Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста

 

Использование: биотехнология, ветеринария, животноводство. Сущность изобретения: получают последовательность к ДНК гена свиного гормона роста с N-концевым аланином (сГР/А), встраивают ее в плазмиду, пригодную для экспрессии в E. coli непосредственно за кодоном метионина, предназначенным для инициации трансляции, трансформируют полученной рекомбинантной плазмидой штамм E. coli, отбирают трансформированные клетки, культивируют их в подходящей питательной среде до накопления целевого продукта, а экспрессированный полипептид, не содержащий на N-конце дополнительного остатка метионина, подвергают выделению и очистке. 4 табл., 10 ил.

Изобретение направлено на способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста, включающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, трансформацию полученной рекомбинантной плазмидой штамма E. coli, отбор и культивирование трансформантов в питательной среде, выделение и очистку полученного полипептида.

Экспрессия генов эукаристами и прокариотами, хотя и использует одни и те же основные стадии транскрипции генов в информационную РНК (mРНК) и последующей трансляции этой mРНК в протеины, использует при этом различные совокупности внутриклеточных регуляторов для этих стадий.

Кроме того, у эукаристов многие зрелые протеины сначала транслируются как препротеины, то есть, как полипептиды, содержащие последовательность зрелого протеина, слившуюся с главной или сигнальной последовательностью. Эукаристная mРНК кодирует полный предпротеин, который обрабатывается после трансляции с тем, чтобы удалить главную последовательность и получить зрелый протеин. Несмотря на то, что эукариотные клетки снабжены всем необходимым для того, чтобы специальной обработкой превратить такие предпротеины в зрелые протеины, прокариотные клетки в общем случае не способны распознавать сигналы обработки, содержащиеся в эукариотных протеинах. Таким образом, если полные транскрипции комплементарной ДНК (кДНК) эукариотной mРНК используются в качестве ДНК-последовательностей для экспрессии в прокаристах, то получают в результате предпротеин, а не зрелый протеин. Имеется возможность превратить предпротеины в зрелые протеины в лабораторных условиях, но эта стадия требует значительных затрат.

В том случае, когда для экспрессии зрелого протеина в прокаристах используют ДНК-последовательность, кодирующую зрелый протеин, эта последовательность не содержит эукариотных сигналов трансляции и сигналов послетрансляционной обработки, которые в общем случае содержатся внутри ДНК для главной последовательности. Следовательно, для экспрессии клонированных эукариотных генов или других последовательностей гетерологической ДНК в прокариотных системах, как было установлено, желательно использовать прокариотные контрольные сигналы ввиду их эффективности и вследствие того, что эукариотные сигналы не могут распознаваться прокариотной клеткой-хозяином.

Термин "гетерологическая ДНК", как он используется в соответствии с настоящим изобретением, означает ДНК, по крайней мере часть которой не содержится в общем внутри генома клетки-хозяина. Примеры гетерологической ДНК включают, но ими не исчерпывается полный список, вирусные и эукариотные гены, фрагменты генов, аллели и синтетические последовательности ДНК. Термин "гетерологический протеин" или "гетерологический полипептид" означает здесь протеин или полипептид, по крайней мере часть которого в общем случае не закодирована внутри генома клетки-хозяина.

Прокариотные управляющие сигналы содержат промотор, который указывает на инициирование транскрипции, и управляющие трансляцией сигналы, содержащие сайт связывания рибосомы, сигнал начала трансляции и сигнал завершения трансляции. Все эти сигналы, за исключением сигнала завершения трансляции, должны быть расположены перед эукариотным геном или другой ДНК, которые должны быть подвергнуты экспрессии.

Известны несколько подходов с целью экспрессии гетерологической ДНК (например, эукариотных генов) в прокариотах. В соответствии с одним из подходов, сегмент ДНК, кодирующий искомый протеин, подвергают лигации с ДНК, кодирующей полный бактериальный протеин или его некоторую часть при управляющем воздействии его бактериального промотора. Эндогенная прокариотная ДНК обязательно содержит также рибосомный связующий сайт и сигнал начала трансляции. Экспрессия такой лигационной ДНК дает то, что называют протеином слияния, содержащим эукариотный полипептид, связанный или слившийся с полным или частичным бактериальным протеином. Выделение эукариотного протеина затем можно осуществить при помощи ориентируемого на определенный сайт ферментного или химического сечения в сайте слияния эндогенного-эукариотного протеина или при помощи селективного разрушения прокариотных полипептидных последовательностей.

Примерами опубликованных работ, касающихся получения в бактериях эукариотных протеинов слияния, являются: Европейская патентная заявка 47,600 (опубликованная 17 марта 1982 года), которая относится к протеинам слияния и "однородным" протеинам, содержащим бычий предгормон роста или бычий гормон роста ("бГР") на карбокси (С-) конце с порцией прокариотного протеина на амино (N-) конце; патентная заявка Великобритания 2,073,245А (опубликованная 14 октября 1981 года), касающаяся протеинов слияния бГР и β-лактамазы E.coli; публикация E. Keshet et al "Nucleic Acid Researh", 9: 19-30(1981), касающаяся протеина слияния бГР и b-лактамазы E.coli; Европейская патентная заявка 95,361 (опубликованная 30 ноября 1983 года), касающаяся протеина слияния, содержащего последовательно эндогенный протеин на N-конце, аминокислоту сигнала начала трансляции, сайт сечения энтерокиназой и экзогенный протеин (например, гормон роста) на С-конце. Такой подход с целью получения протеина слияния однако является слишком громоздким, ввиду того, что он требует обработки в лабораторных условиях после очистки и стоимость фермента (ферментов) для обработки промышленных количеств может оказаться сильным препятствием.

Однако, протеины слияния стали весьма притягательной системой для экспрессии некоторых эукариотных генов или других гетерологических ДНК в прокариотных клетках, так как продукт слияния, оказывается, предохраняет некоторые, полученные в результате, гетерологические протеины от внутриклеточной деградации. Оказывается, что бактериальные клетки "принимают" некоторые эукариотные протеины, продуцированные в ней за "чужеродные", и, таким образом, стараются разрушить эти протеины сразу же после их синтеза или через весьма непродолжительное время. Протеины слияния, созданные для предохранительных целей, могут использовать эндогенные полипептидные последовательности либо на амино-, либо на карбокси-конце гетерологического протеина. Примером последнего подхода может служить подход, предложенный в Европейской патентной заявке 111,814 (опубликованной 27 июня 1984 года), где описаны протеины слияния, содержащие некоторую форму бГР, имеющую синтетический передний конец (амино-конец) и b-галактозидазу E.coli на С-конце. Однако, все преимущества снова снижаются ввиду необходимости в последующем рассекать гетерологический протеин из эндогенного полипептида в соответствии с описанием, приведенным выше.

В соответствии с другим подходом сигнал начала трансляции, ATG, при регулирующем воздействии бактериального промотора расположен непосредственно перед ДНК-последовательностью, кодирующей гетерологический (например, эукариотный) протеин, не содержащий эндогенный протеин как на N-конце, так и на С-конце полученного протеина. Хотя протеины, полученные при помощи таких генных конструкций не требуют последующего сечения для образования искомого протеина, они в общем случае включают метионин (в некоторых случаях формилметионин) на N-конце, так как стартовый сигнал ATG также является кодоном метионина. Таким образом, если целевой зрелый протеин не начинается с метионина, то такой протеин будет иметь N-конец, измененный включением метионинового остатка.

К примерам таких генных конструкций относятся работа Guarente et al. Cell (1980) 20: 543 553, в соответствии с которой ген b-глобина кролика, который обладает N-концевым валином, подвергается экспрессии в E.coli с использованием только что описанной генной конструкции. В результате исследований ими было установлено, что "в то время как в b-глобине кролика отсутствует амино-концевой метионин, а лейцины содержатся в позициях 3, 14, 28, 31, 32 в меченом протеине лейцины были обнаружены в позициях 4, 15, 29, 32 и 33, а метионин был найден в позиции 1. Этот результат показывает, что этот протеин является b-глобином кролика плюс аминоконцевой метионин, которые не удаляются в E.coli, см. там же, стр. 546 547.

Другой пример относится к получению гормонов роста в бактериях, используя описанную выше генную конструкцию. Schoner et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. (1984)- 81: 5403 5407 описывают систему с высокой степенью экспрессии в бактерии для получения бГР, которая приводит к получению N-метионинового бГР; то есть соединения, содержащего аминокислотную последовательность, подобную аминокислотной последовательности одного из встречающихся в природе видов бГР плюс метионин на его N-конце. Присоединение N-концевого метионина к различным видам гормона роста, производимого бактериями, уже обсуждалось в Европейской патентной заявке 103,395 (опубликованной 21 марта 1984 года) и в Европейской патентной заявке 75,444 (опубликованной 30 марта 1983 года) для бГР и Seeburg et al. DNA (1983), 2: 37 45, для бГР и свиного гормона роста ("сГР").

Присоединение N-концевого метионина к натуральному N-концу может быть нежелательным по нескольким причинам. Во-первых, вполне возможно (хотя в настоящее время представляется мало правдоподобным), что метионин имеет тенденцию превращать протеин в антигенный в организме, в котором протеин без N-метионина является эндогенным. Во-вторых, присоединение метионина к N-терминальной части протеина может оказать нежелательный эффект на его биологическую активность или его физические свойства. В-третьих, эта измененная форма протеина может служить препятствием для научных исследований, направленных на определение связи между функцией натурального протеина и его структурой. Кроме того, может оказаться предпочтительным иметь дело с биосинтетическим протеином, который по структуре близок, насколько это возможно, к встречающемуся в природе протеину при его применении после одобрения правительством для медицинских или ветеринарных целей.

Способность таких прокаристов, как бактерий, удалять N-концевой метионин из протеинов либо во время их получения, либо уже после их получения привлекает в последнее время большое внимание. Например, Waller, J.Mol.Biol. (1963) 7: 483 496 исследовал состав N-терминальных аминокислот "растворимых" и рибосомных протеинов из экстракта E.coli, не содержащего клеток, а в Европейской патентной заявке 103,395 (опубликованной 21 марта 1984 года) предложен способ удаления N-концевого метионина из эукариотного протеина, синтезированного культурой E.coli. В частности, метионин удаляется из одного из двух упомянутых, производимых бактериями, протеинов бГР, причем оба они содержат остаток серина сразу же после содержащегося с самого начала N-концевого метионина. Генная конструкция, которая была использована в этих исследованиях, однако содержала синтетическую стартовую последовательность, кодирующую 5'-метионин-серин-лейцин-3', вставленную непосредственно рядом с 5'-концом бГР-кодирующей последовательности, в которой предварительно были удалены основания, кодирующие первые 4 или 9 встречающихся в естественных условиях аминокислот. Таким образом, полученный в результате протеин, синтезированный в культуре E.coli, был не натуральным протеином. В патентной заявке Великобритании 2,073,245А (опубликованной 14 октября 1981 года) указано, что, если met-pro заменить ala в зрелом бГР-протеине, то "met" может быть переработана бактериями таким образом, что в результате получается модифицированный бГР, начинающийся с аминокислотной последовательности Pro-Phe-Ala-Pro".

Таким образом, имеется необходимость в экономичном и предсказуемом средстве для получения в таких микроорганизмах, как бактерии, гетерологических (например, эукариотных) протеинов, которые не содержат N-концевого метионина. Особенно желательно разработать такой способ, в соответствии с которым такие протеины, полученные в бактериях, не требовали бы в лабораторных условиях обработки после ферментации и не содержали бы дополнительного, ненатурального N-концевого метионина.

Гормоны роста (также называемые соматотропинами) представляют собой полипептиды, продуцированные и секретированные клетками гипофиза и в значительной степени ориентированные на них по своему действию. Наряду с их ролью в ускорении роста скелета гормоны роста оказывают влияние на многочисленные метаболические процессы, включая стимулирование выделения молока, увеличение высвобождения инсулина из поджелудочной железы и выделения глюкоголя; кроме того, они оказывают эффект мобилизации липидов. Экзогенное применение бГР к крупному рогатому скоту, например, приводило к увеличению надоев молока, эффективности корма и/или скорости роста, снижению времени откармливания и увеличению отношения постная часть мяса/жира. Однако до сих пор не полностью ясно, как этот гормон вызывает столь многочисленные эффекты.

Обширные исследования, выполненные с гормоном роста человека (чГР), показали, что этот гормон в том виде, в каком он секретируется человеческим гипофизом, не представляет собой цельную молекулу, а является смесью полипептидов. Фракционирование различных видов чГР привело в конце концов к получению некоторых фракций чГР без диабетогенной активности и без липолитической активности.

Точно также, бГР, производимый крупным рогатым скотом, имеет несколько форм. В частности, синтезируется четыре вида бГР, которые отличаются в двух позициях протеина, N-концевая аминокислота может варьироваться из-за вероятной неоднозначности при удалении сигнальной пептидной (главной) последовательности таким образом, что зрелый протеин начинается либо с NH₂-phe-pro, либо с NH₂-ala-phe-pro. Кроме того, имеется некоторая неоднородность в аминокислоте 126, которая является либо лейцином, либо валином. Это вызвано, очевидно, аллельными вариациями в бычьей популяции [Wallis (1969) FEBS Letters 3: 118 120; Fellows and Rogol (1969) J. Biol. Chem. 244: 1567 1575; Fernandez et al. (1971) FEBS Letters 18: 53 54; Fellows (1973) личный комментарий, приведенный в Recent Progress in Hormone Research 29: 404; Santome (1973) Eur.J.Biochem. 37: 164 170; Graf and Li (1974) Biochem. Biophys. Res. Comm. 56: 168 176] Четыре молекулярные формы (вида) гипофизарного бГР обозначаются в сокращении следующим образом (см. табл.1).

Виды бГР (A,B) и бГР(В) иногда называют общим термином "валиновые аллельные бГР-виды" или "валиновые бГР-виды". В точности также, виды бГР(А,Л) и бГР(Л) иногда называют общим термином "лейциновые аллельные бГР-виды" или "лейциновые бГР-виды". Числа, связанные с аминокислотами в протеинах бГР, указанных выше, приведены только с целью идентификации и удобства ссылок.

Mills et al. (1970),J.Biol.Chem. 245: 3407 3415, в точности также идентифицировал два фрагмента цианбромида свиного гормона роста (сГР), имеющих неоднородность в соответствующих им N-концах. В частности, один фрагмент содержал N-концевой фенилаланин, а другой дополнительный N-концевой аланин. Эти молекулярные формы сГР в дальнейшем коротко обозначаются через сГР(Ф) и сГР(А), соответственно.

В работе Seeburg et al. DNA (1983) 2: 37 45, посвященной бактериальной экспрессии метиониновой формы PGH (Ph) при регулирующем воздействии бактериального промотора и расположении ДНК-последовательности, кодирующей целевой полипептидный продукт, непосредственно за сигналом начала трансляции, ATG, опубликованы полные ДНК-кодирующие последовательности и соответствующие аминокислотные последовательности для бГР(Л) и бГР(А).

Гипофизарные клетки отдельных видов крупного рогатого скота, как было установлено, в общем случае содержат смесь по крайней мере бГР(А,Л) и бГР(Л) или бГР(А, В) и бГР(В). Анализ N-концов протеинов бГР, полученных в культивированных гипофизарных клетках, показал на присутствие 50:50 смеси молекул, содержащих либо N-концевой фенилаланин (phe), либо N-концевой аланин (ala). Препарации, изготовленные в промышленных условиях и полученные из собранных гипофизов многих животных, в общем случае содержат все четыре молекулярные формы гипофизарного бГР. Кроме того, стало известно, что примерно 30% молекул в препарациях бГР, полученных из собранных гипофизов, имеют валин, заменяющий лейцин в позиции 126 [Fernandez et al. (1971) FEBS Letters 18: 53 54] Стандартные биохимические приемы разделения для четырех известных бГР-форм не позволяют получать каждый или какой-нибудь один из этих видов в промышленных масштабах. Поэтому было бы желательно исследовать и сделать доступными для промышленной применимости биологические активности каждой из 4 форм бГР, "существенно чистой" от других 3 форм и/или свободной от других протеинов бычьей природы. Термин "существенно чистый" используется здесь для обозначения специального протеина или протеинов, существенно свободного(ных) от протеинов и/или других материалов, с которыми протеин(протеины) связан(ы) в естественных условиях или источниках.

Целью изобретения является получение рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста.

Указанный полипептид согласно изобретению получают способом, включающим конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей промотор, действующий в E.coli, участок связывания с рибосомой, терминирующий кодон сайт инициации трансляции, представленный кодоном метионина, и расположенную непосредственно за названным кодоном последовательность кДНК гена свиного гормона роста pGH(А) с N-концевым аланином, кодирующим целевой полипептид, трансформацию полученной рекомбинантной плазмидной штамма E.coli, отбор и культивирование полученных трансформантов в питательной среде. Полученный полипептид, не содержащий на N-конце дополнительного остатка метионина, подвергают выделению и очистке.

Предлагаемый способ отличается от ближайшего известного способа, опубликованного Seeburg (1983) в DNB, использованием в качестве кодирующей последовательности кДНК гена свиного гормона роста pGH(A) с N-концевым аланином, и выделением и очисткой полученного полипептида, не содержащего на N-конце дополнительного остатка метионина.

Полипептиды сГР, полученные при помощи способа, являющегося предметом настоящего изобретения, обеспечивают средство для усиления таких активностей соматотропина, как увеличение выхода молока, скорости роста и/или эффективности корма.

На приводимых на фигурах диаграммах штриховым контуром изображена кодирующая последовательность ДНК бактериального промотора, зачерченный контур представляет кодирующую последовательность гетерологической ДНК, черточками изображены дополнительные кодирующие последовательности ДНК (они конкретно указаны на фигурах), а направленная стрелка указывает на ориентацию 5' и 3' кодирующих последовательностей ДНК. Указаны также соответствующие сайты для эндонуклеаза сечения. Отмеченные области ДНК приведены только с целью наглядного представления и они не связаны с реальными размерами этих областей.

Фиг. 1 конструкция M13mp8/XbaI, содержащая вектор M13mp8, имеющий вставленный в него в сайте сечения эндонуклеазой SmaI сайт сечения эндонуклеазой XbaI.

Фиг. 2 конструкция M13mp8/BGH_ex-1, содержащая M13mp8/XbaI, несущую кодирующую бГР(Л) последовательность ДНК.

Фиг. 3 конструкция кодирующей бГР(А,Л) последовательности ДНК при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте.

Фиг. 4 конструкция кодирующей бГР(А,В) последовательности ДНК при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте.

Фиг. 5 конструкция вектора экспрессии pMON3209, содержащего pBGH_ex-1, несущую кодирующую бГР(А,Л) последовательность ДНК вместо кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК.

Фиг. 6 конструкция вектора экспрессии pMON3215, содержащего pBGH_ex-1, несущую кодирующую бГР(А,В) последовательность ДНК вместо кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК.

Фиг. 7 конструкция M13mp9/PGH_ex-1, содержащей M13mp9, несущий кодирующую сГР(П) последовательность ДНК.

Фиг. 8 конструкция кодирующей сГР(А) последовательности ДНК при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте.

Фиг. 9 конструкция pBGH_ex-1^*, содержащего pBGH_ex-1, в котором сайт сечения эндонуклеазной EcoRI расположен по направлению вверх от 5'-конца кодирующей ptrp последовательности ДНК был предварительно удален.

Фиг. 10 конструкция вектора экспрессии pMON3213, содержащего pBGH_ex-1^*, несущий кодирующую сГР(А) последовательность ДНК вместо кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК.

В соответствии с настоящим изобретением предлагается способ получения в прокаристе гетерологического полипептида, такого, как эукаристный (например, млекопитающего или птицы) протеин, который содержит N-концевой аланин. Таким образом, получают полипептид без N-концевого метионина и тем самым исключается необходимость в обработке в лабораторных условиях с целью получения такого полипептида без N-концевого метионина. Возможность устойчивого получения такого полипептида без N-концевого метионина, содержащегося в кодирующей последовательности гена, является новым и совершенно неожиданным результатом.

Настоящее изобретение предлагает весьма эффективный способ получения "существенно чистых протеинов", которые имеют N-концевой аланин. Кроме того, настоящее изобретение можно эффективно использовать для получения других полипептидов, когда желательно иметь на N-конце аланин, а не метионин, например, когда N-аланиновая форма полипептида может быть менее иммуногенной, или иметь другие физические свойства или модифицированную биологическую активность.

Примеры реализации настоящего изобретения, согласно которым получают по существу чистые виды бГР или сГР при помощи культивирования бактериальных клеток, пока не содержат ни доказательства необходимости удаления N-концевого метионина, ни указания на необходимость осуществления этого приема. Во всех работах, посвященных экспрессии бГР при помощи бактериальных клеток, в которых N-конец содержит N-концевую аминокислотную последовательность, гомологичную встречающимся в природе видам бГР, описано присутствие N-концевого метионина. В статье Seeburg et al. DNA (1983), т. 2, с. 37 45 на с. 44 указано, что последовательность гена для N-концевых фенилаланиновых видов бГР, например бГР(Л), умышленно выбирается для экспрессии в культуре E.coli частично, чтобы избежать ожидаемого присоединения второй гидрофобной аминокислоты (метионина) к гидрофобному N-концевому аланину других видов бГР, например, бГР(А,Л). Таким образом, доступные до настоящего времени исследования указывают на сохранение N-концевого метионина в синтезированных бактериями видах бГР. Несмотря на эти известные результаты, заявителем было установлено, что по причинам, указанным выше, имеется необходимость в получении каждого из двух видов бГР-бГР(А,Л) и бГР(А,В) и вида сГР(А) гормона сГР. Однако попытки получить эти виды соматотропина с помощью бактерий предприняты в ожидании, что полученные полипептиды будут содержать N-концевой метионин.

Как это более подробно описано в примерах реализации настоящего изобретения, подход заявителя с целью получения бГР(А,Л), бГР(А,В) и сГР(А) в бактериях, если очень коротко, заключается в следующем. Кодирующие вышеупомянутые протеины последовательности ДНК строятся при помощи направленного на нуклеотиды мутагенеза в специальном сайте последовательностей ДНК, кодирующих свиные виды соматотропина, содержащие N-концевой фенилаланин, как это показано на фиг. 3, 4 и 8. Затем последовательности, кодирующие бГР(А,Л), бГР(А,В) и сГР(А) вставляют в векторы экспрессии таким образом, что окончательная генетическая последовательность содержит последовательно промотор, сайт связывания рибосом, кодон ATG начала [метионин, непосредственно примыкающий к последовательности ДНК, кодирующей либо бГР(А,Л), либо бГР(А,В), либо сГР(А)] и, наконец, кодон прекращения трансляции. Культуру E.coli затем подвергают трансформации полученным вектором экспрессии, несущим искомую последовательность гена, и культивируют при условиях, которые позволили бы осуществить экспрессию искомой гетерологической ДНК и получить тем самым искомый гетерологический протеин. Затем полученные таким образом протеины анализируют с точки зрения их последовательности и соответствующей биологической активности.

Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением установлено, что когда ДНК-последовательность, содержащую кодон сигнал начала (метионин) и следующие за ним кодоны гетерологического N-аланинового полипептида, подвергают экспрессии, то протеин, выделенный из прокаристного организма действительно содержит аланин на N-конце, а не метионин. Представляется правдоподобным, что аналогичный результат может быть получен, если этот аланиновый кодон расположен вслед за примерно тремя соседними метиониновыми кодонами, которые включают сигнал начала трансляции mРНК, кодирующей целевой полипептидный продукт. Например ДНК, включающая этот сигнал начала трансляции и кодоны целевого полипептидного продукта, может включать любую последовательность, которая соответствующим образом кодирует met-ala, met-met-ala, met-met-met-ala или любой его функциональный эквивалент.

N-аланиновый полипептид определяется здесь как полипептид, содержащий аланин на своем аминоконце. Заявитель не хотел бы ограничивать себя представленной ниже теорией механизма, но он убежден, что после трансляции N-концевой метионин полипептида ферментным образом удаляется прокаристом, если следующей аминокислотой является аланин или другая аминокислота, имеющая такие же характеристики (например, полярность или гидрофобность), которая способствует такому удалению N-метионина. Кроме того, также представляется правдоподобным, что многие прокариоты оказываются способными удалять N-концевые метионины из гетерологических и/или эндогенных полипептидов, если после вышеупомянутых N-концевых метионинов сразу же следует аланин.

Эти прокаристы (например различные бактерии, известные и доступные благодаря существованию институтов для депонирования микроорганизмов, таких как ATCC и другие) включают E.coli и различные ее штаммы, но видимо, ими не ограничивается весь список. В самом деле, весьма правдоподобно, что любой прокарист, способный синтезировать полипептид, содержащий N-концевой аланин из кодирующей последовательности ДНК, которая начинается с одного и до примерно трех соседних кодонов метионина, после которых сразу же следует кодон аланина, потенциально может оказаться эффективным при реализации настоящего изобретения. Производимые промышленностью другие доступные прокариотные организмы могут быть просеяны на их способность продуцировать такие N-аланиновые полипептиды при помощи вставки в геном вышеупомянутых организмов гена, содержащего последовательно промотор, действующий в вышеупомянутом организме, ДНК, кодирующую сайт связывания рибосом, от одного до примерно трех соседних кодонов метионина, включающих сигнал начала трансляции, а затем сразу идут кодоны гетерологического N-аланинового полипептида и сигнал прекращения трансляции, затем осуществления экспрессии вышеупомянутого гена и, наконец, идентификации N-концевой аминокислотной последовательности полученного таким образом гетерологического полипептида. Если установлено, что такой прокариотный организм продуцирует внутренним образом такой гетерологический N-аланиновый полипептид, то такой организм содержится внутри класса, который может быть использован согласно настоящему изобретению.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения три различных изолята штамма K12 E.coli, каждый из которых был депонирован в Американском Собрании Типов Культур, Роквилл, Мэрилэнд и имеет числовой шифр ATCC 39936, 53010 и 53009 соответственно, обладают способностью удалять N-концевые метионины в том случае, когда после вышеупомянутых N-концевых метионинов следует сразу же аланин.

Это открытие представляется значительным, так как оно дает способ получения в прокаристах гетерологических полипептидов, которые содержат N-концевые аланины.

В одном из предпочтительных вариантов осуществления способа, являющегося предметом настоящего изобретения, он используется для получения двух видов бГР-бГР(А, Л) и бГР(А, В), и одного вида сГР-сГР(А), которые не содержат других бычьих или свиных протеинов и/или других бГР или сГР видов соответственно. В частности этот способ обеспечивает получение бГР(А,Л), бГР(А,В) или сГР(А), как одного единственного вида. Способность продуцировать единственный бГР- или сГР-вид с аминокислотными последовательностями, гомологичными встречающимися в природе соматотропинами, имеет огромное значение для определения точной биологической активности каждого бГР- или сГР-вида, выявляя тем самым многочисленные усиливающие эффекты бГР и сГР в общем случае, как это было описано выше. В действительности было установлено, что применение одного из двух N-аланиловых видов бГР дает усиление такой функции бГР, как увеличение надоев молока. Кроме того, было установлено, что использование для увеличения выделения молока количества бГР(А,В), полученного в соответствии с настоящим изобретением, увеличивает надои молока в день от коровы в более значительной степени в статистическом смысле, например, p<0,05, чем полученный таким же образом бГР(А,Л). До последнего времени не было известно каких-либо результатов по поводу относительной эффективности специальных форм (видов) бГР с целью увеличения надоев молока у млекопитающих, производящих молоко. Кроме того, не было также известно каких-либо результатов, полученных в живом организме или в лабораторных условиях, которые бы указывали, что имеются различия в биологической активности между различными видами бГР. Таким образом, вывод, заключающийся в том, что валиновые аллельные виды бГР приводят к более значительному увеличению выделения молока, чем лейциновые аллельные виды бГР, оказался и удивительным и неожиданным. Кроме того, этот вывод предполагает, что можно аналогичным образом определить различия в относительной эффективности видов бГР в усилении других свойств гормонов роста, таких как увеличение эффективности корма и стимулирования роста. Таким образом, используя приемы настоящего изобретения, которые позволяют получить в бактериях по крайней мере две молекулярные формы гипофизарного бГР в существенно чистом виде, и/или используя другие известные приемы, можно теперь получать виды бГР, наиболее эффективные для достижения специальной реакции, вызванной гормоном роста. К таким другим известным приемам относятся, но ими не исчерпывается полный список, химический синтез полных протеинов бГР или их фрагментов, и/или продуцирование в других микроорганизмах таких, как дрожжи, или в клетках млекопитающих, используя известные методы рекомбинантной ДНК.

Кроме того, после определения биологической активности каждого, встречающегося в природе вида, вполне выполнимой задачей является получение полипептидных вариантов каждого из таких видов, которые должны еще более увеличивать их соматотропиновую активность. Таким образом, можно предвидеть, что образование соматотропиновых вариантов в результате удаления нуклеотидов или аминокислот, замены и/или добавления нуклеотидов или аминокислот дает возможность получить различные полезные эквиваленты композиций, предлагаемых в соответствии с настоящим изобретением. К таким вариантам относится измененная форма бГР(В), в котором изменение заключается в присоединении метионина к амино-концу. Этот вариант, производимый генетически трансформированной бактерией, как было установлено, значительно увеличивает ежедневное отделение молока у коров при применении его в количестве, увеличивающем лактацию. Кроме того, степень отмеченного увеличения лактации после применения этого варианта бГР(В), как было установлено, заметно больше по сравнению с увеличением лактации, отмеченным после применения в других отношениях варианта, содержащего лейцин в аминокислотной последовательности в положении 126.

Оказалось, что замена лейцина валином в положении 126 существенно увеличивает биоусваиваемость и/или биологическую активность таких соматотропиновых протеинов. В частности, кристаллографический анализ в рентгеновских лучах, проведенный на соматотропиновых протеинах, показал, что область вышеупомянутых протеинов, расположенная примерно от аминокислоты 90 до 136, образует относительно гибкую область. Исследование других протеинов показало, что такие гибкие области часто содержат биологически активный сайт (например, сайт, который взаимодействует с биологическими рецепторами и/или другими частями того же протеина с тем, чтобы получить биологически активную форму). Таким образом, следует ожидать, что дополнительные варианты бГР(А, В), которые содержат замещения, удаления, добавления и/или инверсии аминокислот внутри только что описанной гибкой области и/или вне этой области, могут быть получены и в точности также приводят к заметному увеличению надоев в большей степени, чем идентичные в других отношениях лейциновые виды бГР или бГР(А,Л). Например, изменения в позиции 126 аминокислоты или вокруг нее могут включать замещение других, более гидрофильных и/или меньших аминокислот (относительно лейцина), при условии, чтобы описанное увеличение отделения молока не снизилось до недопустимой степени.

Кроме того, можно ожидать, что валиновые типа бГР, содержащие N-концевые phe₁, или N-концевые ala_-1, могут обеспечивать описанное увеличение надоев молока при применении к коровам. Можно также ожидать, что изменения в аминоконцах (например, met_-1), которые не отличаются существенно от N-конца, встречающегося в природе бГР, не окажут слишком сильного влияния на способность валиновых видов бГР увеличивать надои молока в существенно большей степени, чем идентичные во всех других отношениях лейциновые виды бГР и бГР(А, Л). Кроме того, следует также ожидать, что композиция бГР, в которой концентрация валиновых видов бГР в пересчете на вес всех бГР в этой композиции существенно больше, чем концентрация валиновых видов бГР в собранных препарациях гипофизарного бГР, также позволили бы добиться необходимого результата.

В соответствии с одной из своих широких реализаций настоящее изобретение представляет собой углубление в использовании технологии рекомбинантной ДНК с целью непосредственного получения в прокаристах гетерологических полипептидов. Таким образом, описание настоящего изобретения предполагает знакомство с основными приемами, которые используются в технологии рекомбинантной ДНК с целью изоляции и клонирования последовательностей ДНК, кодирующих полипептиды, с перераспределением или изменением клонированных последовательностей ДНК и экспрессией клонированных или модифицированных последовательностей ДНК в трансформированных микроорганизмах. С такими приемами знаком любой специалист в этой области техники. (См. например, Molecular Cloning: A Laboratory Manual; под ред. Maniatis, Fritsch Sambrook, 1982).

Изоляция и/или конструкция гетерологической ДНК В соответствии с одним из воплощений настоящего изобретения ДНК последовательность, кодирующую искомый гетерологический полипептид, подлежащий продуцированию в прокаристе, выбирают и изолируют, или ДНК последовательность, которая его кодирует, строят или синтезируют химически. Во многих важных вариантах воплощения таким полипептидом является эукаристый протеин. Если полипептид является небольшим и известна полная аминокислотная последовательность, то можно построить синтетическую ДНК-молекулу или последовательность, кодирующую этот полипептид. Если аминокислотная последовательность полипептида неизвестна или ее размеры слишком велики для того, чтобы практически реализовать синтез соответствующей ДНК-последовательности, можно получить последовательность кДНК при помощи обратной транскрипции из соответствующей mРНК, полученной из тканей или клеток, экспрессирующих этот полипептид. Например, такая последовательность для бГР может быть получена из бычьих гипофизов при помощи известных в настоящее время приемов, описанных Goodman et al. Methods in Enzymology 68: 75 90 (1979). В качестве альтернативы кДНК-последовательность может быть получена из mРНК, выделенной из клеток, трансформированных геномной ДНК, выделенной из нативного генного банка при помощи соответствующего зонда. Геномная ДНК может быть также модифицирована в различных векторных системах таким образом, что ДНК может быть экспрессирована в прокариотах. Эти приемы известны каждому специалисту в этой области техники.

После получения гетерологической ДНК-последовательности, содержащей кодоны искомого полипептида, может оказаться желательным осуществить некоторые модификации в нуклеотидной последовательности этой молекулы. Например, если эта молекула была получена при помощи обратной транскрипции из матрицы mРНК, то она будет часто содержать по крайней мере часть ДНК, кодирующую главную последовательность предпротеина. Таким образом, необходимо удалить все ДНК главной последовательности перед первым кодоном искомого протеина. В некоторых случаях может оказаться необходимым добавить или включить кодон аланина взамен другого кодона в начале последовательности, кодирующей искомый протеин, если он еще не имеет кодона N-концевого аланина. Затем вводят сигнал начала трансляции, который также является кодоном метионина, вверх и непосредственно рядом с кодоном аланина. Несмотря на то, что комплекс сигнал начала/кодон метионина будет в общем случае и в предпочтительном варианте нуклеотидной последовательностью ATG, последовательность GTG может также иногда служить в качестве комплекса сигнал начала/кодон метионина. Кроме того, присутствие более одного кодона метионина, например, двух, трех и может быть еще большего количества соседних кодонов метионина, необходимо рассматривать как незначительную модификацию в рамках способа, предлагаемого в соответствии с настоящим изобретением.

По крайней мере один сигнал прекращения трансляции может быть введен после кодона С-концевой аминокислоты, если его там не было до этого. Примерами сигналов прекращения трансляции являются деоксинуклеотидный триплет TAA, TGA и TAG. Таким образом, по существу, применяются методы рекомбинантной ДНК с целью конструкции последовательности рекомбинантной ДНК, содержащей последовательно сигнал начала трансляции/кодон метионина, кодоны для искомого полипептида с кодоном N-концевого аланина, примыкающим к сигналу начала, и по крайней мере один сигнал прекращения трансляции, примыкающий к кодону С-концевой аминокислоты.

Было установлено, что эффективной экспрессии mРНК могут препятствовать вторичные структуры, образованные водородом, связывающим две комплементарные серии нуклеотидов внутри mРНК. Исключение этих комплементарных последовательностей, в частности, в той части молекулы, которая кодирует N-конец, упрощает связывание рибосом с mРНК и, следовательно, увеличивает степень экспрессии. Может оказаться, следовательно, желательным заменить кодоны, которые участвуют в образовании таких вторичных культур, кодонами той же аминокислоты, но состоящими из другого нуклеотидного триплета. См. Европейский патент 75,444 (опубликованный 30 марта 1983 года); Seeburg et al. (1983) DNA 2: 37 45 и Shoneret al. (1984) Proc. Nat'l Acad. Sci. U.S.A. 81: 5403 5407.

Другие подходы к построению гетерологических последовательностей ДНК будут очевидны каждому специалисту в этой области техники. Например, если имеется в распоряжении молекула ДНК, которая кодирует полипептид, подвергающийся экспрессии с N-концевой структурой типа NH₂-met-x-y где х является аминокислотой, отличной от аланина, то кодон аланина может быть вставлен между комплексом сигнал начала трансляции/кодон метионина и кодоном для х. В качестве альтернативы, кодон для х может быть изъят, а кодон аланина вставлен вместо него. Таким образом, при помощи способа, являющегося предметом настоящего изобретения, получали бы протеин, имеющий N-концевую структуру NH₂-ala-x-y. или NH₂-ala-y. соответственно.

В точности также можно осуществить удаление, добавление и/или замену в любом из кодонов аминокислоты внутри данной последовательности гена таким образом, что при помощи способа, являющегося предметом настоящего изобретения, можно осуществить экспрессию вариантного полипептида. "Вариантный" полипептид в соответствии с настоящим изобретением означает полипептид, содержащий один или несколько аминокислотных пробелов, замен и/или добавлений по сравнению с встречающейся в природе аминокислотной последовательностью данного полипептида. Примеры таких вариантов включают (но ими не ограничивается весь список) met-бГР(Л) и met-бГР(В), в которых аминокислотная последовательность этих вариантных видов бГР идентична бГР(Л) и бГР(В) соответственно, полученными при помощи бычьих гипофизарных клеток, за исключением присутствия дополнительного метионина на N-конце. Эти вариантные полипептиды строятся как имеющие аминокислотную последовательность, существенно такую же, что и аминокислотная последовательность встречающегося в природе полипептида, если только биологическая активность не снижается до недопустимого предела. Построение и экспрессия вариантных полипептидов может оказаться желательной для того, чтобы добиться более значительного накопления, более высокой стабильности протеина, чтобы упростить стадию очистки полипептида и/или оптимизировать его биологическую активность.

Описываемые выше модификации молекулы ДНК, кодирующей целевой полипептид, могут быть осуществлены с использованием ферментов сечения (ограничения) экзонуклеаз, эндонуклеаз и т.д. при помощи приемов, известных в этой области техники. Можно также использовать общие приемы направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте с тем, чтобы осуществить вышеуказанные модификации в структуре или последовательности молекулы ДНК. Эти приемы также известны каждому специалисту в этой области техники. См. например, Zoller Smith (1982) Nuc. Acids Res. 10: 6487 6500; Zoller Smith (1983) Meth. Enzymol. 100: 468 500; Norris et al. (1983) Nuc. Acids Res. 11: 5103 5112.

В соответствии с известными приемами рекомбинантной ДНК, после того, как получена искомая последовательность гетерологической ДНК, эту последовательность вставляют в соответствующий клонирующий вектор, который обеспечивает средство для репликации ДНК-последовательности. При этом можно использовать любой подходящий клонирующий вектор в предпочтительном варианте содержащий маркерную функцию, например, векторы плазмиды E.coli, которые содержат Col EI, Hershfield et al. Proc, Nat'l. Acad. Sci. U.S.A.(1974) 71: 3455; pBR322, Bolivar et al. Gene (1977) 2: 95; pBR325, Soberon et al. Gene (1978) 4: 121; и pkc7, Rao et al. Gene (1979) 7: 79; и векторы бактериофага E.coli, которые включают lL47.1 Charon, Loenen et al. Gene (1980) 10: 249; и M13mp8 и M13mp9, Messing et al. Gene,(1982) 19: 269. Общие приемы введения вышеупомянутой последовательности ДНК в клонирующий вектор с целью создания рекомбинантного вектора известны каждому специалисту в этой области техники. См. например, книгу "Molecular Cloning: A Laboratory Manual; ред. Maniatis, Fritsh Sambrook, (1982).

После того, как получены несколько копий искомой последовательности гетерологической ДНК, эти последовательности можно выделить из рекомбинантных векторов и вставить в систему экспрессии с целью получения и изоляции целевого гетерологического протеина в соответствии с описанием, которое более детально дано ниже. Перед вставкой этих последовательностей ДНК в вектор экспрессии можно осуществить различные модификации последовательности гетерологической ДНК при помощи приемов, известных каждому специалисту в этой области техники; при помощи известных приемов модификации можно также осуществить уже после вышеупомянутой вставки.

В примерах реализации настоящего изобретения наряду с M13mp9, описанным Messing et al. Gene (1982) 19: 269, в качестве клонирующего вектора был выбран M13mp8, описанный там же, модифицированный таким образом, чтобы он содержал сайт сечения XbaI, как это указано на фиг. 1. Векторы M13mp9 и M13mp9, которые вместе именуются как "векторы М13", позволяют изолировать рекомбинантные векторы как в двунитевой (дн) или репликативной форме (РФ), так и однонитевой (он) форме ДНК. Изоляция рекомбинантных векторов РФ ДНК упрощает последующее введение искомых последовательностей ДНК после репликации в векторы экспрессии, как это показано на фиг. 5, 6 и 10. В качестве альтернативны изоляция однонитевой формы этих рекомбинантных векторов упрощает как изоляцию рекомбинантных векторов, которые содержат искомую последовательность ДНК с правильной 5ʹ _→ 3ʹ ориентацией для экспрессии, так и построение любой модификации последовательности ДНК при помощи таких приемов, как направленный на олигонуклеотиды мутагенез в специальном сайте, как это показано на фиг. 3, 4 и 8. Кроме того, эти векторы М13 могут "согласовывать" фрагменты ДНК или гены длиной до 4 килобайт (кб), которые обеспечивают клонирование типичной, полной, эукаристной генетической последовательности.

Маркерная функция, используемая в векторах М13, как это описано Messing et al. Gene (1982) 19: 269, включает фермент β-галактозидазы. В частности, искомую последовательность гетерологической ДНК вставляют во фрагмент lacZ гена, который содержится на векторе М13, что нарушает нормальную комплектацию фрагмента lacZ гена, содержащегося на векторе 13, частичным фрагментом lacZ гена, содержащегося на хромосомной ДНК клетки-хозяина (например, E.coli JM101), так что вышеупомянутый хозяин уже не способен включать в обмен веществ лактозу, содержащуюся в среде для роста бактерий. E.coli после инфекцирования векторами М13, которые не содержат инородной генетической последовательности, вставленной в вектор, несущий фрагмент lacZ гена, способны включать в обмен веществ лактозу, содержащуюся в среде для выращивания бактерий, и вырабатывают характерные голубые бляшки, если эти бактерии выращиваются на агаре, включающему среду 1 х YT, содержащую 0,8% (масса/объем) триптона, 0,5% (мас./об.) экстракта дрожжей, 0,5% (мас./об.) NaCl и цветовой индикатор для b-галактозидазы. Когда бактерии растут на вышеупомянутой среде, бляшки E. coli после инфекцирования рекомбинантными векторами, несущими вставленную последовательность гетерологической ДНК в генном фрагменте lacZ векторам М13, прозрачны или бесцветны. Следовательно, положительная вставка последовательности гетерологической ДНК в эти клонирующие векторы устанавливается в результате образования бесцветных бляшек после инфекцирования клетки-хозяина E. coli рекомбинантным вектором. Вставка последовательностей ДНК, кодирующих бГР(Л) и сГР(Ф), в векторы М13 представлена на фиг. 2 и 9, соответственно.

В предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения последовательности ДНК, кодирующие бГР(Л) и сГР(П), содержащиеся на бактериальных плазмидах pBGH_ex-1 и pBGH_ex-1 соответственно, как это описано у Seeburg et al. DNA (1983) 2(1): 37 45, изолируют из этих плазмид при помощи сечения эндонуклеазой ограничения в специальном сайте. Необходимо отметить, что бактерии после трансфекции бактериальными плазмидами pBGH_ex-1 или pBGH_ex-1 соответственно и последующего культивирования при условиях, которые позволяют получить экспрессию последовательностей, кодирующих бГР(Л) и сГР(П) соответственно, продуцируют соматотропины с N-концевым метионином (например, met-бГР(Л) или met-сГР(П) соответственно). Соответствующие последовательности затем вставляют в РФ ДНК модифицированного вектора M13mp8 (M13mp8/XbaI) и вектора M13mp9, как это показано на фиг. 2 и 7 соответственно. Вставка искомых последовательностей ДНК бГР(Л) и сГР(П) в РФ ДНК M13mp8/XbaI и M13mp9 подтверждалась при помощи сечения эндонуклеазой ограничения в специальном сайте, как это снова показано на фиг. 2 и 7 соответственно. E.coli JM101 затем подвергают трансфекции одним из этих рекомбинантных векторов, как это описано Messing et al. Methods in Enzymology (1983) 101: 20 и онДНК рекомбинантных векторов изолируют в соответствии с описанием, данным Messing et al. Gene (1982) 19: 269. Соответствующие места этих работ Messing et al. используются здесь в качестве ссылок.

После изоляции различные онДНК этих рекомбинантных векторов модифицируют при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте с тем, чтобы получить кодирующие последовательности ДНК для бГР(А,В), бГР(А, Л), бГР(В) и сГР(А). В частности, бГР(Л) модифицируют добавлением кодона аланина, например, GCC, 5'-конце кодирующей бГР(Л) последовательности, как это показано на фиг. 3. Следует ожидать, что таким образом можно добавлять любой из четырех кодонов аланина. Предпочтительным кодоном аланина для оптимального выхода соматотропина в системе экспрессии, используемой в соответствии с настоящим изобретением, является GCC. Подтверждение присоединения кодона аланина при конструировании кодирующей бГР(А,Л) последовательности достигается в результате анализа последовательности ДНК полной последовательности ДНК бГР(А, Л) или ее 5'-конца с использованием метода Sanger et al. Proc, Nat'l. Acad. Sci. U.S.A. (1977) 74: 5463.

Кодирующая бГР(А, В) последовательность конструируется при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте кодирующей бГР(А, Л) последовательности, как это показано на фиг. 4, при помощи превращения кодона лейцина в аминокислотной позиции 127 [в бГР(А,Л)] в кодоне валина, например, GTG. Снова можно ожидать, что при таком превращении можно использовать любой кодон для валина. Правильность конструкции кодирующей бГР(А, В) последовательности снова подтверждается при помощи анализа последовательности ДНК результирующей кодирующей бГР(А,В) последовательности.

Кодирующая бГР(В) последовательность, которая проявляется в синтезе протеинов met-бГР(В) бактериями после трансфекции векторами экспрессии, содержащими кодирующую бГР(В) последовательность, конструируется аналогично при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте кодирующей бГР(Л) последовательности при помощи превращения кодона лейцина в аминокислотной позиции 126 [в бГР(Л)] в кодон валина, например, GTG.

Конструирование кодирующей сГР(А) последовательности при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте кодирующей сГР(П) последовательности осуществляют в точности так же, как это показано на фиг. 8 и описано более полно ниже, а правильность конструкции подтверждается анализом последовательности ДНК.

После изоляции и конструирования искомых последовательностей гетерологической ДНК по аналогии с примерами для бГР(А,Л), бГР(А,В) и сГР(А), эти последовательности могут быть подвергнуты репликации и получены многочисленные копии в результате размножения соответствующих рекомбинантных векторов с использованием приемов, известных каждому специалисту в этой области техники, и которые уже были указаны выше. Такие последовательности гетерологической ДНК могут быть вставлены в любые подходящие векторы экспрессии с целью продуцирования в прокаристах искомых гетерологических полипептидов.

Получение полипептидов с N-концевым аланином Как уже было указано выше, подходящий вектор экспрессии должен содержать необходимые сигналы транскрипции и трансляции с целью получения гетерологического протеина в выбранной клетке-хозяине вместе с маркерной функцией для идентификации тех векторов экспрессии, в которых были вставлены искомые последовательности гетерологической ДНК. При помощи использования прокаристного вектора экспрессии последовательности рекомбинантной ДНК могут быть добавлены к генетическому комплементу прокаристного организма через трансдукцию, трансформацию или трансфекцию (все эти приемы в дальнейшем именуются одним термином "трансфекция") и затем вышеупомянутый организм можно культивировать при условиях (которые в общем случае диктуются используемыми промотором и хозяином), которые стимулируют продуцирование целевого полипептида. Таким образом, "геномные" ДНК организмов, используемых в соответствии с настоящим изобретением, содержат как хромосомную ДНК, так и эписомную ДНК.

Известно несколько векторов экспрессии для экспрессии гетерологического гена и продуцирования гетерологического протеина в прокаристной клетке-хозяине, и они известны теперь каждому специалисту в этой области техники.

В одном из предпочтительных вариантов воплощения настоящего изобретения использовали векторы экспрессии pBGH_ex-1, см. Seeburg et al. DNA (1983) 2(1): 37 45 и pBGH_ex-1^*, содержащий модифицированный вектор pBGH_ex-1.

Вектором экспрессии bGH_ex-1 является бактериальная плазмида pBR322, несущая ген для бГР(Л). Этот ген содержит последовательно триптофановый промотор (ptrp), последовательность Шин-Дельгардо, комплекс начало трансляции ATG/кодон метионина, примыкающий непосредственно к кодирующей последовательности N-концевого фенилаланина, первую аминокислоту полипептида бГР(Л), кодирующую бГР(Л) последовательность и кодон прекращения трансляции. Маркерной функцией на векторе экспрессии pBGH_ex-1 является стойкость к антибиотику. В частности, pBGH_ex-1 несет два гена стойкости к антибиотику, один ген стойкости к ампициллину (amp^r) и второй - стойкости к тетрациклину (tet^r), которые переносят специфическую стойкость к антибиотику чувствительной к другим антибиотикам клетке-хозяину, стабильно трансформированной вектором экспрессии. Таким образом, стабильные трансформированные клетки могут быть выбраны по росту в среде, содержащей либо тетрациклин, либо ампициллин, либо оба эти антибиотика.

В примерах реализации настоящего изобретения векторы экспрессии pMON3209 и pMON3215, содержащие pBGH_ex-1, несущие последовательности, кодирующие бГР(А, Л) и бГР(А,В) соответственно вместо кодирующей бГР(Л) последовательности, получали, как это представлено на фиг. 5 и 6 соответственно. Затем такие бактерии, как E.coli, стабильно трансформировали при помощи одного из этих векторов экспрессии, а трансформированные клетки выбирали по росту на среде, содержащей соответствующий антибиотик. Плазмиды экспрессии, содержащиеся внутри трансформированной бактерии, затем просеивали на присутствие последовательностей, кодирующих бГР(А, Л) и бГР(А,В) с правильной 5ʹ _→ 3ʹ ориентацией при помощи сечения ферментом ограничения.

В примере реализации настоящего изобретения при создании вектора экспрессии pMON3213, несущего кодирующую сГР(А) последовательность вместо кодирующей бГР(Л) последовательности, использовали pBHG_ex-1^*, содержащий вектор pBGH_ex-1, модифицированный при помощи удаления сайта ограничения EcoRI, расположенного вверх от 5'-конца кодирующей ptrp последовательности. Полученный в результате вектор pBGH_ex-1^* содержит только один сайт EcoRI, как это показано на фиг. 9. Замена кодирующей сГР(А) последовательности кодирующей бГР(Л) последовательностью в pBGH_ex-1^* с целью создания вектора экспрессии pMON3213 представлена на фиг. 10. Далее, вышеупомянутой смесью трансформировали культуру E.coli и трансформированные клетки отбирали по росту в содержащей антибиотик среде. Плазмиды экспрессии, содержащиеся внутри трансформированных бактерий, затем просеивали на присутствие кодирующих сГР(А) последовательностей при помощи сечения ферментом ограничения.

Продуцирование бГР(А,Л), бГР(А,В) или сГР(А) в культуре E.coli осуществляли в результате трансформации либо E.coli W3110, либо E.coli LE392, либо E. coli штамма 294, которые депонированы и имеют соответствующие шифры по каталогу АТСС 39936, 53010 и 53009, с одним из вектором экспрессии pMON3209, pMON3215 или pMON3213 в соответствии с приемами, которые более подробно описаны ниже. Трансформированные клетки E.coli W3110 затем культивируют при условиях, которые позволяют осуществить экспрессию генов соматотропина и продуцирование искомых гетерологических полипептидов.

Очистка полученного гетерологического пептида будет зависеть как от типа протеина, так и от клетки-хозяина. Было, например, замечено, что гетерологические протеины, полученные в такой бактерии, как E.coli, очень часто осаждаются внутри клетки в форме "преломляющих" тел. Здесь используют термин "преломляющий" ввиду того, что эти тела можно действительно наблюдать с использованием фазово-контрастного микроскопа. Способ, который используют для выделения гетерологических протеинов в биологически активной форме, описан в Европейской патентной заявке 114,506, опубликованной 1 августа 1984 года, которая здесь используется в качестве ссылки. Очень коротко, этот способ очистки содержит концентрирование клеток-хозяев, лизирование этих клеток с целью получения экстракта или гомогената клеток и, наконец, изоляцию преломляющих тел при помощи дифференциального центрифугирования; все эти стадии хорошо известны каждому специалисту в этой области техники. Изолированные преломляющие тела растворяют в сильном денатурирующем средстве, таком, как хлоргидрат гуанидина и солюбилизированный протеин, затем подвергают реакции обмена в подходящем растворителе например, мочевине, подвергают очистке при помощи хроматографии и, наконец, биологической активации для получения активной конфигурации, и затем окисляют так, чтобы сохранить эту конфигурацию, поддерживая дисульфидные связи между их цистеиновыми остатками, как это описано в Европейской патентной заявке 114,506. Более детальное описание такой очистки гетерологических протеинов дано в двух, одновременно находящихся в стадии рассмотрения, патентных заявках США, одной, поданной S.B.Storrs и озаглавленной "Methodof Somatotropin Solubilization", и второй, поданной L.A.Bentle, S.B.Storrs и J.W.Mitchell и озаглавленной "Method of Somatotropin Naturation", которые здесь используются в качестве ссылок. Две вышеупомянутые, одновременно находящиеся в стадии рассмотрения, патентные заявка США и настоящая заявка поданы от имени фирмы Монсанто Компани. Последующая очистка гетерологического полипептида с целью его освобождения от загрязняющих бактериальных протеинов может быть осуществлена с использованием известных хроматографических средств, таких как гелевая фильтрация или ионообменная хроматография. В общем случае полученная в результате очистки композиция будет содержать по весу примерно от 90% до 99,5% N-аланилового полипептида и примерно от 0,5% до 10% протеина, родственного бактерии или другому прокаристному хозяину, в котором полипептид был синтезирован.

Было установлено, что в общем случае по крайней мере примерно 80% гетерологического пептида, экспрессированного по способу настоящего изобретения, имеет N-концевую структуру типа NH₂-ala. Оставшийся полипептид в общем случае имеет метиониновую форму и содержит N-концевую структуру типа NH₂-met-ala. Однако варьируя условия роста и/или время индукции экспрессии гена можно увеличить долю полипептида с аланином на N-конце до по крайней мере 95% и даже больше.

В особенно предпочтительном варианте воплощения настоящего изобретения соматотропиновые полипептиды, продуцированные и изолированные в соответствии с описанием, приведенным выше, как было показано, проявляют биологическую активность, подобную активности соматотропина; этот факт был установлен при помощи анализа реакции рецепторов печени кролика, осуществленного в соответствии с описанием, приведенным Tsushima и Friesen, J. Clin. Endocrinol. Metab. (1973) 37: 334 337 и биоанализа на прирост веса крыс. В соответствии с последним анализом, биоактивности соматотропинов, продуцированных клетками E. coli, определялись относительно известной партии соматотропина например, бычьего или свиного гипофизарного соматотропина, связывая прирост веса крыс с удаленными гипофизами с изменением количества вводимого соединения. В частности, титрованные дозы от 0 до 60 мкг неизвестного или стандартного источника соматотропина вводились крысам с удаленными гипофизами 95 135 г в форме инъекций на основе ежедневной дозы в течение 7 и более дней. Используя множественную регрессию, составляли регрессионное уравнение для прироста веса тела животных, получающих известные и неизвестные партии гормона, в зависимости от логарифмических доз. Контролировали наклоны, чтобы гарантировать непараллелизм и обеспечить пересечение полученных множеств. Биоактивности представляли в виде отношения наклонов, умноженного на активность стандарта.

Применение N-аланиновых продуктов бГР, являющихся предметом изобретения, увеличивает надои молока у коров и, вероятно, уменьшает количество корма, необходимого для получения заданного выхода молока у таких коров. Применение к коровам молочной породы увеличивающего отделения молока количества тех видов бГР, которые содержат валин в позиции 126 или вблизи ее зрелого протеина бГР, особенно пригодно для увеличения производства молока этими коровами. Эти продукты, являющиеся предметом изобретения, могут быть применены к коровам при помощи инъекций, вливаний или имплантаций в полимеры или другие среды, использование которых для осуществления высвобождения требуемых доз в кровеносную систему известно. Можно использовать приемлемые с фармацевтической точки зрения основные формы, такие как растворы, эмульсии или гели, как заключенные в оболочку, так и без нее. Эти формы могут содержать только отдельные виды бГР или их варианты, а также любую, заранее прописанную комбинацию натурального и/или вариантного полипептидов, например, смесь бГР(А,В) и бГР(А, Л), и/или смесь бГР(А,В) и met-бГР(А). Дозы могут варьироваться по крайней мере примерно от 0,005 мг до 200 мг на одно животное в день, а в предпочтительном варианте примерно от 5 мг до 40 мг на одно животное в день. Наиболее эффективное количество для увеличения надоев молока и/или увеличения эффективности использования корма при получении молока можно определить при помощи серии экспериментов. Реальные предпочтительные дозы бГР зависят от таких параметров, как вес тела, общее состояние здоровья и кормовой статус каждого животного. Хотя для определения воздействия бГР на коров можно использовать такой показатель, как надой молока, для этой цели можно также использовать другие показатели продуктивности коров, такие как общая скорость роста и увеличение живого веса. Если это необходимо, то бГР может быть применен к коровам вместе с другими стимулирующими агентами, такими как биологически активные протеины, антигены и т.п. при этом обеспечивается более высокий эффект.

Приводимые ниже примеры служат иллюстрацией предпочтительных вариантов воплощения настоящего изобретения и их не следует рассматривать в качестве его ограничения, и каждому специалисту в этой области техники ясно, что из приведенного выше патентного описания можно осуществить различные модификации, не выходя за область, охватываемую его формулой изобретения.

Микроорганизмы и плазмиды Следующие микроорганизмы могут быть получены из Американского Собрания Типов Культур (АТСС), 12301 Парклаунд Драйв, Роквил, Мэриленд 20852, США (см. табл.2).

Настоящее изобретение не ограничивается теми микроорганизмами, которые были депонированы, так как депонированные организмы только иллюстрируют предмет настоящего изобретения.

Пример 1 Все олигонуклеотиды синтезировали в отделе Биологических наук фирмы Монсанто, используя синтезаторы ДНК фирмы Апплайд Биосистемз, в соответствии с процедурой, предложенной производителем, фирмой Апплайд Биосистемз Инк. Фостер Сити, Калифорния. Ферменты ограничения (сечения) и ферменты, модифицирующие ДНК, были получены от фирмы Нью Энгланд Биолабс (Беверли, Массачусетс), от фирмы Нью Энгланд Нуклеа (Бостон, Массачусетс) и от фирмы Бетесда Рисеч Лэбораториз (БРЛ) (Гайтерсбург, Мэриленд). Линкер XbaI получали от фирмы Коллаборатив Рисеч, Инк. (Лексингтон, Массачусетс). ДНК-лигазу Т4 получали от фирмы БРЛ (Гайтерсбург, Мэриленд). ДНК-киназу Т4 получали от фирмы Нью Энгланд Биолабс (Беверли, Массачусетс). Меченые ³²P нуклеотиды получали от фирмы Амершэм (Арлингтон Хайтс, Иллинойс). Фрагмент Кленоу ДНК-полимеразы I E.coli получали от фирмы Нью Энгланд Нуклеа (Бостон, Массачусетс). E.coli JM101 получали от доктора Джо Мессинга, Университет Миннесоты (Сент Пол, Миннесота).

Переваривание ферментом ограничения, реакции ДНК-лигазы Т4 и фрагменты Кленоу ДНК полимеразы I E.coli могут быть осуществлены в соответствии с приемами, предложенными производителями этих препаратов. Предпочтительными буферами для описываемых ниже ферментов ограничения являются следующие: для XbaI: 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис, рН 7,5, 10 мМ MgSO₄; для EcoRI, Hind III и SmaI: 50 мМ NaCl, 10 мМ Трис, рН 7,5, 10 мМ MgSO₄. Реакции ДНК-лигазы Т4 осуществляли в буферах, содержащих 25 мМ Трис, рН 8,0, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ дитиотритола (ДТТ), 2 мМ спермидина и 0,2 мМ АТФ. Фрагмент Кленоу ДНК полимеразы I E.coli использовали в буфере, содержащем 20 мМ Трис, рН 7,2, 10 мМ MgCl₂, 10 мМ (ДТТ), 1 мМ АТФ и 1 мМ каждого дАТФ, дГТФ, дЦТФ, дТТФ. Если необходимо было получить меченую, вновь синтезированную нить ДНК, то в реакцию Кленоу добавляли комплекс альфа-P³²-дАТФ (400 Ки/ммоль).

Меченые олигонуклеотиды получали с использованием гамма P³²-АТФ (уд. акт, более 5000 Ки/ммоль) и ДНК-киназы Т4 в 100 мМ Трис, рН 8,0, 100 мМ MgCl₂, 5 мМ ДТТ.

Плазмиды, несущие последовательности ДНК, кодирующие бГР(Л) и сГР(Ф) (pBGH_ex-1 и pPGH_ex-1 соответственно), были получены от фирмы Генентех, Инк. Сан-Франциско, Калифорния. Эти плазмиды могут быть получены в соответствии с описанием, приведенным в Европейской патентной заявке 75,444 (опубликованной 30 марта 1983 года); Seeburg et al. DNA (1983) 2(1): 37 45; Goeddel et al. Nature (1979) 281: 544 548; DeBoer et al. в книге Promoters: Structureand Function (1982); M.J.Chamberlin и R.Rodriguez ред. Глава 293; Miozzari и Yanofsky, J.Bacteriol.(178) 133: 1457 1466; и Rosenberg и Court, Annual Review of Genetics 13: 319 353. Как показано в Европейской патентной заявке 75,444 (DeBoer et al), первыми 21 транслированными кодонами в ДНК для бГР(Л) являются ATG TTC CCA GCT ATG TCT CTA TCT GGT CTA TTC GCT AAC GCT GTT CTT CGT GCT CAG CAT CTT или их функциональные эквиваленты. Другие, относящиеся к рассматриваемым здесь вопросам, материалы из приведенных выше публикаций также используются здесь в качестве ссылок.

M13mp8 и M13mp9 были получены от доктора Джо Мессинга из Университета Миннесоты (Сент Пол, Миннесота).

Все компоненты среды для выращивания бактерий и антибиотики получали либо от фирмы Сигма (Сент Луис, МО), либо от фирмы Дифко Лабораториз (Детройт, Мичиган).

Пример 2 Приводимые ниже примеры иллюстрируют конструкцию трех кодирующих последовательностей ДНК, которые в результате экспрессии обеспечивают прямое продуцирование в бактерии полипептидов, содержащих N-концевой аланин. В частности, кодирующие последовательности ДНК конструировали таким образом, что комплекс начало трансляции/кодон метионина (ATG) содержится непосредственно перед кодоном аланина (например, GCC). Эти три кодирующие последовательности, содержащие бГР(А, Л), бГР(А,В) и сГР(А), конструировали при помощи направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте ранее изолированных последовательностей ДНК соматотропина. Этот пример иллюстрирует также конструкцию кодирующей бГР(В) последовательности ДНК, которая в результате экспрессии в бактерии обеспечивает синтез met-бГР(В).

a. Конструкция кодирующей бГР(А,Л) последовательности ДНК Последовательность ДНК, кодирующую соматотропин, бГР(Л), выделяли из pGH_ex-1, как XbaI-фрагмент, и клонировали в сайте XbaI модифицированного вектора M13mp8 (M13mp8/XbaI). Конструкция вектора M13mp8/XbaI, который содержит линкер XbaI в исходном сайте SmaI, представлена на фиг. 1. Как показано на фиг. 2 XbaI рассекает в одном из концов кодирующую бГР(Л) последовательность ДНК, "вырезая" таким образом полную кодирующую бГР(Л) последовательность. Плазмиду pBGH_ex-1 после обработки ферментом XbaI смешивали в присутствии ДНК-лигазы Т4 с РФ ДНК M13mp8/XbaI, линеаризованной при помощи рассечения ферментом ограничения XbaI, и обрабатывали щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота. Затем смесь инкубировали в течение ночи при температуре 14^o C. Обработка щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота предотвращает рециркуляцию вектора M13mp8/XbaI. Вставку кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК в вектор M13mp9/XbaI с целью образования рекомбинантного вектора M13mp8/BGH_ex-1 первоначально контролировали образованием бесцветных бляшек на культуре бактерий E.coli JM101, выращенной на среде 1 х YT, используя процедуру покрытия мягким агаром, описанную в книге Molecular Cloning: A Laboratory Manual, ред. Maniatis, Frisch и Sambrook, (1982), cтр. 64, который содержит 10 мкл 100 мМ ИПТТ (изопропил-β-D-тиогалактопиранозида) и 50 мкл 2% (мас./об.) X-GAL (5-бромо-4-хлоро-3-индолил-b-D-галактопиранозида) в 3 мл верхнего агара, и осуществляли трансфекцию вышеупомянутым рекомбинантным вектором, как это было описано выше. Вставку кодирующей бГР(Л) последовательности подтверждали при помощи сечения изолированной РФ ДНК, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Frtsch и Sambrook, ред. (1982), глава 3, рекомбинантного вектора ферментом XbaI, в результате чего получали фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную последовательность. Фрагмент в 590 пар оснований идентифицировали при помощи электрофореза на агаровом геле в однопроцентном (мас./об.) агаре в соответствии с описанием, приведенным в книге Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch и Sambrook (ред.), (1982). Все последующие фрагменты после обработки ферментами идентифицировали именно при помощи этой процедуры. Ориентацию вставленных кодирующих бГР(Л) последовательностей контролировали при помощи сечения РФ рекомбинантного вектора ферментами SmaI и Hind III. Если кодирующие последовательности находятся в правильной 5ʹ _→ 3ʹ ориентации, в результате сечения этими ферментами ограничения должны получить фрагмент в 207 пар оснований. Изоляцию онДНК фага проводили в соответствии с процедурой, предложенной Messing et al. Gene (1982) 19: 269. Затем вектор M13mp8/BGH_ex-1 использовали в качестве матрицы при направленном на олигонуклеотиды мутагенезе в специальном сайте по существу в соответствии с описанием, данным Zoller и Smith, Nuc. Acids Res. (1982) 10: 6487 6500, Zoller и Smith Methods in Enzymol. (1983) 100: 468 - 500, Norris et al. Nuc. Acid Res. (1983) 11: 5103 5112, соответствующие места которых используются здесь в качестве ссылок.

На фиг. 3 приведена диаграмма процедуры мутагенеза при конструировании кодирующей бГР(А, Л) последовательности ДНК из кодирующей бГР(Л) последовательности. Если очень коротко, то олигонуклеотидную затравку (см. табл. 1), содержащую последовательность для искомой мутации, используют для синтеза затравки копии замкнутой кольцевой ДНК матрицы M13mp8/BGH_ex-1 онДНК. Полученные таким образом замкнутые кольцевые молекулы диДНК отделяли от неполных и однонитевых колец ДНК при помощи центрифугирования градиентов щелочной сахарозы, как это описано Zoller и Smith, Methods in Enzymol. (1983) 100: 468 500. Замкнутые кольцевые молекулы диДНК затем использовали для трансформации E. coli JM101 в соответствии с описанием, данным Messing et al. Gene (1982) 19: 269 276, и полученные в результате бесцветные бляшки поднимали на фильтры Полл, полученные от фирмы Полл Ультрафайн Фильтрашн Корп. (Глен Коув, Нью-Йорк), и просеивали с целью гибридизации с меченой ³²P формой олигонуклеотидной затравки, использованной для осуществления мутагенеза в специальном сайте. Подъем вышеупомянутых бляшек осуществляли в соответствии с методами, описанными производителе фильтров Полл. Просеивание с целью гибридизации осуществляли с использованием найлоновых фильтров Биодайн, которые описаны фирмой Полл Ультрафайн Фильтрашн Корпорейшн (Гленн Коув, Нью-Йорк) в ее материале "Protocol Guide for DNA Transfer to Pall Biodyne^TM A Nylon Filters" (1983). Фильтры промывали при увеличивающихся температурах до тех пор, пока не исчезнет радиоактивный сигнал с контрольного фильтра, который приготавливали с использованием фага M13mp8/bGH_ex-1. Общая методика промывки фильтров включает промывку при комнатной температуре в 6xSSC (0,9 М NaCl и 0,09 М цитрата натрия) в течение 10 мин, затем промывку при температуре 50^o C в 6xSSC в течение 5 мин и последующие промывки при увеличении температуры на 5^o C. Бляшки, которые гибридизировались с меченой радиоактивным элементом олигонуклеотидной затравкой при температурах более высоких, чем контрольные фаги, рассматривали как несущие новую созданную кодирующую бГР(А,Л) последовательность, и их называли в дальнейшем потенциально положительными. В качестве альтернативы, отдельные бесцветные бляшки отбирали из культуры трансформированных клеток E.coli JM101 и выращивали в 5 мл среды 2 х YT [1,6% (мас. /об. ) триптона, 1,0% (мас./об.) экстракта дрожжей, 0,5% (мас./об.) NaCl] в течение ночи при температуре 37^oC в условиях аэрации. ДНК фага, полученную в соответствии с описанием, данным Messing et al. Gene (1982) 19: 269, затем наносили пятнами на нитроцеллюлозу, подвергали гибридизации с затравкой, меченой радиоактивным элементом, и промывали при увеличении температуры, как это было описано выше. ДНК фага, которые имели температуры гибридизации выше, чем контрольные бляшки M13mp8/bGH_ex-1, также называли потенциально положительными. Потенциально положительные бляшки из обеих процедур просеивания выращивали в соответствии с описанием, приведенным выше, и использовали для получения онДНК фага, последовательность которой затем анализировали в соответствии с процедурой Sanger et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. U. S.A. (1977) 74: 5463 с тем, чтобы подтвердить что они действительно несут кодирующую бГР(А, Л) последовательность. РФ ДНК M13mp8/BGH_ex-1(ala) также просеивали при помощи анализа ферментом ограничения Hae III с тем, чтобы убедиться в присоединении кодона аланина после комплекса сигнал начала/кодона метионина ATG, так как при создании кодона аланина образуется дополнительный сайт ограничения Hae III. Вероятность присоединения кодона аланина к кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК составляет примерно 2% б. Конструкция кодирующей сГР(А) последовательности ДНК Здесь также использовали направленный на олигонуклеотиды мутагенез в специальном сайте для того, чтобы присоединить кодон аланина к кодирующей сГР(Ф) последовательности ДНК, описанной Seeburg et al. DNA (1983) 2(1): 37 45. Процедуру мутагенеза в соответствии с диаграммой, представленной на фиг. 8, осуществляли следующим образом.

Кодирующую сГР(Ф) последовательности ДНК в 590 пар оснований, содержащуюся на плазмиде pPGH_ex-1, выделяли из этой плазмиды при помощи сечения ферментами ограничения EcoRI и Hind III, которые рассекают плазмиду в 5'-3'-концах кодирующей сГР(Ф) последовательности pGH(G), соответственно, как это показано на фиг. 7. Рассеченную плазмиду pPHG_ex-1 затем смешивали с РФ ДНК M13mp9, также после рассечения ферментами EcoRI и Hind III, но дополнительно предварительно обработанной щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов ограничения M13mp9. Затем в вышеупомянутую смесь добавляли ДНК-лигазу Т4. Благодаря наличию липких концов на РФ ДНК фага и кодирующей сГР(Ф) последовательности ДНК, образованных при использовании двух различных ферментов ограничения, ДНК сГР(Ф) может быть селективно вставлена в РФ ДНК фага и может быть вставлена с правильной 5ʹ _→ 3ʹ ориентацией, как это показано на фиг. 7. Затем осуществляют трансформацию E.coli JM101 в соответствии с описанием, приведенным выше для M13mp8/BGH_ex-1, причем рекомбинантный вектор M13mp9/PGH_ex-1 несет кодирующую сГР(Ф) последовательность ДНК. Затем трансформированные E. coli JM101 выращивали на среде 1 x YT, содержащей колориметрические реагенты, и выбор осуществляли по образованию бесцветных бляшек, как это было уже описано выше. Вставку кодирующих сГР(Ф) последовательностей ДНК подтверждали следующим образом. Выбирали бесцветные бляшки, а РФ ДНК M13mp9/PGH_ex-1, изолированную в соответствии с описанием, приведенные выше, затем рассекали ферментами EcoRI и Hind III и подвергали электрофорезу на агаровом геле, в результате чего получали фрагмент в 590 пар оснований, содержащий вставленную ДНК сГР(Ф). Затем фаг M13mp9/PGH_ex-1 размножали в E. coli JM101, а он ДНК фага выделяли в соответствии с описанием, приведенным выше.

Далее, ДНК M13mp9/PGH_ex-1 использовали в качестве матрицы для направленного на олигонуклеотиды мутагенеза в специальном сайте, как это показано на фиг. 8, в соответствии с описанием, приведенным выше при конструировании кодирующей бГР(А, Л) последовательности, используя специальную затравку(см. табл. 3). Вероятность присоединения кодона аланина, в данном случае GCC, к кодирующей сГР(Ф) последовательности составила примерно 12% Полученную в результате кодирующую сГР(А) последовательность снова исследовали при помощи анализа ДНК-последовательности.

Пример 3
Этот пример служит иллюстрацией конструкции и экспрессии трех рекомбинантных векторов экспрессии, которые обеспечивают прямое продуцирование в бактериях полипептидов, содержащих N-концевой аланин. При это получают три полипептида, соматотропины видов бГР(А,Л), бГР(А,В) и сГР(А). Этот пример служит также иллюстрацией конструкции и экспрессии бГР(В) и экспрессии бГР(Л). Полученными таким образом полипептидами являются met-бГР(В) и met-бГР(Л), соответственно.

а. Экспрессия бГР(А,Л), бГР(А,В), бГР(Л) и бГР(В)
Последовательности ДНК, кодирующие бГР(А,Л), бГР(А,В) и бГР(В) и содержащиеся на рекомбинантных векторах M13mp8/BGH_ex-1 (ala), M13mp8/BGH_ex-1 (ala, val) и M13mp8/BGH_ex-1 (val) соответственно использовали для замены кодирующей бГР(Л) последовательности ДНК, содержащейся на плазмиде экспрессии pBGH_ex-1 (см. фиг. 5 и 6). Это делали при помощи переваривания соответствующих РФ ДНК М13 ферментом XbaI. Плазмиду экспрессии pBGH_ex-1 также переваривали ферментом XbaI и затем обрабатывали щелочной фосфатазой из кишечника крупного рогатого скота с тем, чтобы предотвратить повторную лигацию фрагментов ограничения. Каждую из переваренных РФ ДНК затем отдельно смешивали с переваренной и обработанной ДНК pBGH_ex-1, и подвергали лигации в соответствии с описанием, приведенным ранее, в течение ночи при 14^o C. Полученные таким образом рекомбинантные векторы экспрессии, которые обозначают pMON3209, pMON3215 и pMON3214, несут последовательности ДНК, кодирующие бГР(А,Л), бГР(А, В) и бГР(А), соответственно. Затем E.coli W3110 подвергали трансформации лигационной смесью, содержащей pMON3209 или pMON3215, или pMON3214, или pBGH_ex-1, и выращивали в бульоне Лаурина (БЛ), содержанием 1% (мас./об.) триптона, 0,5% (мас./об.) экстракта дрожжей и 0,5% (мас./об.) NaCl и содержащем 12,5 мкг/мл тетрациклина и 200 мкг/мл ампициллина. Штамм e.coli W3110, содержащий pMON3209, имеет шифр депонирования в ATCC 53024. Штамм E.coli W3110, содержащий pMON3215, имеет шифр депонирования в ATCC 53022. Трансформацию, если очень коротко, осуществляли следующим образом. Приблизительно 50 мл культуры E.coli W3110 выращивали в среде БЛ до ОП600 0,60. Затем клетки извлекали в виде таблетки и вновь суспендировали в 10 мл Буфера А, содержащего 25 мМ Трис, рН 7,6, и 10 мМ NaCl. Затем клетки извлекали в форме таблетки и вновь суспендировали в 1 мл Буфера А, в который добавляли 14 мл Буфера В, содержащего 25 мМ Трис, рН 7,6, 10 мМ NaCl, 50 мМ CaCl₂, и суспензию инкубировали на льду в течение 30 мин. Затем клетки извлекали в форме таблетки и вновь суспендировали в 3 мл Буфера В. Далее, порцию в 0,2 мл суспендированных клеток смешивали с 0,1 мл Буфера В и 0,1 0,5 мкг искомого рекомбинантного вектора экспрессии (pMON3209 или pMON3215, pMON3214 или pBGH_ex-1) и инкубировали на льду в течение 60 мин. Затем инкубированную смесь нагревали на 1 мин до 37^oC, после чего добавляли 3 мл среды БЛ; далее, полученную в результате смесь инкубировали в течение 60 мин при 37^oC. Далее клетки извлекали в форме таблетки и вновь суспендировали в 300 мл среды БЛ и выращивали на пластинках с БЛ, содержащих антибиотики, как это было описано выше. Далее, отбирали стойкие колонии и ДНК векторов экспрессии pMON3209, pMON3215, pBGH_ex-1 и pMON3214 выделяли в соответствии с процедурой, описанной в книге Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Maniatis, Fritsch и Sambrook (ред.) (1982). ДНК pMON3209, pMON3215, pBGH_ex-1 и pMON3214 исследовали на присутствие XbaI-фрагмента в 590 пар оснований и фрагмента Hind III/SmaI в 200 пар оснований, которое свидетельствует о наличии последовательностей ДНК, кодирующих бГР(А, Л), бГР(В) и бГР(А, В) с правильной ориентацией. Далее, плазмиды экспрессии pMON3209 и pMON3215 просеивали при помощи анализа ферментами ограничения Hae III с тем, чтобы убедиться в присутствии нового сайта Hae III, образовавшегося при присоединении кодона GCC (аланина). Наконец, фрагмент XbaI в 590 пар оснований из векторов pMON3209, pNOM3214 и pMON3215 частично анализировали на состав последовательности в соответствии с описанием, приведенным ранее, с тем, чтобы подтвердить присутствие в этих векторах экспрессии последовательностей ДНК, кодирующих бГР(А,Л), бГР(В) и бГР(А,В).

Каждую из колоний E.coli W3110, несущую pMON3209,pMON3214, pBGH_ex-1 или pMON3215, прививали отдельно в 5 мл БЛ, содержащего 12,5 мкг/мл тетрациклина, и выращивали в течение ночи при 37^oC при аэрации. После выращивания в течение ночи 0,5 мл каждой культуры использовали для прививания отдельно на 25 мл среды М9, содержащей (на литр среды) 100 мл 10Х соли [70 г Na₂HPO₄, 30 г KH₂PO₄, 5 г NaCl, 10 г NH₄Cl на 1000 мл общего объема] 1,2 мл 1М MgSO₄, 0,25 мл 0,1% B₁, 12,5 мл 20% (мас./об.) раствора глюкозы, 0,025 мл 1М СaCl₂, дополненной 0,5% (мас./об.) касаминовых кислот и 6,25 мкг/мл тетрациклина на содержащейся в 250-мл колбе. Каждую культуру после прививки выращивали при 37^oC при аэрации до тех пор, пока ОП600 (оптическая плотность в диапазоне 600 нанометров) не достигнет 1,0. Далее, порцию в 0,2 мл извлекали из каждой из вышеупомянутых колб и отдельно подвергали лизированию в буфере додецилсульфат натрия (ДСН)-полиакриламидный гелевый электрофорез (ПАГЭ) и анализировали при помощи ДСН-ПАГЭ в соответствии с описанием, приведенным Лаеммли, Nature, (1970) 227: 680 685. Протеины с молекулярным весом 22000 Да в высоких концентрациях были получены в культуре E.coli W3110 для обеих генетических конструкций. Кроме того, оба протеина в 22000 Да связывались в анализах Western Blot (см. Krivi и Rowold, Hybridoma (1984) 3: 252 262) с моноклональным антителом F11-A1-B6 (см. там же), выработанным против бычьего гипофизарного соматотропина, что подтверждает тот факт, что эти полипептиды связаны с гипофизарным соматотропином. Клетки культуры E.coli W3110, несущие родительскую плазмиду pBR322, не продуцируют протеин в 22000 Да, который связывает антитела на анти-соматотропин.

Бактерии, несущие плазмиды экспрессии pMON3209, pMON3214 pBGH_ex-1 и pMON3215, хранили следующим образом. Каждую колонию культуры E.coli W3110, трансформированную при помощи только одной плазмиды (pMON3209 или pMON3215, pMON3214 или pBGH_ex-1), выращивали в течение ночи при 37^oC в 5 мл БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина при аэрации. Порцию в 1 мл каждой культуры после выращивания в течение ночи добавляли отдельно в индивидуальные колбы, содержащие 25 мл БЛ плюс 12,5 мкг/мл тетрациклина и выращивали до достижения ОП600 1,0. Затем клетки из каждой колбы собирали центрифугированием при ускорении 6000 х г при 4^oC в течение 5 мин. Таблетки отдельно суспендировали снова в 12 мл БЛ плюс 7,5% (об./об.) ДМСО и очень быстро замораживали на сухом льду порциями в 1 мл. Далее, клетки хранили в холодильнике с жидким азотом. Кроме того, примерно 10 мкг очищенной ДНК плазмиды хранили при температуре -80^oC.

б. Экспрессия кодирующей сГР(А) последовательности ДНК
Как показано на фиг. 10, кодирующего сГР(А) последовательность, содержащуюся на рекомбинантном векторе M13mp9/PGH_ex-1 (ala), использовали для того, чтобы заменить кодирующую бГР(Л) последовательность ДНК, содержащуюся на модифицированном векторе экспрессии pBGH_ex-1. Модифицированный вектор экспрессии, pBGH_ex-1^*, содержит вектор экспрессии pBGH_ex-1, в котором сайт ограничения EcoRI, расположенный вверх от промотора триптофана (ptrp), был удален (см. фиг. 9). Модифицированный вектор экспрессии pBGH_ex-1^* конструировали при помощи частичного переваривания ферментом EcoRI pBGH_ex-1^* с последующей обработкой нуклеазой SI c тем, чтобы удалить липкие концы. Вектор pBGH_ex-1 после рассечения подвергали рециркуляции с использованием ДНК-лигазы Т4 и затем использовали для трансформации культуры E.coli JM101; все это осуществляли в соответствии с описаниями, приведенными ранее. ДНК плазмиды из каждой из колоний затем просеивали на присутствие фрагмента EcoRI/Hind III в 590 пар оснований, несущего кодирующую сГР(А) последовательность, и фрагмента EcoRI/PstI в 1050 пар оснований, несущего последовательность ptrp (см. фиг. 9). Удаление этого сайта ограничения EcoRI упрощает вставку в специальный сайт последовательности, кодирующей сГР(А), в вектор экспрессии pBGH_ex-1^* с правильной ориентацией, как это показано на фиг. 10. Рекомбинантный вектор экспрессии, полученный таким образом, в дальнейшем обозначается pMON3213. Смесь, содержащую pMON3213, далее использовали для трансформации культуры E.coli W3110, затем трансформированные клетки выращивали и подвергали селекции в соответствии с описанием, данным выше. Культура E.coli W3110, содержащая pMON3213, имеет шифр ATCC 53023. Замену кодирующей сГР(Л) последовательности кодирующей сГР(А) последовательностью в векторе экспрессии pBGH_ex-1^* подтверждали при помощи выделения ДНК pMON3213 и последующего сечения вышеупомянутого вектора экспрессии ферментами EcoRI и Hind III с тем, чтобы получить в результате фрагмент в 590 пар оснований, а сечение ферментов Hae III должно показать присутствие дополнительного фрагмента ограничения Hae III, который образуется из-за присутствия кодона аланина в кодирующей сГР(А) последовательности ДНК. Окончательное подтверждение присутствия кодирующей сГР(А) последовательности ДНК в векторе экспрессии pMON3213 получали при помощи частичного анализа последовательности фрагмента EcoRI/Hind III в 590 пар оснований в соответствии с описанием, приведенным выше.

Экспрессию кодирующей сГР(А) последовательности ДНК и продуцирование сГР(А) в культуре E.coli W3110 осуществляли при помощи тех же приемов, что были описаны ранее и использовались при получении бГР(А,Л) и бГР(А,В). Аналогичным образом были получены высокие концентрации протеинов в 22000 Да, что устанавливали при помощи анализа (SDS/-PAGE) ДСН/ПАГЭ, который был описан выше.

Клетки E. coli W3110, несущие вектор экспрессии pMON3213, хранили точно так же, как это было описано ранее, и использовали для получения в больших количествах сГР(А) (ферментацию осуществляли в 10 100 литровых емкостях) также в соответствии с описанием, приведенным выше. Содержание протеина сГР(А) в реакторе ферментации емкостью 100 литров составило снова приблизительно 1 г/л бульона; этот факт устанавливали при помощи радиоиммуноанализа Rosner et al. J. Immunol. Methjds (1982) 52: 175 181.

Пример 4
Этот пример осуществляли с тем, чтобы определить N-концевую аминокислотную последовательность гетерологических протеинов бГР(А, Л), бГР(А,В), met-бГР(В), met-бГР(Л) и сГР(А), полученных при помощи бактерий, как это описано в примерах реализации способа, являющегося предметом настоящего изобретения.

Соматотропиновые полипептиды, синтезированные в культуре E.coli, подвергали очистке из неочищенных, солюбилизованных преломляющих тел, содержащих один из бГР(А, Л), бГР(А,В), met-бГР(В), met-бГР(Л) или сГР(А) при помощи иммуноадсорбционной хроматографии в соответствии с описанием, данным Krivi и Rowold, Hybridoma (1984) 3: 151 161. Все три вида соматотропина, очищенные при помощи иммуноадсорбционной хроматографии, как оказалось, имели чистоту, превышающую 95% этот факт был установлен при помощи анализа ДСН-ПАГЭ с использованием 1 мкг очищенного протеина на геле с градиентом 7,5 15% (мас. /об.), осуществленного в соответствии с процедурой, описанной Лаеммли, Nature, (1970) 227: 680 685. Концентрации протеинов очищенных видов бГР определяли при помощи известного анализа с использованием высокоразрешающей жидкостной хроматографии.

Протеины, очищенные при помощи хроматографии, основанной на принципе иммунного сродства, для использования в анализе на N-концевую последовательность подвергали диализу до полного удаления воды, а затем подвергали лиофилизации. Перед выполнением анализа N-концевой последовательности очищенные протеины снова суспендировали в буфер бикарбоната аммония, содержащий 50 мМ бикарбоната аммония плюс 0,1% (мас./об.) ДСН и подвергали диализу против того же буфера с тем, чтобы удалить остаточные трис(оксиметил)аминометан(ТРИС) и глицин. Затем использовали Анализатор Последовательностей Протеинов Модели 470А фирмы Апплайд Биосистемс (фирма Апплайд Биосистемс, Инк. Фостер Сити, Калифорния) для анализа всех N-концевых последовательностей, как это описано Hunkapiller et al. (1983), Methods in Enzymol. 91: 399 413 и Hunkapiller et al. (1983), Methods in Enzymol. 91: 486 493.

В табл.4 показаны результаты анализа последовательностей для нескольких препараций полипептидов бГР(А,Л), бГР(А,В), met-бГР(В), met-бГР(Л) и сГР(А). Количество протеина с N-концевым метионином в таблице приведен в процентах от общего содержания соматотропина в пробе. Для определения количества метионина использовали два метода. При помощи непрямого метода количества NH₂-met-ala-phe в преобладающей популяции NH₂-ala-phe вычисляли исходя из различий в lag-сигналах. Так как эта процедура зависит от некоторой оценки "нормальной" последовательности lag, которая изменяется от цикла к циклу, она является лишь весьма грубой оценкой для содержащейся последовательности NH₂-ala-phe. Прямой метод, содержащий реакцию молекулярной деградации Эдмана, заключается в сравнении мощности сигналов от PTH-met до РТН-ala после отделения РТН-met от химического шума с использованием высокоразрешающей жидкостной хроматографии (ВРЖХ). "РТН" обозначает фенилтиогидантоин. В частности, реакция последовательной деградации Эдмана заключается во взаимодействия N-концевой аминокислоты с реагентом, который рассекают эту аминокислоту, и в ее последующем высвобождении в форме РТН-производного этой аминокислоты. Последняя процедура будет давать хорошие оценки в для met-ala-phe в том случае, если загрязнение свободной аминокислоты является низким.

Как показывают результаты относительно N-концевой последовательности, представленные в табл. 4, помещенной ниже, нет никаких очевидных признаков обработки метионина, если после N-концевого метионина следует фенилаланин. Однако, 80% и более молекул, продуцированных генетическими конструкциями MBS(А, Л) и MBS(А,В), скорее имеют аланин на N-конце, чем метионин. Степень обработки N-концевого метионина варьируется в клетках от ферментации к ферментации, но всегда составляет не менее 80% от всех молекул соматотропина. Кроме того, уровни продуцирования в приблизительно 10 15% от общего бактериального протеина были достигнуты для соматотропинов, синтезированных в трансформированных микроорганизмах.

Формула изобретения

Способ получения рекомбинантного полипептида со свойствами свиного гормона роста, включающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей промотор, действующий в Escherichia coli, сайт связывания с рибосомой, терминирующий кодон, сайт инициации трансляции, представленный кодоном для метионина, и расположенную непосредственно за названным кодоном последовательность ДНК, совпадающую в основном с последовательностью кДНК и кодирующую зрелую форму гормона, трансформацию полученной рекомбинантной плазмидой штамма E. coli, отбор и культивирование трансформантов в питательной среде, выделение и очистку целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве последовательности ДНК, совпадающей в основном с последовательностью кДНК и кодирующей зрелую форму гормона, используют последовательность, кодирующую зрелую форму свиного гормона роста pGH(A) с N-концевым аланином, а выделению и очистке подвергают полипептид, не содержащий метионина на N-конце.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13

MM4A Досрочное прекращение действия патента Российской Федерации на изобретение из-за неуплаты в установленный срок пошлины за поддержание патента в силе

Дата прекращения действия патента: 22.02.2004

Извещение опубликовано: 10.05.2005        БИ: 13/2005

---