Способ получения полипептидов в бесклеточной системе трансляции

 

СОЮЗ СОВЕТСКИХ

СОЦИАЛИСТИЧЕСКИХ РЕСПУБЛИК

ОПИСАНИЕ ИЗОБРЕТЕН

К АВТОРСКОМУ СВИДЕТЕЛЬСТВУ

ГОСУДАРСТВЕННОЕ ПАТЕНТНОЕ

ВЕДОМСТВО СССР (ГОСПАТЕНТ СССР) (21) 4823743/13 (22) 29.05,90 (46) 30.12.93 Бюп йв 48-47 (71) Институт белка Ан СССР (l2) Баранов ВИ„ Рябова ПА; Ярчук ОБ„ Спирин

АС. (54) СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ В

БЕСКЛЕТОЧНОЙ СИСТЕМЕ ТРАНСЛЯЦИИ (57) Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии и может быть использовано дпя препаративного синтеза полипептидов как в научны так и в прикладных целях Преимущественной областью использования является препаративный синтез биологически активных пептидов и белков. Цепью изобретения является унификация способа препаративного получения полипептидов в бескпеточных системах и повышение выхода и чистоты целевого продукта. Способ осуществляется в бескпеточных системах трансляции непрерывного действия, в которых используются бескпеточные системы трансляции, полученные из клеток любых (В) SU (11) 1839191 Al (51) 5 С1гРИ ог С07К102 организмов; в систему добавлены экзогенные PHKполимеразы; генетический материал подается в виде молекул ДНК содержащих соответствующий добавленной PHK-полимеразе промотор; из реакционной смеси непрерывно удаляются продукты реакции и непрерывно восстанавливаются исходные концентрации низкомолекулярных веществ Положительный эффект обусловлен возможностью препаративной экспрессии практически любых генов в виде молекул ДНК в любых бескпеточных системах трансляции. Способ может служить важным дополнением, а в некоторых случаях и альтернативной генно-инженерным методам и методу препаративной экспрессии генов в бескпеточной системе.

Способ не требует специальной наработки матричных РНК что значительно утрощает и удешевляет его в сравнении с известным способом препаративного синтеза полипептидов и белков в бескпеточных системах трансляции непрерывного действия

13 зл.ф-лы, 5 ил.

1839191

Изобретение относится к молекулярной биологии и биотехнологии, а именно к способам получения полипептидов в бесклеточных системах. Преимущественной областью использования является препаративный синтез биологически активных пептидов и белков, Известен способ препаративного синтеза полипептидов методом генной инженерии, основанным на внедрении в живую клетку чужеродной ДН К, генетический материал которой экспрессируется аппаратом клетки-хозяина (1 — 3).

К недостаткам этого известного способа относятся ограничения, накладываемые клеткой на продукты экспрессии гена, Это связано со сложностью выделения продукта экспрессии трансформированными клетками, летальностью некоторых целевых продуктов для клетки-продуцента, 20 элиминированием трансформированных плазмид из клетки. протеолитической деградацией или агрегацией продукта чужеродного гена, В результате только весьма ограниченный набор белков может быть эф- 25 фективно синтезирован известным спосо бом.

Известен способ препаративной экспрессии генов, основанный на использовании непрерывной бесклеточной системы З0 соп ряжен ной транскрипции/тра нсля ции (4). Непрерывные бесклеточные системы сопряженной транскрипции/трансляции свободны от ограничений, накладываемых клеткой, и обеспечивают препаративную 35 экспрессию практически любых генов в виде молекулы ДНК, сконструированной нужным образом.

К недостаткам этого известного способа относятся ограничения на использова- 40 ние бесклеточных систем эукариот. Дело в том, что при.экспрессии генов указанным способом используются эндогенные PHKполимеразы того обьекта, из которого приготовлена бесклеточная система 45 сопряженной транскрипции/трансляции.

Это приводит к необходимости использования специальных методик выделения клеточного экстракта, обеспечивающих сохранность активности эндогенных PHK- 50 полимераз. Более того, в клетках эукариот процессы транскрипции и трансляции, как правило, разнесены в пространстве и во времени: процесс транскрипции осуществляется в клеточном ядре, а процесс трансля- 55 ции происходит s цитоплазме клетки после соответствующих модификаций мРНК, В связи с этим получить надежную систему сопряженной системы транскрипции/трансляции на основе экстрактов зукариотических клеток до настоящего времени не удалось. Единственный метод, обеспечивающий надежное получение таких экстрактов, основан на получении экстракта S30 из бактериальных клеток Esherichia coli. Однако данный способ также имеет существенный недостаток; всякая плазмида, содержащая интересующий нас клонированный ген, имеет в своем составе ген селекции (ген устойчивости к какому-либо антибиотику), который также находится под промотором РНК-полимеразы Е. со!! и экспрессируется столь же эффективно, как и интересующий нас ген. В результате в процессе функционирования дополнительно к нужному продукту в системе экспрессируется побочный продукт, В качестве прототипа выбран способ препаративного синтеза полипептидов в бесклеточных системах трансляции непрерывного действия с использованием матричных РНК, состоящий в том, что в бесклеточных системах трансляции осуществляют непрерывное удаление из реакционной смеси продуктов реакции, включая синтезированный полипептид, и непрерывное восстановление концентрации низкомолекулярных субстратов (5), Указанный способ позволяет осуществлять препаративный синтез практически любых полипептидов в бесклеточных системах трансляции, полученных из клеток любых организмов, Так, например, известен способ синтеза кальцитонина в бесклеточной системе трансляции непрерывного действия на основе лизата из зародышей пшеницы. В 1 мл бесклеточной системы содержится 0,5 мл лизата зародышей пшеницы, 0,1 нмоль мРНК кальцитонина, 64 мкг креатинфосфокиназы, 10 мкг ингибитора рибонуклеаз из плаценты человека, по 0,1 мкг ингибиторов протеаз (апротинин, пепстатин, лейпептин) в буфере: 40 мМ НЕРЕЯ, рН 7,6, 75 мМ К ацетата, 1,9 MM Mg ацетата, 0,25 мМ спермидина, 6 мМ дитиотреита, 1,5 g, глицерина, 2 мМ АТР, 50 мкМ GTP, 8 мМ креатинфосфата, 25 мкМ (Н) лейцина (активность 50 з

Ки/ммоль) и по 25 мкМ остальных 19 аминокислот.

Бесклеточную систему помещают в ячейку для ультрафильтрации фирмы

"Amicon" и проводят синтез полипептидов при температуре 25 С. Отбор продуктов трансляции, включающих целевой продукт и продукты распада, (АМР, GDP, пирофосфат и неорганический фосфат) осуществляют через полупроницаемую мембрану с одновременной подачей субстратов в виде

ATP, GTP и аминокислот в течение 20 ч, В результате за время работы бесклеточной

1839191 акционную смесь вносят в резервуар, ограниченный от -окружающего пространства полупроницаемой перегородкой, где и протекает процесс сопряженной транскрипции/трансляции. Полупроницэемая перегородка может быть как органического, так и неорганического происхождения, В качестве полупроницаемой перегородки могут быть использованы ультрафильтраци0 онные мембраны, полые волокна, микр< апсулы или пленки, оболочка которых представляет собой полиэлектролитные комплексы. Для предотвращения остановки процесса иэ резервуара через полупроницаемую перегородку непрерывно отводят продукты транскрипции (неорганические фосфаты, ADP, GDP, CDP, UDP) и трансляции (синтезированный полипептид, АМР, GDP, неорганические фосфаты и пирофосфаты).

Одновременно в резервуар подают аминокислоты, ATP, GTP, CTP, UTP для восстановления их исходной концентрации, Синтезированный полипептид собирают на колонке с сорбентом, а продукты транскрипции и трансляции собирают в специальном резервуаре для их последуощей регенерации. Соотношения компонентов в реакционной смеси, ионные и температурные условия синтеза определяются свойствами организмов, из которых приготовлены бесклеточные системы и экзогенные PHKполимеразы. Диапазон этих условий достаточно широк. Способ позволяет осуществлять сопряженную транскрипцию/трансляцию в экстрактах из таких организмов, для которых сопряжение процессов трансляции и транскрипции in

vivo невозможно, Предлагаемый способ обеспечивает препаративный синтез полипептидов с постоянно высокой скоростью в течение десятков часов с выходом функционально активного продукта (полипептида)

1-10 нмоль с 1 мл реакционной смеси.

На фиг.1,2,3,4,5 изображены графики зависимости количества синтезируемого полипептида (нмоль) от времени синтеза (ч).

Для катализа реакции из бесклеточной системы транскрипции/трансляции из ретикулоцитов кролика взято 10 мл реакционной смеси до и через 0,5 ч после начала работы, Для катализа реакции из непрерывной бесклеточной системы транскрипции/трансляции из ретикулоцитов кролика взято также 10 мкл раствора А, содержащего продукты экспрессии, через 5.7,9 и 12 ч после начала работы непрерывной системы, Пример 1. Сопряженная транскрипция/трансляция фермента дигидрофолат истемы трансляции получают 10 нмоль альцитонина, что составляет 100 пмоль олипептида на 1 пмоль мРНК.

К недостаткам этого способа относится евозможность экспрессии генетического атериала в виде ДНК. Основанный на беслеточных системах трансляции, данный пособ использует матричные РНК. Это озачает, что для реализации способа необхоима дополнительная работа по синтезу 1 атричных PHK тем или иным способом. В о же время основная масса полипептидов белков в живых клетках закодирована в иде молекул ДНК. Различными генно-иненерными манипуляциями в настоящее 15 ремя выделено огромное число генов в вие молекул ДНК. Кроме того, синтез и разножение искусственных генов в виде олекул ДНК представляет собой несравенно более простую задачу, чем наработка атрич н ых P H K.

Целью изобретения является унификаия способа препаративного получения полипептидов в бесклеточных системах и

1звышение выхода и чистоты целевого про- 25 д кта.

В бесклеточных системах трансляции н прерывного действия, в процессе работы к торых осуществляется непрерывное выв дение продуктов трансляции, в том числе 30 и ипептидов, АМР, ADP, GDP, CDP, UDP, и, фосфатов и неорганических фосфатов, с дновременным введением в систему субс ратов в виде аминокислот„АТР, GTP, CTP, U P для поддержания их исходной концен- 35 т ации, используются гены белков в виде м лекулДНК, имеющих промоторныеучастк, специфичные к чужеродным экзогенным

P К-полимеразам, а в систему трансляции д бавляются экзогенные РНК-полимеразы, 40 с ответствующие выбранным промоторам.

Сущность предложенного способа зак ючается в следующем. Экстракты прокар отических или эукариотических клеток. с,держащие рибосомы и все компоненты 45 а парата трансляции, но свободные от энд генных мРНК и ДНК, готовят известными м тодами. К экстракту добавляют низкомол кулярные компоненты транскрипции и тр, нсляции (аминокислоты, ATP, GTP, CTP, 50

U P), ген в виде молекулы ДНК, имеющие ли ерный участок, являющийся промоторо для экзогенной PHK-полимеразы, причем такая конструкция может быть ис ользована как в виде фрагмента ДНК, та и в виде плазмиды, экэогенную PHKпо имеразу, специфичную для выбранного пр мотора, а также в случае необходимости ин ибиторы эндогенных РНК-полимераз орга изма, иэ которого получен экстракт. Ре1839191 редуктазы с плазмиды, содержащей ген дигидрофолат редуктазы под промотором ЯР6 полимеразы, в бесклеточной прокариотической системе трансляции из Е. coll.

Получают плазмиду, содержащую ген 5 дигидрофолат редуктазы под промотором

SP6 полимеразы.

Сопряженную систему транскрипции/трансляции готовят следующим образом. 10

1 мл реакционной смеси содержит 350 мкл S30 экстракта иэ E. coti, 0,2 мг тРНК, 0,1 мг плазмиды, 20000 U SP6 полимеразы, 0,1 мг пируват киназы, 50 U рибонуклеазного ингибитора иэ плаценты человека, по 5 мкг 15 ингибиторов протеаз (леупептина, химостина) и а2-макроглобулина в буфере А: 50 MM

Трис*Ас, рН 7,5, 14 мМ М9С!г, 100 мМ КАс, 2 MM CaAcz, 1 мМ АТР, 04 мМ GTP, 04 мМ

СТР, 0,4.мМ UTP, 10 мМ фосфоенолпирува- 20 та, 4,0 мМ дитиотреита, 50 мкМ спермидина, 10 мкг лейковорина, 40 мкМ рифампицина, ингибитора PHK-полимеразы Е. coll, 30 мкМ (S) Met с удельной радиоактивностью 800

МКи/ммоль и по 30 мкМ каждой из осталь- 25 ных 19 аминокислот.

Синтез проводят при температуре 37 С в реакционной ячейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 1 5 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осу- 30 ществляют путем отбора питательной смеси, прошедшей через ультрафильтрационную мембрану, с одновременной подачей в ячейку буфера А в течение 24 ч. 35

В течение всего времени синтез продукта проходит с постоянной скоростью (фиг.1), В результате синтезируют 680 пмоль фермента дигидрофолат редуктаэы за 24 ч работы. Синтезированный фермент 40 функционально активен. Удельная активность полученного фермента составляет

0,13*10 4 ед. активности на 1 пмоль синтезированного фермента.

В данном случае плазмида содержит 45 ген дигидрофолат редуктаэы под промотором ЯР6 полимеразы и ген Р-лактамазы под промотором PHK-полимераэы Е, coll. Поскольку в систему вводят ингибитор PHKполимераэы Е, соИ рифампицин, в системе 50 синтезировался только целевой продукт дигидрофолат редуктаэа высокой чистоты, не содержащий каких-либо примесей Р-лактамазы.

П р и и е р 2. Сопряженная транскрип- 55 ция/трансляция Р -лактамазы с фрагмента

ДНК, содержащего ген Р -лактамазы и короткий участок промотора Т7 полимераэы, в бесклеточной прокариотической системе трансляции из Е, coll.

Получают плазмиду, содержащую ген предшественника j3-лактамаэы и промотор для Т7 полимеразы.

Сопряженную систему транскрипции/трансляции готовят следующим образом.

1 мл реакционной смеси содержит 350 мкл S30 экстракта из Е. coll, 0,1 мг тРНК, 0,04 мг фрагмента ДНК, 30000 U Т7 полимераэы, 0,1 мг пируват киназы, 50 0 рибонуклеаэного ингибитора из плаценты человека, по 5 мкг ингибиторов протеаз (леупептина, химостина) иа2-макроглобулина в буфере А:

50 MM Трис*Ас, рН 7,5, 14 мМ Mg Clz, 100 мМ

КАс, 2 мМ CaAcz, 1 мМ АТР, 0,4 мМ GTP, 0,4 мМ СТР, 0,4 мМ UTP, 10 мМ фосфоенолпирувата, 4,0 мМ дитиотреита, 50 мкМ спермидина, 10 мкг лейковорина, 40 мкМ рифампицина, 30 мкМ (H) Leu с удельной радиоактивностью 1,7 Ки/ммоль и по 30 мкм каждой из остальных 19 аминокислот.

Синтез проводят при температуре 37 С в реакционной ячейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 2 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осуществляют путем отбора питательной смеси, прошедшей через ультрафильтрационную мембрану, с одновременной подачей в ячейку буфера А в течение 20 ч.

В течение всего времени синтез продукта проходит с постоянной скоростью (фиг.2).

В результате синтезируют 250 пмоль P -лактамаэы эа 20 ч работы системы.

Пример 3, Сопряженная транскрипция/трансляция дигидрофолат редуктаэы с плаэмиды, содержащей ген дигидрофолат редуктазы под промотором SP6 полимераэы в бесклеточной эукариотической системе трансляции из зародышей пшеницы.

Получают плазмиду, содержащую ген дигидрофолат редуктазы под промотором

SP6 полимеразы.

Сопряженную систему транскрипции/трансляции готовят следующим образом.

1 мл инкубационной смеси содержит

320 мкл экстракта иэ зародышей пшеницы, 0,1 мг плаэмиды, содержащей ген дигидрофолат редуктаэы, 20000 U SP6 полимеразы, 0,1 мг пируват кинаэы, 50 0 рибонуклеазного ингибитора из плаценты человека, по 5 мкг ингибиторов протеаэ(леупептина, химостатина) и а 2-макроглобулина в буфере А:

40 мМ НЕРЕЯ, рН 7,6, 2,5 мМ MgAcz, 70 мМ

КАс, 1 мМ АТР, 0 4мМ GTP, 0 4 мМ СТР, 04 мМ UTP, 0,25 MM спермидина, 4,0 мМ дити1839191

10 отреита, 6 мМ креатинфосфата, 20 мкМ (14С)

Leu с удельной радиоактивностью 21 мКи/ммоль, 20 мкМ каждой иэ 19 остальных аминокислот.

Синтез проводят при температуре 24 С в реакционной ячейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 2 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осуществляют путем отбора питательной смеси, прошедшей через ультрафильтрационную мембрану, с одновременной подачей в ячейку буфера А в течение 24 ч.

В течение всего времени синтез продукта проходит с постоянной скоростью (фиг.3).

В результате синтезируют 5 нмоль фермента дигидрофолат редуктазы за 24 ч работы.

Синтезированный фермент функционально

15 активен. Удельная активность полученного фермента составляет 0,25*10 ед. активно- 20

-4 сти на 1 пикомоль синтезированного фермента.

Пример 4. Сопряженная транскрипция/трансляция хлорамфеникол ацетилтрансферазы с плазмиды, содержащей ген 25 хлорамфеникол ацетилтрансферазы под промотором SP6 полимераэы, в бесклеточной эукариотической системе трансляции из ретикулоцитов кролика.

Получают плазмиду, содержащую ген 30

xr ðàìôåíèêoë ацетилтрансферазы под пр:-4отором SP6 полимеразы, Сопряженную систему транскрипции/трансляции готовят следующим образом. 35

1 мл инкубационной смеси содержит

600 мкл лизата из ретикулоцитов кролика, 0,1 мг плазмиды, содержащей ген хлорамфеникол ацетилтрансферазы под промотором SP6 PHK-полимераэы, 30000 U ЯРб 40 полимеразы., 0,1 мг пируват киназы, 50 U рибонуклеаэного ингибитора из плаценты человека, по 5 мкг ингибиторов протеаэ (леупептина, химостатина) и а2-макроглобулина в буфере А: 25 мМ НЕРЕЯ, рН 7,6, 1,5 мМ 45

MgAcz, 100 мМ КАс, 1 мМ АТР, 0,4 мМ GTP, 0,4 мМ СТР, 0,4 мМ UTP, 0,25 мМ спермидина, 4,0 мМ дитиотреита, б мМ креатинфосфата, 20 мкМ (S) Met с удельной радиоактивностью 800 мКиlммоль, 20 мкМ 50 каждой из 19 остальных аминокислот, Синтез проводят при температуре 34 С

1 в реакционной ячейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 1,5 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осу- 55 ществляют путем отбора питательной сме,си, прошедшей через ультрафильтрационную мембрану, с одно1 временной подачей в ячейку буфера А в те чение 34 ч, В течение всего времени синтез продукта и роходил с постоянной скоростью (фиг.4).

В результате синтезируют 2,5 нмоль фермента хлорамфеникол ацетилтрансфераэы за 34 ч работы. Синтезированный фермент функционально активен.

Пример 5. Сопряженная транскрипция/трансляция фермента дигидрофолат редуктазы с плазмиды, содержащей ген дигидрофолат редуктазы под промотором ЯРб полимеразы, в бесклеточной эукариотической системе трансляции из ретикулоцитов кролика.

Получают плазмиду, содержащую ген дигидрофолат редуктазы под промотором

SP6 полимеразы.

Сопряженную систему транскрипции/трансляции готовят следующим образом.

1 мл инкубационной смеси содержит

600 мкл лизата из ретикулоцитов кролика, 0,1 мг плазмиды, содержащей ген дигидрофолат редуктазы, 30000 U SP6 полимераэы, 0,1 мг пируват киназы, 50 U рибонуклеаэного ингибитора из плаценты человека. по 5 мкг ингибиторов протеаз (леупептина, химостатина) и а2-макроглобулина в буфере А: .

25 мМ НЕРЕЯ, рН 7,6, 1,5 мМ MgAcg, 100 мМ

КАс, 1 мМ АТР, 0,4 мМ GTP, 0,4 мМ СТР, 0,4

MM UTP, 0,25 мМ спермидина, 4,0 MM дитиотреита, 6 MM креатинфосфата, 20 мкМ (С)

Leu с удельной радиоактивностью 21 мКи/ммоль, 20 MKM каждой иэ 19 остальных аминокислот.

Синтез проводят при температуре 34 С в реакционной ячейке. Питательную смесь пропускают со скоростью 2 мл в 1 ч. Отбор целевого продукта и продуктов распада осуществляют путем отбора питательной смеси, прошедшей через ультрафильтрационную мембрану. с одновременной подачей в ячейку буфера А в течение 20 ч.

В течение всего времени синтез продукта проходит с постоянной скоростью (фиг.5).

В результате синтезируют 7,0 нмоль фермента дигидрофолат редуктазы эа 20 ч работы. Синтезированный фермент функционально активен. Удельная активность полученного фермента составляет

-4

0,3*10 ед. активности на 1 пмоль синтезированного фермента.

Использование изобретения дает возможность препаративной экспрессии практически любых генов в виде молекул ДНК в любых бесклеточных системах трансляции.

Способ может служить важным дополнением, а в некоторых случаях и альтернативой генно-инженерным методам и методу препаративной экспрессии генов в бесклеточ1839191

2, Вrammar W.J. — In; Genetic

Engineering. 1982, чЗ, р,53, (ed, Williamson

R.), Academic Press inc„London.

3. Frazer А,C„Curtlss R. — Curr. Top.

5 Microbiol. Immunol„1975, v.69, р.1.

4, Вагапоч Ч I„Morozov I.Yu., Ortiepp

S.À., Splrln А.S. — Gene, 1989, к84, р,463.

5. Spirln А.S., Baranov ЧЛ., Ryabova L.À„

Ovodov S.Yu., Alakhov Yu.Â. — Science, 1988, 10 v.242, р.1162.

Формула изобретения

1. СПОСОБ ПОЛУЧЕНИЯ ПОЛИПЕПТИДОВ В БЕСКЛЕТОЧ НОЙ СИСТЕМЕ

ТРАНСЛЯЦИИ, включающий экспрессию генов в бесклеточной системе сопряженной транскрипции/трансляции, непрерывное выведение продуктов экспрессии генов, в том числе полипептидов, АМР, ADP, GDP, CDP, UDP, пирофосфатов и неорганических фосфатов, с одновременным введением в систему субстратов в виде аминокислот, ATP, GTP, CTP, UTP для поддержания их исходной концентрации, от-25 личающийся тем, что, с целью унификации способа и повышения выхода и чистоты целевого продукта, экспрессируют гены белков в виде молекул ДНК, имеющих промоторные участки, специфичные к чуже- 30 родным экзогенным PHK-полимеразам, а в систему трансляции добавляются экзогенные PHK-полимеразы, соответствующие выбранным промоторам.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, 35 что ген в виде молекулы ДНК имеет промо-. тор, специфичный к фаговой PHK-ïîëèìåразе, а в систему добавлена соответствующая фаговая PHК-полимераза. 40

3. Способ по п.2, отличающийся тем, что в системе используется PHK-полимераза фага Т7.

4. Способ по п.2, отличающийся .тем,45 что в системе используется PHK-полимераза фага SP6. ной системе, Способ не требует специальной наработки матричных РНК, что значительно упрощает и удешевляет его в сравнении с известным способом препаративного синтеза полипептидов и белков в бесклеточных системах трансляции. (56) 1. Graham РЛ ., чап der Eb А.J. - Virology, 1973, ч.52, р.456.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что в бесклеточной системе трансляции используется ген в виде амплифицированного фрагмента ДНК, 6. Способ по п.1, отличающийся тем, что в бесклеточной системе трансляции используется ген, находящийся в плазмиде, 7. Способ по п.1. отличающийся тем, что используется прокариотическая бесклеточная система.

8. Способ по п,7, отличающийся тем, что прокариотическая бесклеточная система основана на экстрактах из Е.coll.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что в систему добавлены ингибиторы эндогенных P HK-полимераэ.

10, Способ по п.1, отличающийся тем, что используется эукариотическая бесклеточная система.

11. Способ по п.10. отличающийся тем, что эукариотическая бесклеточная система основана на экстрактах иэ клеток растений, 12. Способ по п.11, отличающийся тем, что используются экстракты из зародышей пшеницы.

13. Способ по п.10, отличающийся тем, что эукариотическая бесклеточная система основана на лизатах клеток животных.

14. Способ по п,13, отличающийся тем, что используются лизаты ретикулоцитов кролика.

0 о го

Фиг. I

0.1

Фиг.2

О.б

И

0.5

1 о 0,4 о.э о в 02 сэ 0.1 ф

О 05

1839191

10 15

Время, ч

Время, ч

20 25

1839191

И

И

И

1 ф и 1 О 1б

Время, ч

Фиг.3

И г э 1.б ф 1

О О,б о

О б lO 1б 20 гб 30 об

Время, ч

Фиг, 4

1839191 з

И 2 о о

Время, ч

Фиг.5

P акто

Заказ 3404

Производственно-издательский комбинат "Патент", г. Ужгород, ул.Гагарина, 101 и

Ы »

Ф

5 (D

Составитель Л. Рябова

Тех ед М.Мо гентал Ко ректор С. Юско

Тираж Подписное

НПО "Поиск" Роспатента

113035, Москва, Ж-35, Раушская наб., 4/5