Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана

 

Сущность изобретения: хитозан, растворенный в ацетатном буфере, подвергают ферментативному расщеплению с использованием иммобилизованного на инертном носителе хитиназного комплекса. Процесс проводят в две стадии - сначала при рН 4,5-5,0, 45-50^oC в течение 16 часов и при массовом соотношении хитозан : иммобилизованный на инертном носителе хитиназный комплекс, равном 1:10, затем при рН 6,0-6,5, 37^oC в течение 8-12 часов и массовом соотношении хитозан : иммобилизованный на инертном носителе хитиназный комплекс, равном 1:10.

Изобретение относится к олигосахаридным соединениям, конкретно к олигомерам хитозана (олигомерам Д-глюкозамина).

Хитозан низкомолекулярный водорастворимый, представляющий собой смесь таких олигомеров, может быть использован в качестве противовирусного и противоопухолевого препарата, в качестве радиопротектора и может быть использован для конъюгации с биологически активными соединениями различного спектра действия.

Известен способ получения олигомеров хитозана химическим гидролизом с помощью соляной кислоты [1] Однако выход водорастворимых продуктов, получаемых этой процедурой очень низок, условия проведения реакции жесткие и в гидролизате получается большой процент мономера (глюкозамина).

Наиболее близкими по составу и строению к предполагаемому решению являются олигомеры хитозана, получаемые с помощью очищенной хитозаназы Bacillus sp. N 7-М. Однако получаемый по данному способу хитозан низкомолекулярный водорастворимый вследствие проведения гомогенного катализа загрязнен хитозаназой, что недопустимо для медицинских препаратов. К тому же фермент может быть использован только один раз, что несомненно повышает себестоимость продукта и снижает технологичность схемы получения.

Задачей настоящего изобретения является получение хитозана низкомолекулярного водорастворимого, который может быть использован в качестве носителя биологически активных соединений при получении противовирусных и противоопухолевых препаратов, а также в качестве иммуномодулятора.

Поставленная задача решается тем, что 1% раствор хитозана в ацетатном буфере подвергают ферментативному расщеплению иммобилизованным на носителе хитиназным комплексом Streptomyces Kurssanovii при рН 4,5-5,0 до средневязкостной молекулярной массы около 20000-30000 дальтон при 45-50^oC в течение 16 часов, а затем таким же иммобилизованным препаратом хитиназ при рН 6,0-6,5 при 37^oC в течение 8-12 часов до получения целевых продуктов. В качестве источника хитиназного комплекса могут быть использованы и другие культуры, например: Serratia marcescens, Trichoderma harzianum, Streptomyces griseus, Bacillus thuringiensis и др.

Иммобилизованные препараты хитиназ были стабильны при использовании 10 и более раз. При хранении они сохраняли ферментативную активность не менее двух лет.

Полученный продукт в лиофильно высушенном виде представляет собой белый аморфный порошок хорошо растворимый в воде и физиологическом растворе. Содержание основного вещества в продукте не менее 95% Его молекулярная масса по данным гельпроникающей хроматографии и по вискозиметрическим измерениям составляла около 1000-3000 дальтон. В продукте отсутствовал примесный белок и липиды. Он являлся нетоксичным и апирогенным веществом.

Пример 1. Силикагель МСА-2500 (10 г) суспендируют в 50 мл 0,1 М фосфатного буфера, рН 7,2 и добавляют 35 мл 25% водного раствора глутарового альдегида, перемешивают 30 минут при комнатной температуре, отмывают на фильтре этим же буфером (1000 мл) и суспендируют в 100 мл (массовое соотношение к носителю 10: 1) фильтрата культуральной жидкости Streptomyces kurssanovii в течение 16 часов при комнатной температуре. Затем отмывают на фильтре 2М хлористым натрием (1000 мл), водой (500 мл), суспендируют в 100 мл фосфатного буфера (рН 7,2) и добавляют 100 мг NaBH₄, перемешивают 30 минут и отмывают на пористом фильтре до отсутствия поглощения при Д₂₈₀. Полученный катализатор суспендируют в 100 мл 1% раствора хитозана в 0,1 М ацетатном буфере при рН 4,5 (массовое соотношение катализатор хитозан - 10:1) и перемешивают при 50^oC в течение 16 часов. Затем катализатор отделяют от раствора хитозана, имеющего средневязкостную ММ около 20000 Да, подщелачивают раствор до рН 6,5, добавляют 10 г иммобилизованного хитиназного комплекса (массовое соотношение катализатор хитозан 10:1) и перемешивают при 37^oC в течение 8 часов. Катализатор отфильтровывают и получают раствор низкомолекулярного водорастворимого хитозана со средневязкостной молекулярной массой около 1000-2000 Да. По данным гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 (размер 1100х35 мм) молекулярная масса получающегося продукта около 2000 Да. Продукт обессоливают и лиофильно высушивают. Содержание основного вещества не менее 95% Выход на исходный хитозан около 90% Содержание белка менее 0,05% Пример 2. Аналогично примеру 1, но рН на первой стадии гидролиза был 5,0, а на второй стадии гидролиза рН 6,0 и время проведения второй стадии составляет 12 часов. Получаемый низкомолекулярный хитозан имел средневязкостную молекулярную массу не более 1000 Да. Данные гельпроникающей хроматографии на акрилексе Р-2 (1100х35 мм) дают значение молекулярной массы около 1500 Да.

Пример 3. Аналогично примеру 1, но вторую стадию гидролиза проводили при рН 6,2 и получали продукт по средневязкостной молекулярной массой не более 1000 Да. Данные гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 дают значение молекулярной массы около не более 1500 Да.

Пример 4. Аналогично примеру 1, но первую стадию гидролиза проводили при рН 4,7 и температуре 45^oC. Получали продукт со средневязкостной молекулярной массой около 1500 Да. Данные гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 дают значение молекулярной массы около 2000 Да.

Пример 5. Аналогично примеру 1, но был использован хитиназный комплекс из фильтрата культуральной жидкости Serratia marcescens. Получали продукт со средневязкостной молекулярной массой около 3000 Да. Данные гельпроникающей хроматографии на колонке с акрилексом Р-2 дают значение молекулярной массы около 3000 Да.

Пример 6. Аналогично примеру 1, но в качестве водонерастворимого носителя для иммобилизации хитиназного комплекса был использован силохром С-80 в количестве 10 г. Получали продукт со средневязкостной молекулярной массой около 2500 Да. Результаты гельпроникающей хроматографии с акрилексом Р-2 дают значение молекулярной массы около 3000 Да.

Таким образом заявленный способ позволяет получить хитозан водорастворимый низкомолекулярный, обладающий хорошей растворимостью и высокой степенью чистоты. Полученный продукт очень перспективен для применения в качестве потенциального противоопухолевого и противовирусного препарата и в еще большей степени проявляющий эти свойства как носитель соответствующих биологически активных соединений.

В частности, для фотодинамической терапии опухолей были получены ковалентные конъюгаты между водорастворимым хитозаном и гематопорфирином, являющимся фотосенсибилизатором. Присоединение проводили с помощью конденсирующих агентов между аминогруппами хитозана и карбоксигруппами ди-0-метилгематопорфирина (димегина). Полученный ковалентный конъюгат содержал до 25% димегина и обладал свойствами как димегина, так и хитозана и был использован в медико-биологических испытаниях в качестве противоопухолевого препарата.

Также была изучена антивирусная активность конъюгата бактериальной рибонуклеазы с водорастворимым хитозаном. Для получения конъюгата водорастворимый хитозан подвергали исчерпывающему сукцинилированию с последующей активацией карбоксильных групп с помощью N,N^'-дисукцинимидилсульфита. Взаимодействие активированной формы хитозана и рибонуклеазы проводили при соотношении фермент хитозан от 1:2 до 1:4. При медико-биологических испытаниях была показана ингибирующая активность конъюгата в отношении вирусов гриппа А и В, а также арбовируса Синдбис в культурах ткани. Эффективность препарата при внутримышечном и интраназальном введении наблюдалась и при экспериментальной гриппозной инфекции белых мышей.

Формула изобретения

Способ получения низкомолекулярного водорастворимого хитозана путем ферментативного расщепления хитозана, отличающийся тем, что ферментативное расщепление проводят с использованием иммобилизованного на инертном носителе хитиназного комплекса в две стадии: сначала при рН 4,5 5,0, температуре 45 - 50^oС в течение 16 ч и при массовом соотношении хитозан: иммобилизованный на инертном носителе хитиназный комплекс 1 10, а затем при рН 6,0 6,5, температуре 37^oС в течение 8 12 ч и массовом соотношении хитозан иммобилизованный на инертном носителе хитиназный комплекс 1 10.