Способ получения бактериального препарата из бактерий рода bacillus

 

Использование: биотехнология, бактерийный препарат из бактерий рода Bacillus. Сущность изобретения: бактерии культивируют при 35-37^oC в течение 14 суток с непрерывной аэрацией в одной из двух жидких питательных средах следующего состава, мас.%: пептон ферментативный 2,0-3,0, магний сернокислый 0,1-0,15, вода - остальное, либо обрат сухой 2,0-3,0, натрия хлорид 0,4-0,5, вода - остальное, рН сред 7,3±0,2. Засев производят прогретой при 80^oC в течение 20 мин маточной культурой или культуральной жидкостью одной из предыдущих генераций в количестве 1-2% от объема засеваемой среды. Непосредственно получаемую взвесь спор в культуральной жидкости используют в качестве бактерийного препарата, подлежащего хранению без лиофильной сушки. Способ позволяет получать бактерийные препараты в любой бактериологической или ветеринарной лаборатории при минимальных производственных затратах. 1 табл.

Изобретение относится к микробилогии и может быть использовано для производства бактерийных препаратов из бактерий рода Bacillus, применяющихся в ветеринарии и медицине для профилактики и лечения диарей, дисбактериозов, гнойно-воспалительных и аллергических процессов, а также иных целей, везде где применяются бактерии рода Bacillus.

Известен способ получения препаратов из бактерий рода Bacillus путем поверхностного культивирования их на агаризованных (твердых) питательных средах с последующим смывом и лиофильной сушкой выросшей бактериальной массы: А.с. СССР N 1723116 С 12 N 1/20, 30.03.92; А.с. СССР N 1723117 С12 N 1/20, 30.03.92; А. c. CCCP N 1710575 С12 N 1/20, 07.02.92. так, на основе этого способа "Препарат Бациллоспорин" готовят следующим образом.

В бактериологические матрицы разливают по 250 см³ стерильного мясопептонного агара, добавляют по 10 см³ взвеси, содержащей 100 млн. клеток в 1 см³ 0,9%-ного раствора натрия хлорида.

Культивируют при 37^oC. Через 24 ч выросшую культуру смывают 0,9%-ным раствором натрия хлорида из расчета 100 см³ на 1 матрац. Полученную взвесь разливают в 500 см³ стеклянные флаконы и лиофилизируют. В 1 мг полученного препарата содержится около 100 млн. живых клеток штамма "Bacillus sphaericus".

Известна питательная среда для выращивания спорообразующих аэробных бактерий "Bacillus subtilis и Bacillus lichemiformis", А.с. СССР N 1708832 С12 N 1/20, 30.01.92. Поскольку среда предназначена для использования в производстве бактрина-СЛ и других технологических процессах, где применяются спорообразующие аэробные микроорганизмы рода Bacillus, то это изобретение принято за прототип к предлагаемому по достигаемому результату.

Использование питательной среды, принятой за прототип, позволяет добиться повышения выхода биомассы, увеличения антагонистической активности бактерий и их устойчивости к лиофильной сушке. Среда дополнительно содержит хлоропластную фракцию зеленого сока, полученного из листостебельной биомассы люцерны при следующем соотношении компонентов, г/л: Пивное сусло 500,0-600,0 Гидролизат мяса 50.0-60,0 Хлоропластная фракция зеленого сока, полученного из листостебельной биомассы люцерны 50,0-100,0 Агар-агар 25-30,0 Вода Остальное.

Технология получения бактерийных препаратов на этой среде аналогична вышеупомянутым: после приготовления среду разливают в 50 бактериологических матрацев по 0,25 л и стерилизуют текучим паром с избыточным давлением 0,5 атм в течение 30 мин.

Посев питательных сред в матрацах производят одной и той же маточной культурой B. subtilis и отдельно B. licheniformis, содержащей в 1 мл 1 млрд. микробных тел (по оптическому стандарту мутности). В каждый матрац вносят 10 мл одной из указанных бактериальных взвесей, которую равномерно распределяют по всей поверхности питательной среды. Матрацы инкубируют в термостате. Выросшую бактериальную пленку на 2-5-12 день роста собирают с каждого матраца отдельно с помощью шпателя и 0,85%-ного раствора натрия хлорида.

Затем проводится лиофильная сушка. Для этого полученную взвесь бактерий разливают во флаконы, которые замораживают при минус 40^oC в течение 24 ч и лиофилизируют в течение 36 ч до остаточной влажности 3-4% Однако недостатками данного способа прототипа, как и аналогов, являются.

1. Очень большая трудоемкость, обусловленная необходимостью индивидуальной, ручной работы с каждым матрицам в строго стерильных условиях: заливка среды, засев, смыв бактериальной массы.

2. Необходимость приобретения и обслуживания дорогостоящих аппаратов для лиофильной сушки.

3. Сложный состав твердых питательных сред для выращивания биомассы. Задача изобретения разработать способ получения бактерийных препаратов из бактерий рода Bacillus качественно менее трудоемкий, не требующий аппаратов для лиофильной сушки, многокомпонентных питательных сред с дефицитными субстратами.

Технический результат технология получения биопрепаратов из бактерий рода Bacillus, обеспечивающая повышение производительности труда и снижение материальных затрат на производство.

Технический результат достигается тем, что бактерии рода выращиваются в течение 14 суток методом глубинного культивирования (в одном резервуаре на жидкой среде). В качестве питательной основы среды используют 2-3%-ные растворы, либо пептона ферментативного либо сухого обрата. Лиофильная сушка не используется.

Таким образом, отпадает необходимость заливки среды, засева и смыва в стерильных условиях с каждого матраца, поскольку вместе многочисленных матрацев используется один резервуар, что качественно снижает трудоемкость. Использование в качестве бактерийного препарата непосредственно получаемой в результате выращивания культуральной жидкости, представляющей из себя взвесь спор бактерий рода Bacillus, которые хорошо сохраняются без лиофильной сушки, позволяет снизить производственные затраты и трудоемкость за счет экономии на лиофильной сушке. Кроме того, среда для выращивания не содержит дефицитных субстратов, что тоже способствует удешевлению и доступности производства.

Выращивание бактерий на питательных средах является существенным признаком, сходным с прототипом.

Отличительные признаки, заявляемого способа от прототипа, следующие: проведение глубинного культивирования бактерий в жидкой среде; использование естественного свойства бактерий рода Bacillus переходить при длительном культивировании в споры, которые хорошо сохраняются, для непосредственного использования получающейся взвеси спор в "отработанной" среде в качестве бактерийного препарата, подлежащего хранению без лиофильной сушки.

Способ осуществляется следующим образом.

Бактерии рода Bacillus выращиваются методом глубинного культивирования на жидких питательных средах следующего состава, г/л: Пептон ферментативный 20,0-30,0
Магний сернокислый 0,1-0,15
Вода Остальное рН7,3±0,2.

либо
Обрат сухой 20,0-30,0
Натрия хлорид 0,4-0,5
Вода Остальное рН7,3±0,2.

Выбор среды для культивирования не принципиален и зависит от доступности ингредиентов. Среды стерилизуются кипячением либо автоклавированием.

Концентрации питательных основ для сред пептона ферментативного или обрата установлены опытным путем и являются оптимальными. Снижение их уменьшает выход биомассы, а увеличение снижает скорость роста, очевидно, вследствие повышения осмолярности. Значение рН соответствует оптимуму роста для бактерий рода Bacillus, а магний сернокислый является стимулятором роста для них. Однако во второй среде он не применяется, поскольку способствует интенсивному закислению при росте культур на обрате, сворачиванию обрата и выходу за пределы оптимальных значений рН. В результате пептонизация обрата прекращается и рост бактерий тоже.

В присутствии указанной концентрации натрия хлорида бактерии рода Bacillus утрачивают способность сворачивать белки молока (обрата), в результате происходит полная пептонизация белков под влиянием протеолитических ферментов бактерий и интенсивный рост культур.

Такой состав сред для культивирования прост в приготовлении и дешев, выгодно отличается доступностью, не требуя дефицитных субстратов.

Для засева сред используют часть культуральной жидкости, полученной на одной из предыдущих операций, а для получения первой партии препаратов посевной материал выращивают специально. Достаточно 1-2% от объема засеваемой среды.

Посевной материал перед внесением прогревают при температуре 80^oC в течение 20 мин. Это упрощает правила асептики, поскольку такой режим выдерживают только споры и одновременно стимулирует их к последующему прорастанию в питательной среде.

Культивирование проводят при температуре 35-37^oC, что соответствует оптимуму роста для бактерий рода Bacillus, в течение 14 суток. Все это время идет накопление биомассы, дальнейшее культивирование нецелесообразно вследствие полного истощения питательной среды. Во время культивирования проводят постоянную аэрацию среды подачей стерильного воздуха или кислорода на дно резервуара с питательной средой. Интенсивность аэрации увеличивают по мере роста культуры, стараясь добиваться насыщения среды кислородом.

Соблюдение таких режимов культивирования обеспечивает максимально полную утилизацию питательных субстратов в средах, накопление максимальной биомассы, переход бактериальных клеток в споровые формы, что является физиологическим свойством и отличительной чертой бактерий рода Bacillus.

Таким образом, в результате получается культуральная жидкость в виде взвеси спор с концентрацией 1,5 3 млрд. в 1 см³, которые хорошо сохраняются, в истощенной, насыщенной антибиотическими веществами среде. Эта культуральная жидкость непосредственно используется как бактерийный препарат, который может длительно сохраняться непосредственно в жидком виде, не подвергаясь лиофильной сушке. В данном случае используется природное свойство спорообразующих аэробных бактерий род Bacillus, переходить в споры и сохраняться долго.

Сравнение предлагаемого способа и прототипа для приготовления 100 л препарата представлено в таблице.

По сравнении с прототипом предлагаемый способ обеспечивает качественное снижение трудоемкости, производственных затрат; отсутствие необходимости иметь специальные аппараты для лиофильной сушки; доступность субстратов для питательных сред при производстве бактерийных препаратов из бактерий рода Bacillus.

Производство предлагаемым способом может быть быстро налажено в любой бактериологической или ветеринарной лаборатории. Для реализации способа необходимо иметь следующее оборудование:
термостат любого образца или терморегулятор;
бачки пищевые варочные любого образца;
компрессоры любого образца;
фильтры бактериальные любого образца.

При изучении патентно-технической и специальной литературы не выявлено источников, описывающих глубинное культивирование бактерий рода Bacillus с последующим использованием получаемой взвеси спор в культуральной жидкости непосредственно в качестве жидкой формы бактерийного препарата, сохраняющегося без лиофильной сушки для решения поставленной задачи и с обеспечением указанного результата. Следовательно, заявляемое решение соответствует критерию "cущественные отличия".

Пример 1. В варочный бачок наливают 30 л водопроводной воды, растворяют 600 г пептона ферментативного и 30 г магния сернокислого. Получившуюся среду стерилизуют кипячением 45 м при плотно закрытой крышке. После остывания среды с соблюдением правил асептики вносят 500 мл культуры бактерий вида B. subtilis, полученной в результате одного из предыдущих культивирований либо специально выращенной для первого культивирования. Перед внесением посевной материал прогревают на водяной бане при 80^oC в течение 20 мин.

Культивирование проводят с плотно закрытой крышкой в течение 14 суток при температуре 37^oC. Все это время микрокомпрессором через бактериальный фильтр в питательную среду подается стерильный воздух.

На 14-е сутки в 1 см³ культуральной жидкости содержится 1,6 млрд. живых клеток в форме спор бактерий вида B. subtilis, посторонней микрофлоры нет. Препарат разливают в стерильные склянки емкостью по 200 мл закрывают резиновыми пробками, хранят в холодильнике при температуре +6^oC и при комнатной температуре 18-25^oC. По истечении 4 месяцев снижения концентрации живых спор не определяется как при хранении в холодильнике, так и при комнатной температуре.

Пример 2. В варочный бачок наливают 30 л водопроводной воды, растворяют 900 г обрата сухого и 120 г натрия хлорида. Получившуюся среду стерилизуют кипячением 45 мин при плотно закрытой крышке. После остывания среды с соблюдением правил асептики вносят 500 мл культуры бактерий вида B. subyilis, полученной в результате одного из предыдущих культивирований, либо специально выращенной для первого культивирования. Перед внесением посевной материал прогревают на водяной бане при температуре 80^oC в течение 20 мин. Культивирование проводят при плотно закрытой крышке 14 суток при температуре 37^oC. Все это время микрокомпрессором через бактериальный фильтр в питательную среду подается стерильный воздух.

На 14-е сутки в 1 см³ культуральной жидкости содержится 3,О млрд. живых клеток в форме спор бактерий вида B. subtilis, посторонней микрофлоры нет. Препарат разливают в стерильные склянки емкостью по 200 мл, закрывают резиновыми пробками, хранят в холодильнике при температуре 6^oС и при комнатной температуре (18 +25^oC). После 3 месяцев хранения снижения концентрации живых спор не определяется как при хранении в холодильнике, так и при комнатной температуре.

Пример 3. Культивирование бактерий вида B. licgeniformis осуществляют по варианту, описанному в примере 1. Получена взвесь спор бактерий B. lichemiformis, в 1 см³ 1,4 млрд. живых спор. Посторонней микрофлоры препарат не содержит. Концентрация спор не меняется в течение 3 месяцев как при хранении в холодильнике, так и при комнатной температуре (на больший срок препарат не исследовался).

Пример 4. Культивирование бактерий вида B. cereus осуществляют по варианту, описанному в примере 1. Получена взвесь спор бактерий B. cereus, в 1 см³ 1,7 млрд. живых спор. Посторонней микрофлоры препарат не содержит. Концентрация спор не меняется в течение 3 месяцев как при хранении в холодильнике, так и при комнатной температуре.

Формула изобретения

Способ получения бактериального препарата из бактерий рода Bacillus, включающий засев питательной среды с последующим культивированием и отделением целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве питательной среды используют среду, содержащую, мас.

Пептон ферментативный 2,0 3,0
Магний сернокислый 0,1 0,15
Вода Остальное
или
Обрат сухой 2,0 3,0
Натрий хлористый 0,4 0,5
Вода Остальное
засев производят прогретой при 80^oС в течение 20 мин маточной культурой или культуральной жидкостью одной из предыдущих генераций в количестве 1 2 от объема засеваемой среды, культивирование проводят в течение 14 сут. при температуре 35 37^oС и отделяют целевой продукт в виде спор.

РИСУНКИ

Рисунок 1