Способ оценки радиационного воздействия

 

Изобретение относится к биотехнологии , в частности генетической инженерии, и может быть использовано для оценки радиационных облучений организма. Цель изобретения - упрощение способа и возможность осуществления способа в ранние сроки после радиационного воздействия. Изобретение основано на выявлении путем гибридизации низкомолекулярной фракции ДНК в плазме крови крыс после облучения. Изобретение заключается в создании рекомбинантной меченой 32Р бактериофаговой молекулы ДНК, содержащей у L-фрагмент, из плазменной фракции ДНК размером 0,18 т.п.о. Меченая рекомбинантная молекула служит в качестве ДНК-зонда в гмбридизационном анализе.

СОГОЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ

РЕСПУБЛИК (st)s С 12 N 15/12, 1/21

ГОСУДАРСТВЕННЫЙ КОМИТЕТ

ПО ИЗОБРЕТЕНИЯМ И ОТКРЫТИЯМ

ПРИ ГКНТ СССР

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕНИЯ .: К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ (21) 4779718/13 (22) 08.01.90 (46) 15.07.92. Бюл. N 26 (72) В.Г.Владимиров. А.С,Белохвостов, С,С.Шерлина, Т.В.Семухина и А.М.Воскресенский (53) 577.391 (088,8) (56) Медицинская радиология, 1986, т.31, M

9, с.30-35. (54) СПОСОБ ОЦЕНКИ РАДИАЦИОННОГО

ВОЗДЕЙСТВИЯ (57) Изобретение относится к биотехнологии, в частности генетической инженерии, и может быть использовано для оценки ради- ационных облучений организма. Цель иэоИзобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии, и может быть использовано для экспериментальной диагностики радиационных облучений организма.

Известен способ оценки радиационного воздействия с помощью выявления хромосомных аберраций в клетках облученного организма. Способ заключается в том, что клетки крови или других облучен ных тканей организма выдерживают in vitro с колхицином или другими агентами, останавливающими деление клеток в метафазе. После этого анализируют генетический материал клеток, а именно выявляют с помощью све тового микроскопа наличие или отсутствие хромосомных аберраций.

Сущность способа заключается в том, что появляется в крови после облучения низкомолекулярная ДНК размером 175-185 пар оснований (п,о,). отсутствующая у интактных животных, Эта фракция выявлена при

ÄÄ5UÄÄ 1747490 А1 бретения — упрощение способа и возможность осуществления способа в ранние сроки после радиационного воздействия.

Изобретение основано на выявлении путем гибридизации низкомолекулярной фракции ДНК в плазме крови крыс после облучения. Изобретение заключается в создании рекомбинантной меченой 32Р,бактериофаговой молекулй ДНК, содержащей у L-фрагмент, из плазменной фракции ДНК размером 0,18 т,п,о. Меченая рекомбинантная молекула служит в качестве ДНК-зонда в гибридизационном анализе. электрофорезе препаратов ДНК плазмы облученных крыс в градиентном (16 g полиакриламидном геле (ПАГ). При увеличении дозы у-облучения количество ниэкомолекулярной ДНК в плазме крыс возрастает уже через 2-5 ч после воздействия.. 4

Кроме того, с помощью реакции молекулярной гибридизации с хромосомной ДНК обнаружено, что низкомолекулярная фрак- Д, ция ДНК плазмы крови облученных крыс обогащена повторяющимися последовательностями по сравнению с геномной, В то же время высокомолекулярная

ДНК характеризуется случайными фрагментами. ° юай .Низкомолекулярную фракцию ДНК можно выделить, очистить, клонировать в бактериофаге М13, пометить фосфором 32Р и затем использовать для блот-гибридизации с образцами нуклеиновых кислот из плазмы крови крыс, подвергшихся у-облучению в различных дозах. Меченая 32Р низ1747490

20

30

40

55 комолекулярная фракция ДНК как самостоятельно, так и в составе рекомбинантной

ДНК бактериофага М13 гибридизуется преимущественно с низкомолекулярной, а не с высокомолекулярной ДНК, Таким образом, диагностическая ценность способа основана на выявлении низкомолекулярной фракции ДНК, отсутствующей у интактных животных.

Цель изобретения — упрощение способа и возможность оценки в ранние сроки после воздействия.

Для достижения цели используют ДНКзонд BS8-32Р. Для этого после обработки

RF-формы ДНК бактериофага M13mp8 рестриктазой большой фрагмент соединяют ферментом лигазой фаза Т4 с выделенным и очищенным у L-фрагментом низкомолекулярной ДНК плазмы облученных крыс. Обработанные раствором хлористого кальция на холоду клетки Е.co!i JM101 бактерий высевают на плотную среду, например LBагар (10 r триптона, 5 г дрожжевого экстракта, 10 г NaCI, 15 г агар-агара, до 1 л воды) с газоном чувствительных к бактериофагу М13 клеток Е,coli JM101. Среди сформированных инфекционных центров отбирают с помощью реакции молекулярной гибридизации клоны, несущие специфическую последовательность

)4 -фрагмента ДНК плазмы облученных крыс.

Для достижения цели используют штамм Е,со!! JM101 — продуцент одноните вого бактериофага M12mp8 yL. Однонитевую форму молекулы BS8 с помощью

17-членного праймера и кленовского фрагментаДНК-полимеразы I Е.со!! превращают в частично двуцепочную. При этом во вторую "-" нить вместо обычного дезоксицитидина встраивают дезоксицитидин, меченный фосфором.

Пример 1. у! -Фрагмент выделяют из плазмы крови облученных крыс и подвергают электрофорезу в градиентном полиакриламидном (16%) геле в 0,04 M трис-ацетатном буфере (рН 7,7), содержащем 0,01 M динатриевой соли этилендиа минтетрауксусной кислоты (ЭДТА-Na). Гель окрашивают бромистым этидием и вырезают участок низкомолекулярной (0,18 т,п,о.) ДНК, соответствующий у! -фрагменту, тщательно .измельчают гель и добавляют равный обьем раствора, включающего 0,5 M уксуснокислого аммония, 10 мМ ЭДТА-Na u

0,17, додецилсульфата Na, Смесь, перемешивают, инкубируют 10 ч при 37 С, продавливают через наконечник автоматической решетки, заполненный с иликонизированной стекловатой, Остатки геля удаляют центрифугированием, для супернатант ДНК осаждают, добавляя 3 объема охлажденного до -20 С этанола, Осадок собирают центрифугированием. Полученный препарат ДНК вновь растворяют в малом объеме (0,1-0,2 мл) ТЕ-буфера (10 мМ трис-Н С! (рН 8,0), 1 мМ

ЭДТА-Na) и переосаждают еще один раз тремя объемами этанола. Очищенную низкомолекулярную ДНК растворяют в 20-30 мкл ТЕ-буфера, проверяют, нанося 2-3 мкл пробы на flAl для электрофореза и, убедившись в наличии ДНК, используют ее в качестве малого yL-фрагмента для конс руирования рекомбинантной молекулы BS8.

В качестве RF-формы ДНК бактериофага M 13 mp8 берет препарат фирмы Amersham (Великобритания) в концентрации 1 мг/мл.

2 мкг RF-формы ДНК бактериофага M13mp8 смешивают с рестриктазой Smal (15 ед) в буфере 1 (20 мМ КО, 10 MM трис-НС! (рН 8,0), 10 мМ MgClz и 1 MM дитиотрейтола), Реакцию проводят при 37 С 4 ч. После инкубации смесь прогревают при 65 С 5 мин и проводят депротеинизацию ДНК.

Соединение линейной RF-формы ДНК бактериофага и yL-фрагмента проводят в буфере 2 для лигазы (0,07 М трис-HCI (рН

7,5), 5 мМ М9С!2) с добавлением АТФ и дититрейтола до конечной концентрации 1 MM и 5 мМ соответственно и ДНК-лигазы фага

Т4 (1000 ед/мл) из расчета 1 мкл фермента на 100 нг yL-фрагмента и до 20 нг линейной

RF-формы ДНК бактериофага М1 Згпр8 последующей инкубацией при 16 С в течение

6 ч.

Полученную смесь y (-фрагментов и

ДНК бактериофага Е.cali JM101 используют для трансформации клеток Е,coli J M101, Трансформацию проводят следующим образом. 0,5 мл суспензии клеток Е.coli М101 вносят в 10 мл двукратного питательного бульона LB и выращивают до концентрации соответствующей 0,03 ОЕ по оптическому поглощению при длине волны 550 нм, Клетки собирают центрифугированием ресуспендируют в 5 мл 0,05 М CaCiz (О С), выдерживают суспензию на льду 20 мин, центрифугируют в тех же условиях, ресуспендируют в 1 мл 0,05 M СаС!2 (О С), выдерживают суспензию на льду не менее 1 ч и используют для трансфекции.

Смесь соединенных фрагментов (5 мкл) инкубируют с компонентными (обработанными CaCI2) клетками (0,3 мл) не менее 40 мин при 0 С и 3 мин при 42 С с последующим возвращением в лед (тепловой шок), Далее трансформированные клетки соеди1747490 ствия, предварительно получают ДНК-зонд, 35 состоящий из ДНК-бактериофага М13п1р8и

ДНК плазмы крови облученных крыс, размером 0,18 т.п.о., а анализ генетического материала проводят путем гибридизации

ДНК-зонда с ДНК из плазмы крови облученных крыс.

Составитель Т.Забойкина

Техред M.Ìoðãåíòàë Корректор М Демчик

Редактор М;Петрова

Заказ 2473 Тираж Подписное

ВНИИПИ Государственного комитета по изобретениям и открытиям при ГКНТ СССР

113035. Москва, Ж-35, Раушская наб„4/5

Производственно-издательский комбинат "Патент", г, Ужгород, ул,Гагарина, 101 няют с чувствительными к бактериофагу

М13 клетками Е.coli JM101 расплавленным и остуженным до 43 С 0,5 $-ным (В-агаром и засевают на 1,5-2;4-ную агаризованную среду LB, С помощью реакции молекулярной гибридизации на нитроцеллюлозном фильтре y L-фрагмента, меченного 32Р, отбирают клоны бактериофага M13mp8 с рекомбинантной молекулой BS8, содержащей вставку у -фрагмента, обозначенные как ба кте риофа г M13m p8 L.

Пример 2. Бактериофаг M13mp8 у1 бактериологической петлей переносят в 1 мл LB-бульона одновременно с 0,1 мл свежей культуры Е.coll JÌ101, выращенной иэ ночной культуры. Через 3 ч инкубации при

37 С берут 0,1 мл и пересевают на 10 мл бульона LB, инкубируют 18 ч при 37 С, после чего рассеивают на LB-a rape для получения изолированных колоний штамма, обозначенного как Е.coli JM101 (В$8). Выросшие колонии переносят петлей на газон чувствительных к бактериофагу М12 клеток

Е.coli JM101 для контроля продукции бактериофага M13mp8 1 1 .

Ночную бульонную культуру штамма продуцента Е.соИ J M101 (BSH) осаждают путем центрифугирования. К супернатанту, в котором находятся зрелые частицы бактериофага M13mp8 y L, добавляют 25%-ный раствор полиэтиленгликоля (м.в.6000) в количестве 1/10 части от объема супернатанта и выдерживают при 4 С минимум 1 ч до появления хлопьевидных агрегатов частиц, после чего выделяют ДНК, К 0,2 мкг однонитевой ДНК молекулы

BS8 в 10 мкл 0,1-кратного ТЕ-буфера добавляют 0,1 мкг в 1 мкл 0,1-кратного ТЕ-буфера

17-членный гибридиэационный праймер следующей последовательности. 5 GTCA

TAGCTGTTTCCTG3 греют при 95 С 5 мин и медленно охлаждают до 37 С 0,5 ч. Далее добавляют 1 мкл кленовског6 фрагмента

ДНК полимеразы с активностью 2-3 ед/мкл и по 0,5 мкл 0,5 мМ растворов деэоксинуклеотидтрифосфатов, кроме dCTP, и 5 мкл

32Р— dCTP (Amersham, Англия), инкубируют

15 мин при 37 С, затем добавляют 0,5 мкл

0,5 мМ холодного dCTP и еще через 5 мин останавливают реакцию прогреванием до

70 С 10 мин, Препарат освобождают от невключившейся метки гель-фильтрацией на сефадексе G-50 и такой меченый 32Р ДНКзонд используют для диагностики лучЕвых поражений с помощью реакции гибридизации, Готовый ДН К-зонд, обозначенный BS8Р32, используют для оценки радиационного поражения крыс.

Для этого из крови облученных крыс выделяют ДН К, разделяют ее в полиакриламидном геле, полученные в результате низкомолекулярные фрагменты ДНК гибридизуют с BS8-Р32 ДНК-зондом, Наличие полос гибридизации позволяет сделать вывод о том, что соответствующие животные были подвергнуты радиационному поражению.

Формула изобретения

Способ оценки радиационного воздействия, предусматривающий анализ генетическогоматериала,отличающийся тем, что, с целью упрощения способа и возможности оценки в ранние сроки после воздей