Питательная среда для культивирования плесневых грибов рода aspergillus и mucor

 

Использование: изобретение относится к биотехнологии, в частности к микологии, и касается оптимизации состава питательных сред для культивирования плесневых грибов рода Aspergillus и Mucor. Сущность изобретения: питательная среда содержит глюкозу в количестве 4,0 - 5,0 мас.%, гидролизат лактальбумина - 0,45 - 0,55 мас.%, сыворотку крови крупного рогатого скота - 9,0 - 11,0 мас. % и солевой раствор Хенкса - остальное. Для приготовления твердой питательной среды вышеуказанный состав дополнительно содержит пептон и агар в количествах, соответственно равных 0,95 - 1,05 и 3,5 - 3,6 мас.%. 1 з.п. ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности микологии, и может быть использовано для оптимизации способов выращивания плесневых грибов рода Aspergillus u Mucor с целью повышения выхода спорового материала при снижении времени культивирования.

Известна питательная среда Чапека для культивирования плесневых грибов рода Aspergillus (см. Н. А. Спесивцева. Микозы и микотоксикозы. М. Колос, 1964, с. 492), содержащая азотнокислый натрий (NaNO₃), однозамещенный фосфорнокислый калий (KH₂PO₄), хлористый калий (KCl), сернокислый магний (MgSO₄), сернокислое железо (FeSO₄), глюкозу и воду.

Однако процент выхода спорового материала аспергилл на этой среде крайне низок. Кроме этого, срок культивирования длителен. Для достижения урожая в 4 млн. спор на 1 мл бульона требуется около 30 сут.

Известна также питательная среда для выращивания плесневых грибов на основе дрожжевого экстракта (см. В. В. Курасова, В.В. Костин, Л.С. Малиновская. Методы исследования в ветеринарной микологии. М.Колос, 1971), содержащая фильтрат водной взвеси из пекарских дрожжей.

Однако выход спор гриба рода Aspergillus также незначителен, а процесс культивирования длителен. Так, для получения урожая в 4 млн. спор/мл требуется 21 день.

Наиболее близкой к заявляемой является питательная среда Сабуро для культивирования плесневых грибов (см. Методы исследования в ветеринарной микологии. Под ред. проф. Н.А. Спесивцевой. М. Колос, 1971), содержащая глюкозу, пептон и воду. Однако данная среда также, как и предыдущие, не дает высокого процента выхода спор, хотя и значительно сокращает процесс культивирования. Так для получения урожая в 100 млн. спор/мл бульона требуется 12 15 сут.

Изобретение направлено на решение задачи повышения процента выхода спорового материала при одновременном сокращении сроков выращивания.

Для решения поставленной задачи питательная среда для культивирования плесневых грибов рода Aspergillus и Mucor, содержащая глюкозу и растворитель, содержит в качестве растворителя солевой раствор Хенкса и дополнительно имеет гидролизат лактальбумина и сыворотку крови крупного рогатого скота при следующем соотношении компонентов, мас.

глюкоза 4,0 5,0 гидролизат лактальбумина 0,45 0,55 сыворотка крови крупного рогатого скота 9 11 солевой раствор Хенкса остальное Для приготовления твердой питательной среды состав дополнительно содержит пептон в количестве 0,95 1,05 мас. и агар в количестве 3,5 3,6 мас.

В известных источниках патентной и научно-технической информации не описано питательных сред для культивирования плесневых грибов рода Aspergillus и Mucor на основе солевого раствора Хенкса, лактальбумина, сыворотки крови и компонентов среды Сабуро, позволяющей повысить процент выхода спорового материала с одновременным сокращением сроков культивирования за счет подбора количественного состава ингредиентов среды.

Известно использование солевого раствора, сыворотки крови и сухого ферментативного гидролизата мышечных белков в качестве питательных сред для выращивания культур клеток животных (см. например, а.с. СССР N 1025722, кл. C 12 N 1/00, опубл. 30.06.83). Однако такие питательные среды непригодны для выращивания плесневых грибов, а предназначены только для культивирования культур клеток.

Вышеописанное позволяет сделать вывод о наличии в заявляемом изобретении "изобретательского уровня".

Глюкоза белые кристаллы или мелкокристаллический порошок без запаха, сладкого вкуса. Хорошо растворяется в воде. Водный раствор глюкозы при слабом нагревании должен быть прозрачным и бесцветным.

Солевой раствор Хенкса с лактальбумином и сывороткой крови прозрачная жидкость, pH 7,2 7,4, розовато-красного цвета вследствие присутствия фенолового красного, добавляемого как индикатора концентрации гидроксильных ионов.

Гидролизат лактальбумина ферментативный гидролизат белка сыворотки молока. Бело-желтый порошок хорошо растворяется в воде. Используется в конечной 0,5% концентрации.

Сыворотка крови крупного рогатого скота без консерванта, нативная - продукт, получаемый при отстаивании цельной крови, лишенной фибрина и форменных элементов. Представляет собой слегка опалесцирующую жидкость желтоватого цвета, с отклонением в сторону бледно-розового цвета в зависимости от степени гемолиза. При длительном стоянии допускается осадок серо-белого цвета, который разбивается при встряхивании в равномерную муть. Используется в конечной 10% концентрации.

Агар питательный сухой, pH 7,2 7,4 желирующее вещество, получаемое из водорослей для создания плотности сред.

Пептон продукт, получаемый в результате неполного ферментативного гидролиза белков пепсином. Своеобразного запаха, желто-кремового цвета. Растворяется в кипящей воде.

Состав солевого раствора следующий, г: Хлористый натрий (NaCl) 0,8 Хлористый калий (KCl) 0,04 Сернокислый магний (MgSO₄·7H₂O) 0,01 Хлористый магний (MgCl·6H₂O) 0,01 Двузамещенный фосфорнокислый натрий (Na₂HPO₄) 0,006
Однозамещенный фосфорнокислый калий (KH₂PO₄) 0,006
Хлористый кальций (CaCl₂) 0,014
Феноловый красный 0,002
Бидистиллированная вода, pH 7 7,2 До 100
Соли обеспечивают буферность питательного субстрата.

Питательные среды готовят следующим образом.

Для приготовления жидкой питательной среды к стерильному солевому раствору Хенкса с гидролизатом лактальбумина и сывороткой крови добавляют раствор глюкозы 40 50% концентрации при комнатной температуре и тщательно перемешивают. Автоклавированию не подвергают.

Для приготовления плотной питательной среды к солевому раствору Хенкса с гидролизатом лактальбумина и сывороткой крови добавляют глюкозу в сухом виде в количестве 1:20 1:25 от объема раствора, перемешивают и доводят смесь до кипения. В кипящий раствор вносят при помешивании пептон в количестве 1:100 от объема раствора и агар в количестве 1:35 1:36. Полученную питательную среду автоклавируют при 1 атм. в течение 30 мин.

Пример приготовления жидкой питательной среды.

К 100 мл стерильного раствора Хенкса с гидролизатом лактальбумина и сывороткой крови добавляют 9 10 мл 40 50% стерильного раствора глюкозы, смесь перемешивают и разливают в стерильные пробирки.

Пример приготовления плотной питательной среды.

К 100 мл раствора Хенкса с гидролизатом лактальбумина и сывороткой крови добавляют 4 5 г порошка глюкозы и подвергают нагреванию. В кипящий раствор вносят 1 г пептона и тщательно перемешивают. Затем добавляют 3,5 г агара, перемешивают до полного расплавления последнего. Полученную смесь подвергают стерилизации автоклавированием. После стерилизации слегка остуженный субстрат разливают по стерильным чашкам Петри.

При микологическом изучении сред, приготовленных согласно предлагаемому способу, проводили сравнительные посевы на указанные субстраты, жидкие и плотные среды Сабуро и Чапека.

В качестве посевного материала использовали штаммы Aspergillus fumigatus и Mucor racemosus. Посевы инкубировали при 20^oC в течение 12 15 сут. Подсчет спор проводили через каждые 3 сут. в камере Горяева по общепринятой методике.

Результаты спорообразования представлены в табл. 1 3.

На среде, приготовленной согласно предлагаемому способу, рост спорообразования аспергилл к 15 сут. культивирования превосходит спорообразование на Сабуро в 2, а на среде Чапека в 270 раз.

На предлагаемой среде количество спор через 9 сут. выращивания в 1,6 раз больше, чем на агаре Сабуро, и в 2,9 раза больше, чем на среде Чапека.

На среде, приготовленной согласно предлагаемому способу, спорообразование грибов рода Мукор к 12 сут. культивирования превосходит спорообразование на агаре Сабуро в 1,3 раза, а на агаре Чапека в 10,5 раза.

Спорообразование на средах с использованием только солевого раствора Хенкса с гидролизатом лактальбумина и сывороткой крови без внесения предлагаемых компонентов было в 4 5 раз ниже, чем на предлагаемых средах.

Формула изобретения

1. Питательная среда для культивирования плесневых грибов рода Aspergillus и Mucor, содержащая растворитель и глюкозу, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит гидролизат лактальбумина и сыворотку крови крупного рогатого скота, а в качестве растворителя солевой раствор Хенкса при следующем соотношении компонентов, мас.

Глюкоза 4 5
Гидролизат лактальбумина 0,45 0,55
Сыворотка крови крупного рогатого скота 9 11
Солевой раствор Хенкса Остальное
2. Питательная среда по п.1, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит пентон и агар в количествах соответственно 0,95 1,05 и 3,5 3,6 мас.

РИСУНКИ

Рисунок 1