Способ выявления бактерий pasteurella multocida при пастереллезном процессе у птиц

 

Область использования: ветеринарная микробиология. Сущность изобретения: в способе выявления бактерий Pasteurella multocida биполярные инкапсулированные бактерии пастерелл из патологического материала наносят на слизистую оболочку небной щели птиц, затем готовят препараты через 10 - 15 мин после заражения из слизи с места аппликации и прилегающих верхних дыхательных путей, а также из плазмы крови и эритроцитов при септицемии, в момент агонии и на протяжении 1 - 4 посмертного часа и выявляют пастереллы в препаратах, если через 10 - 15 мин после заражения и при септицемии бактерии находятся в коккоподобной бескапсульной форме, в момент агонии и на протяжении первого посмертного часа - в кокко- и диплококкоподобной слабо инкапсулированной формах, через три посмертных часа - в виде биполярной равномерно сформированной псевдопалочки, являющейся морфолабильной структурой из двух микробных клеток в состоянии выраженной инкапсуляции, а через четыре и более посмертных часа - в виде псевдопалочки с признаками полиморфизма.

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и может быть применено в целях индикации бактерий Pasteurella multocida при диагностике заболевания у птиц и при идентификации микроорганизмов.

Известно, что в препаратах, приготовленных из патологического материала, пастереллы опознают посредством световой микроскопии обычно в виде биполярно окрашенных палочек (R.S. Breed et al. 1957; Н.М.Никифорова, 1971; A.Mulbagal, 1972 и др. ). Однако биполярное окрашивание их как ценное диагностическое свойство выражено не всегда и остается невыясненным (Е.И.Буткин, 1972; Г. Ф.Бовкун, 1976). Считают, что величина и форма палочек варьируют в зависимости от зоологического происхождения штаммов (J.E.Smith, 1958). Вместе с тем известно, что связывать морфологию пастерелл с происхождением штаммов трудно, так как в тканях и крови животных и птиц микроорганизм представляет собой маленькую, короткую, овоидную бактерию, а в культурах он полиморфный: коккообразные формы (моно- и диплококки) присутствуют чаще, овоидные и гигантские палочковидные формы (обычно при просмотре слабо- и авирулентных штаммов) изредка (S.D.Henriksen, K.Jyssum, 1961; Н.М.Никифорова, 1971; Е. И. Буткин, 1972). Причем в культурах содержатся фильтрующиеся формы (И.А. Даньшев, 1958), "доклеточные" формы (А.В.Масюков, И.Я.Глебова, 1971). Капсулу у пастерелл рассматривают как один из таксономических признаков, хотя вопрос как она образуется и почему далеко не всегда выявляется остается нерешенным (J.E.Smith, 1958; И.В.Домарадский, 1971). Следовательно, пастереллы сами по себе морфолабильны. Ввиду того, что динамика и условия морфологической изменчивости микробной клетки этих бактерий не изучены индикация их является еще несовершенной.

За прототип взят общепринятый способ индикации пастерелл в патологическом материале от павших и клинически больных птиц посредством световой микроскопии мазков-отпечатков из паренхиматозных органов и мазков крови, окрашенных по Романовскому-Гимза, Граму и Гинсу. Существенным недостатком этого способа является неточное определение морфологических признаков у пастерелл по причине спонтанного отбора патологического материала для приготовления препаратов.

Задачей изобретения является повышение точности индикации бактерий Pasteurella multocida при пастереллезном процессе у птиц путем уточнения их морфологии при размножении в организме и трупах птиц с учетом объясняется феномена биполярного окрашивания и определения капсулообразования.

Поставленная задача достигается тем, что при естественном заражении птиц (орально) пастереллезом посредством инфицирования их пастереллами в состоянии биполярности и выраженной инкапсуляции эти бактерии через 10-15 мин в слизи на слизистой оболочке ротовой полости и прилегающих верхних дыхательных путей, затем при септицемии (особенно в период термильных состояний организма) в плазме крови и на эритроцитах микроскопически опознают в виде коккоподобной бескапсульной, с момента агонии и на протяжении первого посмертного часа в кокко- и диплококкоподобной слабоинкапсулированных формах, через 3 посмертных часа в виде биполярной, равномерно сформированной псевдопалочки, являющейся морфолабильной структурой из двух микробных клеток в состоянии выраженной инкапсуляции, через 4 и более посмертных часов с признаками полиморфизма. Биполярную структуру пастерелл легко установить как результат парного расположения коккоподобных бактерий, если внести патологический материал (например, крови из сердца от павшей птицы) в физраствор, в жидкие питательные среды или в обычную воду и сразу, слегка встряхнув содержимое, приготовить из надосадочной жидкости препараты для микроскопии.

Существенным отличием является то, что у павших от пастереллеза птиц целенаправленно во времени отбирают патологический материал, готовят на предметных стеклах мазки и посредством известных методов окрашивания и световой микроскопии препаратов обнаруживают в трупах через 3 посмертных часа возбудитель болезни в виде биполярной, равномерно сформированной псевдопалочки, являющейся морфолабильной структурой из двух микробных клеток в состоянии наиболее выраженной инкапсуляции, способных быстро разъединяться (распад микробной структуры) в различных жидких средах или при внедрении в макроорганизм и из полумесячных по форме стать шаровидными (коккоподобными).

Примеры конкретного выполнения. В исследованиях применяли типичный возбудитель пастереллеза птиц Pasteurella multocida серовара А:I, в частности, коллекционированные в разное время и из разных регионов штаммы: Х-73 эталонный из коллекции Хеддлестоуна, N 115, 712, 915, 1931, 55 контрольно-производственные из коллекции ВГНКИ ветпрепаратов и пять вирулентных полевых. Этот микроорганизм наиболее распространен и повсеместно вызывает пастереллез птиц (по нашим данным в 89% случаев энзоотий).

П р и м е р 1. При выраженной биполярной структуре пастерелл в трупе птицы через 3 посмертных часа брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных цыплят и голубей. Через 5, 10 и 15 мин брали бактериологической петлей слизь с места аппликации бактерий у птиц и переносили в каплю физраствора на предметном стекле, готовили мазки, их после подсыхания фиксировали и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимза. Посредством световой микроскопии приготовленных препаратов обнаруживали в слизи с небной щели птиц (в основном через 10-15 мин с момента заражения) грамотрицательные, не окрашивающиеся биполярно мелкие коккоподобные бактерии. Всего поставлено 20 биопроб и результаты микроскопических исследований были аналогичными. Вместе с тем этот же материал вносили в физраствор, в жидкие питательные среды МПБ, бульон Хоттингера), в обычную воду и сразу, слегка встряхнув содержимое в пробирках, приготавливали из надосадочной жидкости препараты при тех же методах окраски. Аналогично и в этих случаях обнаруживали грамотрицательные, не окрашивающиеся биполярно коккоподобные бактерии. Причем, если бактерии пребывали в этих жидкостях очень мало (например, 5-10 с), то при микроскопии приготовленных препаратов обнаруживали среди оформившихся в коккоподобные и диплококкоподобные, как неуспевшие разъединиться самостоятельные бактерии. Следовательно, феномен "биполярность" это не результат интенсивного окрашивания полюсов микробной клетки, а ни что иное, как попарно расположенные бактерии, из которых каждая вся окрашенная особь, принимаемая ошибочно как бы за полюс, по форме полумесяца и является самостоятельной. Биполяр это не палочка, а морфолабильная структура, состоящая из двух микробных клеток, способных быстро разъединяться (распад микробной структуры) в жидких средах или при внедрении в макроорганизм и из полумесячных оформляться в шаровидные (коккоподобные).

П р и м е р 2. При выраженной биполярной структуре пастерелл в трупе птицы через 3 посмертных часа брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных цыплят и голубей. При развитии септицемии, в частности в период терминальных состояний организма птиц, брали из крыльцовой вены пробы крови и готовили на предметных стеклах мазки. От павших птиц брали кровь из сердца на протяжении 3 посмертных часов через каждые 15 мин, далее через каждый час до 10 посмертных часов и также готовили на предметных стеклах мазки. Мазки фиксировали и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимза. Посредством световой микроскопии приготовленных препаратов обнаруживали при септицемии (особенно в период терминальных состояний организма птиц) в плазме крови и на эритроцитах возбудитель пастереллеза в виде коккоподобной, с момента агонии и на протяжении первого посмертного часа в кокко- и диплококкоподобной, на протяжении последующих трех часов в виде развивающейся биполярной, как правило, равномерно сформированной через 3 посмертных часа, а через 4 и более посмертных часов в виде разных по величине (полиморфных) коккоподобной и биполярной формах. Всего поставлено 25 биопроб и в проведенных при них микроскопических исследованиях получены аналогичные результаты. Исходя из полученных результатов следует, что биполярная структура формируется с момента агонии, начиная с диплококкоподобного формирования у малой части бактерий, и далее после летальности организма птиц на протяжении трех посмертных часов, причем сформировывается равномерная и наиболее выраженная через 3 посмертных часа.

П р и м е р 3. При выраженной биполярной структуре пастерелл в трупе голубя через 3 посмертных часа брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных цыплят-бройлеров и голубей. Птиц вскрывали в момент агонии, из сердца брали кровь и стабилизировали ее гепарином (конечная концентрация его 0,5%). Через каждые 10 мин на протяжении первого посмертного часа, а затем через 2 и 3 посмертных часа пробы собранной крови центрифугировали при 3 тыс. об/мин 3 мин, из плазмы крови готовили на предметных стеклах мазки, а эритроциты отмывали путем центрифугирования на фосфатно-буферном физрастворе (рН 7,0) при объемном соотношении 1: 5 и из их взвеси при таком же соотношении готовили на предметных стеклах мазки. Мазки фиксировали и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимза. Посредством световой микроскопии приготовленных препаратов обнаруживали на протяжении 30 посмертных минут в пробах стабилизированной крови, в частности в плазме, очень маленькие кокковидные бактерии; через 30-40 посмертных минут устанавливали выраженный лизис эритроцитов при отмывании их на физрастворе. При микроскопии ядра лизированных эритроцитов обнаружены округлыми и окрашенными в светло-розовый цвет, тогда как у нелизированных (целых по форме) и у эритроцитов от интактных птиц (контрольные) ядра были обычной формы и окрашенными в синий цвет, цитоплазма в розовый. При этом в препаратах из проб материала (особенно через 1 посмертный час, когда отмечался полный лизис эритроцитов на физрастворе), приготовленных из надосадочной жидкости, обнаруживали при микроскопии маленькие коккоподобные бактерии в большом количестве (под микроскопом при незначительном вращении микровинта). Вместе с тем в препаратах, приготовленных из проб крови через 2 и особенно через 3 посмертных часа, обнаруживали пастереллы в форме выраженной биполярности, тогда как в препаратах, приготовленных из надосадочной жидкости в пробах лизированных эритроцитов, устанавливали коккоподобные бактерии, расположенные чаще одиночно и изредка диплококкоподобно. Микроскопические исследования проведены при 11 биопробах и результаты получены аналогичные. Следовательно, свободный лизис эритроцитов, выраженный через 30-60 посмертных минут при внесении инфицированной крови на физраствор, вызываемый маленькими кокковидными пастереллами, а также свободный распад биполярной структуры пастерелл соответственно на две коккоподобной формы бактерии свидетельствуют о том, что возбудитель пастереллеза птиц это не биполярная палочка, а коккобактерия, расположенная одиночно и попарно.

П р и м е р 4. При выраженной биполярности возбудителя пастереллеза (то есть, при равномерно сформированной структуре из двух бактерий) в трупе голубя через 3 посмертных часа брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных цыплят и голубей. При развитии септицемии, в частности в период терминальных состояний организма птиц, брали из крыльцовой вены пробы крови и готовили на предметных стеклах мазки. От павших птиц брали кровь из сердца на протяжении 4 посмертных часов через каждые 15 мин, далее через каждый час до 10 посмертных часов и также готовили на предметных стеклах мазки. Мазки окрашивали по способам Грама, Романовского-Гимза (на феномен "биполярность") и Гинса (на феномен "инкапсулирование" у бактерий) и изучали при помощи световой микроскопии. Морфология пастерелл в препаратах, окрашенных по Граму и по Романовскому-Гимза, аналогична описанной в примере 2. (С. 4-5). Посредством световой микроскопии препаратов, окрашенных тушью по способу Гинса, устанавливали развитие капсулы у пастерелл с момента агонии у зараженных птиц, а полное формирование ее только в трупах птиц. При этом бактерии в трупах птиц на протяжении первого посмертного часа инкапсулировали слабо, на протяжении второго часа средне, а с третьего по четвертый посмертный час были инкапсулированы, как правило, наиболее выраженно. Через 4 и более посмертных часов это свойство у пастерелл в трупах птиц ослабевало и было нестабильным. Всего поставлено 25 биопроб и в проведенных при них микроскопических исследованиях получены аналогичные результаты, которые свидетельствуют, что морфологические признаки у пастерелл капсула и биполярность развиваются в трупах птиц одновременно, причем наиболее и равномерно выражены не ранее чем через 3 и не позже через 4 посмертных часа. При этом очевидно, что объединяющим материалом для каждой пары бактерий в виде биполяра, образовавшихся в результате деления каждой материнской, является капсульное вещество.

П р и м е р 5. При равной выраженности биполярной структуры пастерелл в трупе голубя через 3 и неравной через 8 посмертных часов брали патологический материал (кровь из сердца) и наносили на слизистую оболочку небной щели интактных голубей. Через 10-15 мин после аппликации пастерелл брали бактериологической петлей слизь с небной щели птиц и готовили на предметных стеклах мазки. В последующем при септицемии, в частности в период терминальных состояний организма птиц, брали из крыльцовой вены, а в момент летальности из сердца пробы крови и приготавливали на предметных стеклах мазки. Мазки фиксировали и окрашивали по Граму и Романовскому-Гимза. Микроскопические исследования провели на примере контрольно-производственного штамма пастерелл N 55 при шести биопробах на голубях (по 3 птицы на каждую из двух проб изучаемого патологического материала). Результаты биопроб по заражающим пробам патологического материала от одного и того же трупа и соответственно проведенных при них микроскопических исследований получены неодинаковые бактерии коккоподобной формы отличались по величине, причем формирование микробной биполярной структуры в трупах птиц на протяжении трех посмертных часов проходило с разной скоростью. Так, посредством световой микроскопии препаратов, приготовленных из слизи с небной щели птиц, зараженных пробой патологического материала с периодом 3 посмертных часа устанавливали маленькие одинаковые по величине коккоподобные бактерии, тогда как в мазках из слизи от птиц, зараженных пробой патологического материала с периодом 8 посмертных часов, обнаруживали большие, средние и маленькие по величине коккоподобные бактерии. В первом случае поставленных биопроб (заражающим материалом с периодом 3 посмертных часа) обнаруживали на уровне микроскопических исследований в период септицемии, в частности при терминальных состояниях организма птиц, маленькие коккоподобные, в период агонии у птиц и на протяжении первого посмертного часа маленькие и средней величины коккоподобные, сравнительно изредка и диплококкоподобные формы, а через 2 и особенно через 3 посмертных часа в виде равномерно развитой и выраженной биполярной структуры бактерий. При другом случае поставленных биопроб (заражающим материалом с периодом 8 посмертных часов) обнаруживали посредством микроскопических исследований при септицемии коккоподобной формы бактерии, отличающиеся по величине: большие и средние чаще, маленькие реже; в период агонии у птиц кокко- и диплококкоподобной формы бактерии, обычно большие и средние по величине; в трупах птиц на протяжении первого и второго посмертных часов коккоподобные формы бактерий и микробные биполярные структуры отличающиеся по величине и только между третьим и четвертым посмертными часами отмечали равномерно развитые и выраженные микробные биполярные структуры. В первом случае постановки биопроб голуби погибали через 12-14, во втором через 24-36 часов с момента заражения. Следовательно, величина коккоподобных бактерий, формирование микробной биполярной структуры во времени зависят от состояния исходных для биопроб пастерелл из патологического материала от павших птиц с разным посмертным периодом. Причем равномерность и выpаженность свойства микробной биполярности достигается в каждом конкретном случае при исследовании патологического материала от павших в результате естественного заражения птиц с посмертным периодом не ранее чем через 3 и не позже чем через 4 посмертных часа.

Формула изобретения

СПОСОБ ВЫЯВЛЕНИЯ БАКТЕРИЙ PASTEURELLA MULTOCIDA ПРИ ПАСТЕРЕЛЛЕЗНОМ ПРОЦЕССЕ У ПТИЦ, включающий приготовление препаратов из патологического материала, их окрашивание и микроскопию с последующей идентификацией, отличающийся тем, что биполярные инкапсулированные бактерии пастерелл из патологического материала наносят на слизистую оболочку небной щели птиц, затем готовят препараты через 10 - 15 мин после заражения из слизи с места аппликации и прилегающих верхних дыхательных путей, а также из плазмы крови и эритроцитов при септицемии в момент агонии и на протяжении 1 - 4 посмертного часа и выявляют пастерелы в препаратах, если через 10 - 15 мин после заражения и при септицемии бактерии находятся в коккоподобной бескапсульной форме, в момент агонии и на протяжении первого посмертного часа - в кокко- и диплококкоподобной слабоинкапсулированной формах, через три посмертных часа - в виде биполярной равномерно сформированной псевдопалочки, являющейся морфолабильной структурой из двух микробных клеток в состоянии выраженной инкапсуляции, а через четыре и более посмертных часа - в виде псевдопалочки с признаками полиморфизма.