Питательная среда для выделения из биоматериала животных и культивирования микобактерий туберкулеза

 

Использование: питательная среда, выделение из биоматериала животных, культивирование микобактерий туберкулеза. Сущность изобретения: среда содержит яйца куриные, желтки куриных яиц, молоко, картофельный отвар, пептон, глицерин, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий лимоннокислый, магний сернокислый, малахитовый зеленый, тетрадекан или пентадекан, или гэксадекан и дистиллированную воду, среда позволяет ускорить выявление микобактерий туберкулеза в биоматериале и повысить интенсивность накопления бактериальной массы, что дает возможность сократить сроки и повысить точность бактериологической диагностики туберкулеза животных. 1 табл.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии, в частности к бактериологической диагностике туберкулеза.

Известна питательная среда Гельберга для выращивания микобактерий туберкулеза при исследовании биологического материала от животных и посевах культур микобактерий туберкулеза, содержащая (г/л) яичную массу 400-500 (6 цельных куриных яиц), желтки яиц 90-100 (4 желтка), молоко 140-160, картофельный отвар 140-160, малахитовый зеленый 0,2-0,25 и солевой раствор 140-160, состоящий из калия фосфорнокислого двузамещенного 0,14-0,16, натрия лимоннокислого 0,14-0,16, магния сернокислого 0,14-0,16, пептона 0,8-1,0, глицерина 3,2-4,0 и дистиллированной воды до 140-160 мл.

Однако при использовании этой и других питательных сред, применяемых в бактериологической диагностике туберкулеза животных, рост первичных культур микобактерий туберкулеза очень скудный и медленный и поэтому до появления их колоний требуются длительные сроки инкубирования: из посевов биоматериала 30-70 дней, при пересевах свежевыделенных культур 30-65 дней. Наблюдения за посевами биоматериала поэтому проводят в течение 90 дней.

Цель изобретения сокращение сроков выращивания микобактерий туберкулеза бычьего и человеческого видов при посевах биологического материала и при пересевах свежевыделенных культур микобактерий туберкулеза и увеличение накопления бактериальной массы за счет повышения ростовых свойств среды.

Для этого в питательную среду Гельберга, содержащую яйца куриные, желтки куриных яиц, молоко, картофельный отвар, глицерин, пептон, раствор минеральных солей и малахитового зеленого, дополнительно вводят один из алканов (предельных углеводородов) с длиной цепи от С₁₄ и С₁₆ тетрадекан, пентадекан или гексадекан при следующем соотношении компонентов, г/л: Яйца куриные 400,0-500,0 Желтки куриных яиц 90,0-100,0 Молоко 140,0-160,0 Картофельный отвар 140,0-160,0 Малахитовый зеленый 0,2-0,25 Солевой раствор: а) калия фосфорнокис- лого двузамещенного 0,14-0,16 б) натрия лимоннокислого 0,14-0,16 в) магния сернокислого 0,14-0,16 г) пептона 0,8-1,0 д) глицерина 3,2-4,0 е) дистиллированной воды до 140-160 мл Алкан 15,3-30,6 П р и м е р 1. Среду готовят следующим образом.

Предварительно готовят стерильные обезжиренное молоко, картофельный отвар, солевой раствор и алкан.

Для приготовления отвара картофель моют с мылом, очищают, заливают двойным количеством водопроводной воды, кипятят 15 мин, после отстаивания фильтруют через ватно-марлевый фильтр.

На 1 л солевого раствора используют калия фосфорнокислого двузамещеного 1,0, натрия лимоннокислого 1,0, магния сернокислого 1,0, пептона 6,0, глицерина 30 мл (24 г), дистиллированная вода остальное. Раствор фильтруют через бумажный фильтр.

Стерилизацию молока, картофельного отвара и солевого раствора проводят в автоклаве, доводя температуру до 120^оС и тут же прекращают подогрев. Алканы стерилизуют при 1 атм 15 мин.

Приготовление среды: 15 куриных яиц моют с мылом, смачивают спиртом и обжигают. Стерильным пинцетом разбивают яйца и выливают в стерильную колбу содержимое 9 яиц (450 г) и желтки 6 яиц (95 г). Колбу встряхивают несколько минут и добавляют в нее 30 мл (22,95 г) алкана, по 150 мл молока, картофельного отвара и солевого раствора и 11,25 мл 2%-ного водного раствора малахитового зеленого. После тщательного размешивания содержимое разливают по пробиркам и свертывают 2 дня при 85^оС в течение 30 мин.

Суспензии 15 свежевыделенных от больных коров культур M.bovis, выpащенных на среде Гельберга, стандартизируют по бактериальному стандарту мутности на 5 ЕД, разводят физиологическим раствором 1:1000 и засевают по 0,2 мл на испытуемую питательную среду с алканом и контрольную (среду Гельберга) без алкана. Посевы инкубируют при 37^оС, ежедневно просматривают и оценивают результаты по срокам появления и числу выросших колоний.

При учете результатов оказалось, что колонии на среде без алкана появились на 42-52 дни, на среде с алканом на 18-22-й дни, т.е. в 2-2,5 раза быстрее. Интенсивность роста также значительно отличалась: на контрольной среде вырастали единичные колонии, а на испытуемой среде 20-30 и более колоний.

На испытуемую питательную среду с алканом и контрольную среду без алкана делают посевы из суспензий биологического материала от зараженных микобактериями туберкулеза бовинного вида лабораторных животных (морские свинки, кролики), а также от больных туберкулезом коров. У всех лабораторных животных и коров при вскрытии обнаружены туберкулезные поражения во внутренних органах и лимфатических узлах.

Перед посевом кусочки органов (печени, селезенки, легких, лимфатических узлов) измельчают, растирают в ступке пестиком, заливают 6%-ным раствором кислоты серной в соотношении: 1 часть патматериала и 4 части раствора кислоты. Пробы центрифугируют в течение 10 мин при 3000 оборотов в 1 мин. Надосадочную жидкость сливают, а осадок двукратно отмывают физиологическим раствором путем центрифугирования. Суспензии засеивают на среду с алканом и среду без алкана по 0,2 мл на каждую пробирку. Наблюдение за посевами проводят ежедневно до появления первичного роста, а затем 2 раза в неделю, учитывают сроки появления первичного роста культур и интенсивность роста (число колоний микобактерий на среде в одной пробирке).

Результаты исследования приведены в таблице.

Во всех случаях бактериологического исследования биологического материала от зараженных лабораторных животных и коров сроки появления колоний на среде с алканом были в 2-2,5 раза меньше, чем на среде без алкана. На поверхности питательной среды без алкана были единичные колонии микобактерий, на среде с алканом росли десятки колоний, а в отдельных пробирках был сплошной рост микобактерий.

П р и м е р 2. Готовят среды в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующих количествах; г/л: Содержимое яиц 400,0 Желтки яиц 90,0 Молоко 140,0 Картофельный отвар 140,0 2%-ный раствор малахи- тового зеленого 10,0 Солевой раствор: а) калия фосфорнокислого двузамещенного 0,14 б) натрия лимоннокислого 0,14 в) магния сернокислого 0,14 г) пептона 0,8 д) глицерина 3,2 е) дистиллированной воды до 140 мл Алкан 15,3 П р и м е р 3. Готовят среды в соответствии с примером 1, но компоненты берут в следующих количествах, г/л: Содержимое яиц 500,0 Желтки яиц 100,0 Молоко 160,0 Картофельный отвар 160,0 2%-ный раствор малахи- тового зеленого 12,5 Солевой раствор: а) калия фосфорно- кислого двузамещенного 0,16 б) натрия лимоннокислого 0,16 в) магния сернокислого 0,16 г) пептона 1,0 д) глицерина 4,0 е) дистиллированной воды до 160 мл Алкан 30,6 Результаты испытания питательных сред, приготовленных в примерах 2 и 3, при выращивании микобактерий из свежевыделенных культур и из биологического материала от больных туберкулезом животных были аналогичны результатам, полученным в примере 1.

Таким образом, предлагаемая питательная среда за счет добавки веществ, стимулирующих рост микобактерий, позволяет ускорить выявление микобактерий туберкулеза в биологическом материале и повысить интенсивность накопления бактериальной массы, что дает возможность сократить сроки и повысить точность бактериологической диагностики туберкулеза животных.

Формула изобретения

ПИТАТЕЛЬНАЯ СРЕДА ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ ИЗ БИОМАТЕРИАЛА ЖИВОТНЫХ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ МИКОБАКТЕРИЙ ТУБЕРКУЛЕЗА, содержащая яйца куриные, желтки куриных яиц, молоко, картофельный отвар, пептон, глицерин, калий фосфорнокислый двузамещенный, натрий лимонно-кислый, магний сернокислый, малахитовый зеленый и дистиллированную воду, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит тетрадекан, или пентадекан, или гексадекан при следующем соотношении компонентов:
Яйка куриные, г 400,0 500,0
Желтки куриных яиц, г 90,0 100,0
Молоко, мл 140,0 160,0
Картофельный отвар, мл 140,0 160,0
Малахитовый зеленый, г 0,2 0,25
Калий фосфорнокислый двузамещенный, г 0,14 0,16
Натрий лимоннокислый, г 0,14 0,16
Магний сернокислый, г 0,14 0,16
Пептон, г 0,8 1,0
Глицерин, г 3,2 4,0
Тетрадекан, или пентадекан, или гексадекан, г 15,3 30,6
Дистиллированная вода, л До 1,0

РИСУНКИ

Рисунок 1