Эффективность эмоксипина и аспирина в дозе 50 мг/кг, а также ибупрофена (5 и 20 мг/кг) через 24 ч оказалась незначительной (табл. 2).

П р и м е р 2. Противошоковая активность эмоксипина на модели экзотоксического шока, вызванного внутрижелудочным введением уксусной кислоты. Опыты проводились на 150 беспородных белых крысах-самцах массой 180-240 г. Эндотоксический шок вызывали по известной методике путем перорального введения 40% уксусной кислоты (0,4 мл на 100 г массы животного) под гексеналовым наркозом. Эмоксипин вводили однократно внутрибрюшинно в объеме 1 мл в дозах 10, 15, 20, 40, 60 и 100 мг/кг за 1 ч до и через 1 ч после введения уксусной кислоты. Контрольные животные получали преднизолон в дозе 5 мг/кг.

Результаты исследований представлены в табл. 3. Гибель животных наблюдалась через 24 ч от начала эксперимента. Максимальный противошоковый эффект эмоксипина наблюдался в дозе 40 мг/кг независимо от времени введения препарата.

Так, через 28 ч от начала эксперимента погибло лишь 10% За этот же период в группе животных, получавших преднизолон (максимально эффективная доза 5 мг/кг), погибло 60-70% животных. Через 36 ч от начала эксперимента в группе животных, получавших максимально эффективную дозу эмоксипина (40 мг/кг), погибло 40% животных, а преднизолона (5 мг/кг) 100% животных.

Из табл. 3 видно также, что увеличение дозы эмоксипина до 60-100 мг/кг не приводит к повышению противошокового эффекта.

П р и м е р 3. Противошоковая активность эмоксипина на модели экзотоксического шока, вызванного внутрижелудочным введением дихлорэтана. Опыты ставились на 150 беспородных белых крысах-самцах массой 180-240 г. Экзотоксический шок вызывали путем внутрижелудочного введения дихлорэтана в объеме 0,1 мл на 100 г массы животного (методика разработана авторами). Эмоксипин и преднизолон вводили так же, как в примере 2.

Результаты исследований представлены в табл. 4.

Максимально эффективная доза эмоксипина в этом случае составляла 20 мг/кг. Так, при введении эмоксипина в этой дозе через 24 ч от начала эксперимента гибель животных сокращалось более чем в 3 раза (погибло 20% животных) по сравнению с группой животных, получавших максимально эффективную дозу преднизолона (погибло 60 и 70% животных) в зависимости от времени введения преднизолона). Через 24 ч от начала эксперимента в группе животных, получавших преднизолон, погибло 100% а в группе животных, получавших эмоксипин, 50-80% Увеличение дозы эмоксипина до 100 мг/кг не приводило к увеличению противошокового эффекта.

Причиной летальных исходов при шоках различной этиологии является развитие синдрома дыхательной недостаточности, или так называемого "шокового легкого". Формирование этого симптомокомплекса обусловлено агрегацией нейтрофилов в микрососудах малого круга кровообращения, эмболизацией последних клеточными агрегатами и разрушением легочной паренхимы лизосомальными ферментами нейтрофилов и реактивными формами О₂. Примеры 4-6 иллюстрируют способность эмоксипина ингибировать агрегацию нейтрофилов, индуцированную in vitro веществами с различным механизмом действия.

П р и м е р 4. Подавление эмоксипином агрегации нейтрофилов, индуцированной липополисахаридом В Salmonella typhimurium. Периферические нейтрофилы выделяли согласно способу, модифицированному авторами. В ходе выделения использовался буфер ТСМ (II) без кальция и магния. Донорами служили самцы кроликов породы серая шиншилла (масса 3,0-3,5 кг). Кровь (40-60 мл) забирали из краевой вены уха в 1/10 объема 3,8%-ного раствора цитрата натрия. Тромбоциты отделяли центрифугированием, для удаления эритроцитов использовались седиментация в растворе декстрана и гипотонический лизис. Полученную суспензию лейкоцитов фракционировали центрифугированием в градиенте плотности (60% перколл, "Рharmacia", Швеция). Клетки, прошедшие сквозь градиент, дважды отмывали, а затем ресуспендировали, доводя плотность суспензии до 1,11˙10⁷ клеток/мл. 98% клеток составляли гетерофилы (подсчет проводили в мазках, окрашенных по Романовскому). Жизнеспособность клеток составляла в среднем 97% (судя по исключению трипановой сини). Базофилы и мононуклеары отсутствовали, контаминация тромбоцитами не превышала 1/100. При работе с клетками использовалась либо полипропиленовая, либо силиконированная стеклянная посуда. Процедура выделения велась при 4^оС.

Агрегация нейтрофилов регистрировалась турбидиметрически с помощью стандартного агрегометра фирмы "Chronolog Corporation" (модель 330, США), снабженного самописцем (чувствительность 10 мВ, скорость ленты 25,3 мм/мин). В силиконированную кювету с покрытой тефлоном магнитной мешалкой помещали 0,45 мл суспензии нейтрофилов, затем добавляли по 5 мкл концентрированных растворов хлористого кальция и хлористого магния, 20 мкл раствора эмоксипина в 0,15 М растворе хлористого натрия (или 20 мкл 0,15 М раствора хлористого натрия) и прогревали в ячейке прибора в течение 2 мин при 37^оС, после чего включали самописец и вносили в кювету 20 мкл солюбилизированного липополисахарида В (ЛПС; конечн. конц. 200 мкг/мл). При таком соотношении объемов конечная плотность суспензии составляла 10⁷ клеток/мл, содержание кальция и магния соответственно 1,3 и 1,0 мМ, а конечная концентрация эмоксипина 3, 5 или 10 мМ. Для установки максимума светопропускания пользовались разведенной вдвое суспензией нейтрофилов. Ни ЛПС, ни эмоксипин в использовавшихся концентрациях не обнаруживали токсического эффекта при получасовой инкубации (исключение трипановой сини).

Каждый опыт начинали с проверки клеток на способность к спонтанной агрегации. Спонтанно агрегирующие клетки признавали непригодными для эксперимента. После начала агрегации запись вели в течение 5 мин. Количественную оценку агрегационного ответа давали по следующим параметрам: 1) лаг-периоду L-промежутку времени между внесением индуктора в кювету и началом агрегации, с; 2) максимуму светопропускания В_м (в процентах по отношению к светопропусканию разведенной вдвое суспензии); 3) начальной скорости агрегации v, определявшейся по величине тангенса угла наклона касательной, проведенной к кривой через начальную точку, мм/мин.

Оценка значимости полученных результатов проводилась с помощью t-критерия Стьюдента.

Преинкубация с эмоксипином вызывала дозозависимое угнетение агрегации. Как видно из табл. 5, эмоксипин в концентрации 3-5 мМ увеличивал лаг-период в среднем в 1,9 раза (р < 0,01). Преинкубация с 10 мМ эмоксипина приводила к удлинению лага примерно в 3 раза (р < 0,001).

Если принять за 100% максимальное увеличение светопропускания, вызываемое 200 мкг/мл ЛПС, преинкубация с эмоксипином в концентрации 3 мМ вызывала уменьшение этого параметра на 42% (р < 0,001), 5 мМ на 55% (р < 0,001), 10 мМ на 76% (р < 0,001).

Скорость агрегации нейтрофилов при инкубации с 3 мМ эмоксипина снижалась вдвое (р < 0,001). Увеличение концентрации эмоксипина до 5 и 10 мМ приводило к уменьшению скорости агрегации соответственно в 3 (р < 0,001) и 4 (р < 0,001) раза.

П р и м е р 5. Подавление эмоксипином арахидонат-индуцированной агрегации нейтрофилов. Нейтрофилы выделяли из стабилизированной цитратом натрия венозной крови нормальных доноров, не принимавших в течение предшествующих 7-10 дней лекарственных препаратов. Нейтрофилы составляли около 95% выделенных клеток, жизнеспособность во всех случаях превышала 95% Контаминирующие тромбоциты встречались не чаще 1/100. Опыт ставили так же, как описано в примере 4, с небольшими изменениями (плотность суспензии доводили до 1,09˙10⁷ клеток/мл, в кювету вносили 0,46 мл суспензии, раствор эмоксипина добавляли в объеме 25 мкл). Индуктором служила арахидоновая кислота ("Fluka", Швейцария), которую хранили в виде концентрированного раствора в абсолютном этаноле при -70^оС. Рабочий раствор готовили перед началом каждого опыта таким образом, что при добавлении его в объеме 5 мкл концентрация арахидоновой кислоты в кювете составляла 5˙10^-5 М.

Влияние эмоксипина на арахидонат-индуцированную агрегацию нейтрофилов было еще более выраженным. Преинкубация с 3 мМ эмоксипина приводила к удлинению лаг-периода в 2,9 раза (р < 0,001); в концентрациях 5-10 мМ эмоксипин увеличивал этот показатель в среднем в 4,6 раза (р < 0,001).

Как видно из табл. 6, в концентрациях 3-5 мМ эмоксипин вызывал уменьшение максимума светопропускания в среднем на 66% (р < 0,001). Преинкубация с 10 мМ препарата практически предотвращала агрегацию (уменьшение В_м на 92% р < 0,001).

При инкубации нейтрофилов с 3, 5, 10 мМ заявляемого вещества скорость агрегации уменьшилась соответственно в 2 (р < 0,001), 3 и 6 раз (р < 0,001).

П р и м е р 6. Подавление эмоксипином агрегации нейтрофилов, индуцированной кальциевым ионофором А 23187. Ионофор А 23187 ("Calbiochem-Вehring", США) растворяли в диметилсульфоксиде ("Serva", ФРГ) и хранили при -70^оС. Перед началом каждого опыта маточный раствор разводили в 10 раз буфером. Опыты ставили так же, как описано в примере 4. Объектом исследования служили кроличьи и человеческие нейтрофилы. Индуктор вносили в кювету в объеме 20 мкл. Величина лаг-периода не использовалась для количественной характеристики подавления А 23187 индуцированной агрегации.

Как видно из табл. 7, преинкубация кроличьих и человеческих нейтрофилов с 10 мМ эмоксипина приводила к уменьшению максимума светопропускания в два раза (р < 0,001). Судя по изменениям начальной скорости агрегации, человеческие нейтрофилы были более чувствительны к протекторным эффектам эмоксипина. Обработка препаратом (10 мМ) снижала скорость агрегации гранулоцитов кролика в 1,4 раза (р < 0,001), в случае человеческих клеток этот показатель уменьшался вдвое (р < 0,001).

Таким образом, эмоксипин в концентрациях 5-10 мМ эффективно ингибирует агрегацию нейтрофилов, вызванную различными индукторами. Дексаметазон, являющийся одним из самых мощных лекарственных средств группы глюкокортикостероидов, ингибирует агрегацию нейтрофилов на 50% в концентрации 80 мМ (32 мг/мл). Ингибиторы циклооксигеназы не влияют на агрегационную способность нейтрофилов.

Следующий пример иллюстрирует способность эмоксипина блокировать липоксигеназный путь метаболизма арахидоновой кислоты. Липоксигеназные продукты являются как медиаторами активации нейтрофилов (15-17), так и медиаторами шока.

П р и м е р 7. Подавление эмоксипином продукции лейкотриена В₄ и 5-гидрокси-6,8,11,14-эйкозатетраеновой кислоты (ЛТВ и 5-НЕТЕ).

Опыт ставили так же, как описано в примере 4, но объем проб увеличивали вдвое. Через 5 мин инкубации интактных или протектированных эмоксипином нейтрофилов с ЛПС или 0,15 М раствором хлористого натрия реакцию останавливали добавлением 1,5 объемов ледяного метанола. Пробы инкубировали 15 мин при 4^оС, а затем центрифугировали (2000g, 4^оС, 10 мин), супернатанты подкисляли 1 М раствором соляной кислоты до рН 3,5 и хранили при -70^оС до определения.

Липоксигеназные продукты экстрагировали двумя объемами этилацетата, экстрагент удаляли под азотом, а осадок растворяли в буфере для соответствующего радиоиммуноанализа.

ЛТВ₄ и 5-НЕТЕ определяли радиоиммунохимически с помощью коммерческих наборов (³Н-LtB₄ assay reagent system, "Amersham" Великобритания; 5-НЕТЕ ³Н-RIA Kit, "Seragen", США). В каждой пробе делали два параллельных измерения. Уровень обоих продуктов выражали в пг/10⁷ клеток/мл. Значимость оценивали с помощью t-критерия Стьюдента для попарно связанных вариант.

Как видно из табл. 8, клетки, стимулированные ЛПС, образовывали в 1,4 раза меньше 5-НЕТЕ (р < 0,001) и в 1,6 раза больше ЛТВ₄ (р < 0,01) по сравнению с нативными нейтрофилами.

Преинкубация с 10 мМ эмоксипина приводила к еще более резкому уменьшению продукции 5-НЕТЕ (в 1,4 раза по сравнению с клетками, обработанными ЛПС, р < 0,05; в 1,9 раза по сравнению с нестимулированными клетками, р < 0,001. Под влиянием эмоксипина продукция ЛТВ₄ снижалась в 2 раза по сравнению с ЛПС-индуцированной (р < <0,05) и была в 1,3 раза меньше, чем в нестимулированных клетках (р < 0,05).

Таким образом, даже двухминутный контакт нейтрофилов с эмоксипином полностью блокирует продукцию лейкотриенов, индуцированную ЛПС. Дексаметазон подавляет синтез липоксигеназных продуктов в клетках некоторых линий лишь после многочасовой инкубации. Кроме того, эффективность дексаметазона как ингибитора продукции лейкотриенов определяется способностью клеток к синтезу белка. Однако при эндотоксиновом шоке синтез белков нарушается и даже высокие дозы дексаметазона не блокируют продукцию метаболитов арахидоновой кислоты. И, например, ингибирующая активность кортикоидов может зависеть от того, какой агент использован в качестве триггера метаболизма арахидоновой кислоты. Например, дексаметазон не подавляет продукцию лейкотриенов в клетках легочной ткани, стимулированных антителами, а гидрокортизон в лейкемических базофилах крысы, стимулированных ионофором А 23187. К лекарственным препаратам, ингибирующим циклооксигеназу и тромбоксан-синтетазу, ферменты биосинтеза лейкотриенов не чувствительны.

Представленные данные позволяют заключить, что впервые найдено высокоэффективное средство патогенетической терапии шоковых состояний.

Формула изобретения

СРЕДСТВО, ОБЛАДАЮЩЕЕ ПРОТИВОШОКОВОЙ АКТИВНОСТЬЮ, отличающееся тем, что оно представляет собой гидрохлорид 2-этил-6-метил-3-оксипиридина (эмоксипин).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6