Рекомбинантная плазмидная днк psv-dep-poly-neo, кодирующая эритропоэтин человека, штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка сно-ре - продуцент эритропоэтина человека
Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к генной и клеточной инженерии, представляет интерес для получения рекомбинантного эритропоэтина (ЭП) человека, который может быть использован в медицинских и исследовательских целях. Сущность изобретения: путем клонирования Hind III - Bgl II фрагмента геномной человеческой ДНК, включающего полноразмерный ген эритропоэтина, в составе плазмиды pSV2gpt, удаления нетранслируемой 5'-фланкирующей области гена, добавления сигнала сплайсинга и сайта полиаденилирования ранних генов обезьяньего вируса SV40, а также слияния с ДНК pSV2neo получена рекомбинатная плазмида pSV-dEp-poly-NeO, обеспечивающая синтез в животных клетках рекомбинантного эритропоэтина человека. Путем контрансфекции плазмидами pSV-dEp-poly-NeO и pTKI (кодирует активную тимидин киназу вируса простого герпеса) культивируемых клеток китайского хомячка CHOtk-, проведения селекции трансфектантов в среде, содержащей антибиотик G 418, и последующей амплификации интегрированных последовательностей в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), получен штамм-продуцент СНО-РЕ, обеспечивающий синтез и секрецию в культуральную жидкость рекомбинантного эритропоэтина человека с выходом до 4 мг/л при стационарном культивировании. Полученный рекомбинантный гормон может быть использован в медицинских и исследовательских целях. 2 с.п. ф-лы, 5 ил.
Изобретение относится к биотехнологии и молекулярной биологии, а именно к генной и клеточной инженерии, представляет интерес для получения рекомбинантного эритропоэтина (ЭП) человека, который может быть использован в медицинских и исследовательских целях.
В литературе описано несколько работ по экспрессии гена ЭП в животных клетках и по созданию штаммов-продуцентов рекомбинантного ЭП на основе клеток грызунов и приматов. Однако продуценты на основе линии клеток CHO (клетки яичника китайского хомячка) созданы лишь двумя группами исследователей. Авторы работ [1, 2] сконструировали плазмиду pDSVL-gHuEPO, содержащую полноразмерный ген ЭП человека под контролем промотора поздних генов вируса SV40, а также миниген дигидрофолат редуктазы (DHFR) мыши. После трансфекции экспрессирующим вектором pDSVL-gHuEPO клеток линии CHOdhfr- [3] и селекции в среде без нуклеозидов авторы получили клеточный клон, секретирующий рекомбинантный ЭП в культуральную жидкость c выходом 18,2 единицы активности (ед. акт. ) на мл. Путем проведения нескольких раундов амплификации в присутствии возрастающих концентраций метотрексата был получен штамм-продуцент, стабильно секретирующий ЭП с выходом до 100 ед.акт./мл. Авторы патента [4] для получения продуцента ЭП cконструировали плазмиду pRKEL13, содержащую кДНК гена ЭП под контролем основного позднего промотора аденовируса, сайт полиаденилирования, энхансер и участок инициации репликации вируса SV40, вирус-ассоциированный ген аденовируса, а также ген DHFR под контролем раннего промотора SV40. Путем трансфекции плазмидой pRKFL13 клеток CHOdhfr- [3] последующей селекцией трансфектантов в среде без нуклеотидов, а также проведения трех раундов амплификации в среде с метотрексатом, авторам удалось получить штамм-продуцент ЭП, секретирующий гормон с выходом до 50 ед/мл. К недостаткам описанных аналогов следует отнести невысокие уровни секреции рекомбинантного ЭП клетками-продуцентами, что значительно усложняет процедуры выделения и очистки гормона и делает продукт более дорогим. В качестве прототипа выбраны плазмидная ДНК pSVEpoI и штамм культивируемых клеток китайского хомячка BCKK(П) N16D2 продуцент ЭП человека, описанные в работе [5] Плазмида pSVEpoI получена путем клонирования HidIII BglII ДНК-фрагмента, длиной 3 тысячи нуклеотидных пар (т.н.п.), содержащего полный ген ЭП человека в составе вектора pSV2gpt [6, 7] по сайтам рестрикции HindIII и BamHI. Путем трансфекции рекомбинантной плазмидой pSVEpol клеток яичника китайского хомячка CHOtk- и последующей селекции трансфектантов в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ), авторами отобран клон клеток CHO Epol, клетки которого стабильно продуцируют ЭП в культуральную среду с выходом до 10 12 ед.акт./мл. Недостатком штамма-продуцента, выбранного в качестве прототипа, является низкая продуктивность, что делает проблематичным его использование при крупномасштабном получении рекомбинантного ЭП человека. Недостатком рекомбинантной плазмиды-прототипа pSVpol является наличие протяженной 5'-фланкирующей области гена ЭП, которая отделяет промотор ранних генов обезьяньего вируса SV40 от первого экзона ЭП-гена [1] а также отсутствие в составе плазмиды эффективного сигнала сплайсинга и сайта полиаденилирования вслед за ЭП геном. Неоптимальное строение использованной генетической конструкции, по-видимому, и определяет низкий уровень продукции рекомбинантного ЭП в клетках-продуцентах. Цель изобретения упрощение и удешевление процессов получения рекомбинантного эритропоэтина человека за счет повышения уровня биологического синтеза эритропоэтина клетками-продуцентами. Цель достигается конструированием рекомбинантной плазмиды pSV-dEp-poly-Neo, в которой промотор ранних генов вируса SV40 приближен к структурной части полноразмерного гена ЭП человека, и в которой сразу за ЭП геном находится сигнал сплайсинга и сайт полиаденилирования ранней области вируса SV40. Такое сочетание регуляторных элементов определяет высокий уровень экспреcсии гена ЭП и эффективность синтеза рекомбинантного гормона в животных клетках. Цель достигается также за счет наличия в составе плазмиды pSV-dEp-poly-Neo активного гена аминогликозид-3'-фосфотрансферазы (neo), позволяющего проводить отбор трансфектантов в среде, содержащей антибиотик генетицин (G481). Цель достигается также одновременным использованием для трансфекции клеток линии CHOtk- плазмид pSV-dEp-poly-Neo и pTK1, первая из которых содержит ген ЭП и ген устойчивости к G418 (neo), а вторая активный ген тимидинкиназы вируса простого геpпеса [8] Использование для котрансфекции ДНК pTK1 позволяет проводить амплификацию чужеродных последовательностей, интегрированных в геном клетки, в среде, содержащей гипоксантин, аминоптерин и тимидин (ГАТ). Сочетание процессов трансфекции, селекции и амплификации позволяет получить линию клеток продуцентов CHO-PE, содержащих в своем геноме интегрированные копии гена ЭП и стабильно секретирующих рекомбинантный гормон в культуральную жидкость. Штамм-продуцент CHO-PE отличается от исходного штамма СHOtk- тем, что содержит интегрированные в геном копии плазмиды pSV-dEp-poly-Neo. Полученный штамм характеризуется следующими признаками: 1. Морфологические признаки. Культура представлена эпителиоподобными и веретеновидными клетками с крупными ядрами неправильной формы, содержащими от одного до трех ядрышек. Цитоплазма зернистая, вакуолизированная. 2. Культуральные признаки. Штамм COH-PE поддерживается на смеси отечественных сред Игла МЕМ (45%) и 199 (45%) с добавлением 10% сыворотки крупного рогатого скота (КРС), содержащей гипоксантин в концентрации 100 мкМ, аминоптерин 20 мкМ, и тимидин 100 мкМ (ГАТ). Клетки субстратзависимы, склонны к неравномерному росту, образуют многослойные островки. Отделение клеток от стекла или пластика проводят смесью 0,02% версена (2/3) и 0,25% трипсина (1/3), кратность рассева 1:4, посевная доза 100 тыс. клеток в 1 мл. Плотного монослоя культура достигает через 3 суток после посева. 3. Устойчивость к антибиотикам. Штамм проявляет устойчивость к генетицину (G418) в концентрации до 1 мг/мл, обусловленную наличием интегрированных в геном последовательностей ДНК. 4. Криоконсервация. Криоконсервирование проводят на среде Игла МЕМ (40%), 199 (40%) с добавлением 10% КРС. ГАТ и 10% глицерина в качестве криопротектора. Концентрация клеток 1 2 млн. в 1 мл. Жизнеспособными после восстановления остаются 95% клеток. 5. Кариологическая характеристика. Кариологический анализ штамма CHO-PE проводят на 10 и 20 пассажах. Модальный класс клеточной линии определен подсчетом числа хромосом в 100 метафазных пластинках. Распределение клеток по числу хромосом следующее: 28 хромосом 4 клетки, 29 хромосом 6 клеток, 30 хромосом 12 клеток, 31 хромосома 18 клеток, 32 хромосомы 17 клеток, 33 хромосомы 38 клеток, 34 хромосомы 3 клетки, 36 хромосом 1 клетка, 42 хромосомы 1 клетка. Модальный класс 33 хромосомы, 2n=22. 6. Контроль видовой идентичности. Соответствие виду подтверждается с помощью анализа электрофоретической подвижности изоферментов глюкозо-6-фосфат дегидрогеназы и лактатдегидрогеназы в полиакриламидном геле (ПААГ). Клетки имеют изоферментный набор, характерный для клеток китайского хомячка. 7. Контаминация. При обследовании клеток штамма на стерильность (наличие бактерий, грибов, и микоплазмы) получают отрицательные результаты на уровнях 10 и 20 пассажей. Предложенная рекомбинантная плазмида pSV-dEp-poly-Neo и штамм культивируемых клеток китайского хомячка СHO-PE в советской и зарубежной литературе не описаны, следовательно они обладают существенными отличиями. Штамм депонирован в Специализированной коллекции перевиваемых соматических клеток позвоночных Всесоюзной коллекции клеточных культур под номером ВСКК/П/626Д. На фиг. 1. дано графическое изображение фрагмента геномной ДНК человека, содержащего ген ЭП. a структурная организация гена. Прямоугольникам I-V обозначены экзоны, темными блоками кодирующие области. б рестрикционная карта гена. Отмечены сайты узнавания рестриктаз: BgIII (B), BstEII (E), HindIII (H), KpnI (K), SmaI (S), XbaI (X). Цифрами обозначены размеры в т.н.п. На фиг. 2-4 схема конструирования плазмидной ДНК pSV-dEp-poly-Neo, а также генетическая карта плазмиды pSV-dEp-poly-Neo. Светлыми блоками обозначены ДНК-последовательности вируса SV40, темными блоками районы гена ксантин-гуанин фосфорибозил трансферазы E.coli(gpt), штриховкой ген ЭП, двойной штриховкой ген neo, тонкой линией - ДНК-фрагменты плазмиды pBR322. Отмечены бактериальный ген бета-лактамазы (Ampr), сайты инициации репликации (ori) pBR322 и вируса SV40, промотор ранних генов вируса SV40 (SVE). Стрелками указаны направления транскрипции генов. На фиг. 5 электрофоретический анализ препарата рекомбинантного эритропоэтина человека в 13%-ном полиакриламидном геле (ПААГ) в восстанавливающих условиях (окраски кумасси). 1 3 белковые маркеры молекулярных весов; 4 препарат эритропоэтина. Пример 1. Конструирование рекомбинантной плазмиды pSVdEp-poly-Neo. В качестве источника генетических последовательностей, кодирующих ЭП человека, используют плазмиду pBR-Epo, которая содержит EcoRI-фрагмент геномной ДНК человека длиной 12 13 т.н.п. [9] Клетки бактерий Escherichia coli (E. coli) штамма HB101, трансформированные плазмидой pBR-Epo и клетки бактерий E. coli HB101, трансформированные плазмидой pSV2gpt [6] выращивают в одном литре среды LB [10] с ампициллином в концентрации 50 мкг/мл в течение 20 ч. Клетки осаждают центрифугированием (5000 g, 5 мин, 4oC и выделяют из них плазмидные ДНК как описано в работе [11] Полученные препараты ДНК плазмид pBR-Epo и pSV2gpt используют для конструирования плазмиды pSV-Ep-gpt (схема на фиг. 2-4), которое проводят следующим образом. Осуществляют гидролиз 60 мкг ДНК pBR-Epo эндонуклеазами рестрикции HindIII и BglII в буфере, содержащем 0,01 М Трис-HСl; pH 8; 0,01 M MgCl2, 0,05 M NaCl, 1мM -- меркаптоэтанол. Аналогичным образом проводят гидролиз 20 мкг ДНК pSV2gpt. Гидролизаты плазмид подвергают электрофорезу в 1% -ном агарозном геле в трис-боратном буфере, гель прокрашивают бромистым этидием и под длинноволновым ультрафиолетовым облучением (УФО) вырезают полосу, соответствующую линейной ДНК, для HindIII-BglII гидролизата pSV2gpt и полосу, соответствующую фрагменту 2961 н.п. для HindIII-BglII гидролизата pBR-EPO. Фрагменты ДНК выделяют из кусочков геля электроэлюцией на бумажные диски DE-81 (Whatman, СШA) в 0,01 М трис-боратном буфере, рН 8,3, при 350 В в течение 2 3 ч, ДНК с дисков смывают 1,5 M NaCl, 0,01 М трис-HCl, pH7,5,1 мМ ЭДТА (4 х 20 мкл) в течение 40 сек при 56oC, осаждают этанолом. Осадки промывают спиртом, высушивают, растворяют в 10 мкл воды. Выделенный HindIII-BglII фрагмент длиной 2961 н.п. (1 пмоль) смешивают с 0,2 пмоль линейной векторной ДНК pSVgpt в 30 мкл раствора, содержащего 66 мМ Трис-HCl, pH 7,5 5 мМ MgCl2, 5 мМ дитиотреит (ДТТ), 1 мМ АТФ, 14 ед. акт. ДНК-лигазы фага Т4. Реакцию проводят при 8o C в течение 20 ч. Аликвоты лигазной смеси используют для трансформации компетентных клеток E.coli HB101, как описано в работе [12] Трансформированные клетки высевают на чашки с твердым агаром, содержащем ампициллин (50 мкг/мл), и растят 18 ч при 37oC. Выросшие колонии скалывают в 5 мл среды LB, содержащей ампициллин (5 мкг/мл), инкубируют при 37oC и интенсивном встряхивании в течение 18 ч. Клетки отделяют центрифугированием, из них выделяют плазмидную ДНК для последующего рестрикционного анализа. Плазмида, дающая при совместном гидролизе рестриктазами HindIII и BglII фрагмент величиной 3 т.н.п. получила название pSV-Ep-gpt (фиг. 2). Путем гидролиза ДНК pSV-Ep-gpt рестриктазами HindIII и BstEII, достройки образующихся 5'-выступающих концов с помощью большого фрагмента (фрагмент Кленова) ДНК-полимеразы I E.coli в условиях [13] и последующего лигирования получают плазмиду pSV-dEp-gpt, несущую делецию 5'-фланкирующей области гена эритропоэтина (584 н.п.). Для удаления из состава плазмиды pSV-dEp-gpt гена ксантин-гуанин фосфорибозил трансферазы E.coli (gpt) осуществляют BglII-гидролиз ДНК pSV-dEp-gpt, 5'-выступающие концы достраивают до тупых с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E. coli, проводят рестрикцию BamHI. Фрагменты рестрикции разделяют электрофорезом в 4%-ном ПААГ в трис-боратном буфере, большой фрагмент (векторную ДНК) элюируют, как описано выше. Путем гидролиза ДНК pSV2gpt рестриктазой Bsp120I, достройки 5'-выступающих концов, последующей рестрикцией BamHI, электрофорезом в 4%-ном ПААГ и электроэлюцией выделяют фрагмент длиной 850 н.п. содержащий сигнал сплайсинга и сайт полиаденилирования ранней области вируса SV40. Путем клонирования выделенного фрагмента 850 н.п. в составе векторной ДНК pSV-dEp-gpt, обработанной BglII, фрагментом Кленова и BamHI, получают плазмиду pSV-dEp-poly. Для получения плазмиды pSV-dEp-poly-Neo ДНК pSV-dEp-poly гидролизуют рестриктазой EcoRI и лигируют с EcoRI-линеаризованной ДНК pSV2neo, несущей ген аминогликозид-3'-фосфотрансферазы (neo) под контролем промотора ранних генов SV40 [14] Ориентацию гена neo в составе ДНК pSV-dEp-poly-Neo определяют гидролизом плазмиды рестриктазой BamHI. Пример 2. Транзиентная экспрессия гена эритропоэтина в клетках почки обезьяны. Для оценки качества генетической конструкции pSV-dEp-poly-Neo проводят анализ транзиентной экспрессии гена эритропоэтина человека в клетках обезьяны линии COS-7 [15] Клетки пассируют в среде Игла МЕМ, содержащей 10% эмбриональной телячьей сыворотки (ЭТС). Для трансфекции 5 мл клеточной суспензии (1 млн клеток) засевают в культуральные флаконы площадью 25 кв. см и через 16 20 ч среду заменяют на 5 мл свежей ростовой среды. Через 3 ч к клеткам добавляют плазмидную ДНК в виде кальций-фосфатного преципитата. Преципитат готовят следующим образом: при комнатной температуре во флакон А вносят 5 мкг ДНК плазмиды pSV-dEp-poly-Neo, 31 мкл 2 М CaCl2 и воды до 0,25 мл. Во флакон 8 вносят 0,5 мл буфера НВ (0,3 М NaCl, 50 мM Hepes, 2,8мM Na2HPO4, pH 7,1). Содержимое флакона А по каплям добавляют к содержимому флакона В, что приводит к образованию полупрозрачного преципитата, 0,5 мл преципитата наносят к образованию полупрозрачного преципитата, 0,5 мл преципитата наносят на монослой клеток СOS-7 и инкубируют при 37oC в течение 16 ч. Клетки отмывают 5 мл среды Игла MEM и заливают свежей ростовой средой. Через 48 ч культуральную жидкость сливают и анализируют на наличие ЭП-активности. Наличие эритропоэтина в культуральной жидкости определяют по включению in vitro тритий-меченого тимидина в растущие спленоциты мышей с фенилгидразиновой анемией [16] Анализ проводят следующим образом. Мышам линии С3Н/He весом 20 30 г вводят раствор фенилгидразина из расчета 60 мг на кг веса двухкратно через сутки. На третий день после последней инъекции стерильно извлекают селезенки и готовят суспензию спленоцитов с концентрацией 4 млн клеток на мл в среде RPMI 1640, содержащей 20% ЭТС. По 50 мкл клеточной суспензии вносят в лунки плоскодонного 96-луночного планшета, добавляют равный объем разведений тестируемого материала в ростовой среде. В качестве положительного контроля используют разведения стандартного образца ЭП с активностью 250 ед. акт. /мл производства Boehringer Mannheim (Австрия). В качестве отрицательного контроля служит среда культивирования. Планшет инкубируют в течение 22 ч при 37oC во влажной атмосфере, содержащей 5% CO2. Далее в каждую лунку вносят по 1 мкКи [3H]-тимидина в 20 мкл среды RPMI 1640. Инкубацию продолжают в тех же условиях в течение 2-х ч. Содержимое лунок переносят на стекловолоконные фильтры GF/C (Whatman, США) с помощью харвестера Titertek (Flow. США), промывают несколько раз водой. Фильтры высушивают на воздухе и просчитывают в толуольном сцинтилляторе на счетчике радиоактивности MarkIII (Beckman, США). Биологическую активность тестируемых проб оценивают путем сравнения с калибровочной кривой ЭП-стандарта. По данным 5-ти независимых экспериментов уровень секреции рекомбинантного ЭП в культуральную жидкость после трансфекции COS-клеток плазмидной pSV-dEp-poly-Neo составляет 2,60,6 ед.акт./мл. Пример 3. Получение штамма-продуцента CHO-PE. Для получения стабильного продуцента рекомбинантного ЭП человека проводят трансфекцию плазмидной pSV-dEp-poly-Neo клеток яичника китайского хомячка CHOtk-. Клетки CHOtk- культивируют в среде Игла (45%), 199 (45%), ЭТС (10%). Для трансфекции используют смесь ДНК pSV-dEp-poly-Neo (15 мкг) и pTK1 [8] (5 мкг). Трансфекцию проводят стандартным методом кальций-фосфатной преципитации, как описано в примере 2. Через 16 ч после трансфекции клетки отмывают и помещают в ростовую среду на 48 ч. Далее среду меняют на селективную, содержащую 0,5 мг/мл антибиотик G418 (генетицин). Клетки инкубируют в селективной среде в течение 2-х недель, смену среды проводят каждые трое суток. Через 14 дней после помещения в селективные условия формируются колонии, устойчивые к G418. Устойчивые клоны подращивают до достижения клетками монослоя и проводят вторую стадию селекции. Для этого ростовую среду меняют на селективную, содержащую Игла (45%), 199 (45%), ЭТС (10%), 100 мкМ гипоксантин, 20 мкМ аминоптерин и 100 мкМ тимидин (ГАТ). Устойчивые к ГАТ клоны отдельно культивируют в ростовой среде, секретируемый клетками эритропоэтин тестируют методом включения тритий-меченого тимидина в спленоциты анемических мышей, как описано в примере 2. Таким образом, отбирают клон CHO-PE, клетки которого стабильно продуцируют эритропоэтин в культуральную жидкость с выходом до 400 ед.акт. (4 мкг) на мл среды при стационарном культивировании. Методом дот-блот гибридизации показывают, что плазмида pSV-dEp-poly-Neo интегрирована в геном этих клеток. Пример 4. Выделение и характеризация рекомбинантного эритропоэтина. Культуральную жидкость после выращивания клеток-продуцентов CHO-PE в объеме 3000 мл фильтруют через бумажный фильтр, проводят последовательно концентрирование до объема 50 60 мл и диафильтрацию против 500 600 мл раствора 15 мМ трис-HCl, рН 7,0, содержащего 0,2 мМ сульфат меди и 0,02% твин-20 (буфер А) с использованием разделительного ультрафильтрационного аппарата на полых волокнах АР-0,2н производства ОКБ ТБМ г. Кириши. Полученный концентрат культуральной жидкости наносят на колонку с 50 мл ДЕАЕ-Сефарозы, уравновешенной буфером B (15 мМ трис-HСl pH 7,0, 0,02% твин-20). Колонку промывают последовательно 50 мл буфера A: 150 мл раствора 6 М мочевины, подкисленной уксусной кислотой до рН 4,5: 100 мл раствора 25 мМ NaCl в буфере B: 100 мл раствора 80 мМ NaCl в буфере B: 100 мл раствора 160 мМ NaCl в буфере В со скоростью 4 мл/мин. Фракции элюата собирают по оптической плотности, определяемой при длине волны 254 нм с помощью проточного УФ-денситометра и определяют их активность методом иммуноферментного анализа (ИФА) с использованием ЭП-специфической поликлональной кроличьей антисыворотки и конъюгата антивидовых антител (коза-антикролик) с пероксидазой хрена. Фракции, обладающие активностью в ИФА, объединяют и наносят на колонку 8 х 150 мм с обращеннофазовым широкопористым (диаметр пор 30 нм) сорбентом, содержащим бутильные группы, уравновешенную 5%-ным раствором ацетонитрила в 0,1%-ной трифторуксусной кислоте. Элюцию белков с колонки проводят линейным градиентом 5 90% ацетонитрила в течение 60 мин со скоростью 5 мл/мин. Фракции собирают, анализируют на наличие ЭП-активности, как описано выше, объединяют и концентрируют в три раза упариванием на ротационном иcпарителе Buchi (Швейцария). Полученный образец рехроматографируют на приведенной выше колонке с обращеннофазовым сорбентом. Фракции, элюирующиеся с колонки в 48 55%-ном ацетонитриле и обладающие ЭП-активностью, объединяют, упаривают на ротационном испарителе при 30oC, растворяют в 0,02 М цитрате натрия, рН 6,9, содержащем 0,1 М NaCl. Полученные образцы рекомбинантного эритропоэтина характеризуются следующими показателями: 1. Чистота и гомогенностью. гомогенность препарат не менее 90 95% (по данным гельэлектрофореза в 13% -ном полиакриламидном геле с денситометрией); отношение ОП280/ОП260=1,05; содержание агрегированной формы до 4,5% (по данным иммуноблоттинга и денситометрии электрофореграмм, окрашенных серебром); содержание примесей ДНК клеток-продуцентов не более 10 пг на 10000 ед. активности (по данным дот-блот гибридизации с использованием меченной радиоактивным фосфором суммарной ДНК клеток CHO-PE). 2. Идентичность. молекулярная масса 37500 Да (по данным гельэлектрофореза с белковыми маркерами молекулярных весов); удельная активность 150000 ед/мг (10000 ед/мл) (определена методом твердофазного ИФА); специфическая активность in vitro 200000 ед/мг (определена по включению [3H] -тимидина в растущие спленоциты мышей с фенилгидразиновой анемией по [16]);специфическая активность in vivo не менее 100000 ед/мг (определена путем подсчета числа ретикулоцитов в образцах крови мышей после введения им образцов ЭП по [17]);
аминокислотный состав соответствует расчетным данным (определен после гидролиза 6 н HCl, 110oC, 24 ч);
N-концевая последовательность A-P-P-R-L-I-C-D-S-R в 10 аминокислот соответствует литературным данным (определена методом Эдмана на автоматическом газофазном секвенаторе с идентификацией ФТГ-аминокислот методом ВЭЖХ). Полученный и охарактеризованный штамм-продуцент CHO-PЕ планируется использовать для промышленного получения рекомбинантного эритропоэтина человека.
Формула изобретения
ген bla, обеспечивающий синтез бета-лактамазы; ген neo, обеспечивающий синтез аминогликозид-3'-фосфотрансферазы; ген эритропоэтина, обеспечивающий синтез рекомбинантного эритропоэтина человека. 2. Штамм культивируемых клеток яичника китайского хомячка СНО-РЕ ВСКК(П)626Д продуцент эритропоэтина человека.
РИСУНКИ
Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5