Способ введения экзогенной днк плазмид в клетки млекопитающих, культивируемые in vitro

 

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии. Сущность изобретения: создан простой, не требующий дорогого оборудования (микроскопов, микроманипуляторов и т.д.) быстрый способ получения клеток с трансформированным фенотипом, обладающий достаточно высокой эффективностью. Клетки млекопитающих, культивируемые in vitro, придавливают покровным стеклом перпендикулярно поверхности монослоя в PBS-буфере, содержащем экзогенную ДНК в концентрации 10-40 мкг/мл, стекло удаляют, а клетки инкубируют в этом же растворе в течение 40-60 мин при 37^oC. Изобретение применимо в генно-инженерных лабораториях для быстрого анализа и характеристики клонированных генов. Это удобный способ для изучения генетических элементов (промоторов, энхансеров), участвующих в регуляции экспрессии гена, в научных исследованиях, направленных на изучение экспрессии трансгена (в частности тканеспецифичности). Изобретение может быть использовано для получения генетически трансформированных клеток млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных в культуре, продуцирующих биологически активные белки, используемые в народном хозяйстве, медицине, ветеринарии. 2 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к генетической инженерии.

Известен кальций-фосфатный способ генетической трансформации клеток млекопитающих. Принцип способа заключается в соосаждении ДНК с фосфатом кальция и обработки клеток образующимся преципитатом. Способ позволяет значительно повысить устойчивость ДНК в составе преципитата к действию внутриклеточных и внеклеточных дезоксирибонуклеаз. При этом кальций-фосфатный преципитат ДНК образуется в широком диапазоне концентраций ДНК и значений pH раствора (Глебов О.К. Абрамян Д.С. Томилин Н.В. Генетическая трансформация соматических клеток. 1. Клон клеток китайского хомячка дефектных по тимидинкиназе, отличающийся высокой эффективностью трансформации. -Цитология, 1985, т.27, N 4, с.467-476). Стандартный кальций-фосфатный метод трансфекции обеспечивает частоту стабильной трансформации в пределах 10^-5. Этот метод мало эффективен. Кроме того, эффективность этого способа зависит от образования ДНК-преципитата, который очень чувствителен к значению pH растворов.

При улучшении обычной кальций-фосфатной процедуры путем добавления в среду сразу после глициринового шока бутирата натрия число клеток, экспрессирующих вводимый ген, увеличивается в среднем в четыре раза (Томилин Н.В. Новые системы генетической трансформации соматических клеток млекопитающих. Биотехнология, 1987, т. 3, N 3, с. 343-354).

При замене стандартного буфера HEPES на BBS и сдвига pH с 7,15 на 6,95 эффективность стабильной трансформации ДНК кальций-фосфатного метода повышается до 50% (Chen C. Okayma H. High-effiency transformation of mammalian cells by plasmid DNA. Mol. and Cell Biology. 1987, v. 8, N 8, p. 2745-2752).

Известны способы введения изолированной ДНК в клетки млекопитающих ДЕАД-декстран (Holter Wolfgang, Fordis C.Michael et.al.Efficient gene transfer by sequentiel treatment of mammalian cells with DEAE-dextran. Exp.cell.Res. 1989, v. 184, N 2, p. 546-551), а также с помощью фосфат-стронция (Brash D. E. Redel R. R. Strontium phosphate transfection of human cell in primary culture: stable expression of the simian virus 4C large-T-antigen gene in primary human bronchial epithelial cell.-Mol.Cell.Biol. 1987, v. 7, N 5, p. 2031-2034) и слияния мембран (Felgner P.L. Ringold G.M. Cationic liposome-mediated transfection. Nature, 1989, v. 337, N 6205, p. 387-388.). Эти способы используются в практике, но недостаточно эффективны.

Известны способы микроинъекции (Cappecchi M.R. High efficiency transformation by direct microinjection of DNA into cultured mammalian cells.-Cell, 1980, v. 22, N 2, p. 479-488) и микроукалывания клеток (Такада Синдзи, Обината Масуа. Введение генов с помощью микроинъекций и уколов клетки. Био индастри. Bio Industry, 1986, v. 3, N 10, p. 821-826). Эти способы эффективны, но очень трудоемки и требуют наличия дорогого оборудования.

Способы с использованием физических агентов: импульсов электрического тока (Latsuca Masaaki, Orita Satoshi. An improved method of electroporation for introducing biologically active foreign genes into cultured mammalian cells. Exp.Cell.Res. 1988, v. 178, N 1, p. 154-162), лазерного облучения и ультразвука (Fechheimer M. Boylan J.F. Parker S. et al. Transfections of mammalian cells with plasmid DNA by scrape loading and sonification loading. - Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1987, v. 84, p. 8463-8471) не во всех лабораториях могут быть использованы.

Способ введения ДНК путем инфицирования клеток рекомбинантными вирусами и вирусными частицами, собранными in vitro (Edlitis M.A. Kantoff P.W. Retroviral-mediated gene transfer into hemopoiietic cells. Mol. Biol. Hemopoiesis. Proc. 3rd Annu Symp. Rye. Brook, N.Y. Nov. 6-7, 1987, New York: London, 1988, p. 19-27) обеспечивает высокий уровень (до 100%) заражения клеток. Его существенным недостатком является возможность активизации клеточного онкогена при интеграции ретровируса, что может привести к злокачественной трансформации.

Наиболее близким по технической сущности и достигаемому результату является способ, взятый в качестве прототипа, сущность которого заключается в том, что ДНК механически вводят в ядра культивируемых клеток путем прокалывания клеток. Непосредственно перед трансфекцией на клетки наслаивают буфер PBS, содержащий экзогенную ДНК в концентрации 5-1000 мкг/мл. Все клетки прокалывают по возможности один раз в области ядра стеклянной микроиглой, пока кончик иглы не коснется подложки. Сразу после прокалывания среду (ДНК в буфере PBS) меняют на нормальную ростовую среду (Спандидос Д. Уюки Н. Эксспрессия экзогенной ДНК в клетках млекопитающих. В кн. Транскрибция и трансляция. Методы. М. Мир, 1987, с. 48).

Этот способ обеспечивает сравнительно высокую эффективность введения ДНК в клетки млекопитающих. Однако он требует наличия дорогой и часто недоступной микроманипуляционной техники, очень трудоемок и требует хороших навыков исследователя в области "прокалывания". Даже опытный специалист может проколоть за 1 ч не более 100 клеток.

Цель изобретения создание простого, не требующего дорогого специального оборудования (микроскопов, микроманипуляторов и т.д.), быстрого способа получения клеток с трансформированным фенотипом, обладающего достаточно высокой эффективностью.

Поставленная цель достигается тем, что предложен способ, согласно которому клетки млекопитающих, культивируемые in vitro, придавливают покровным стеклом перпендикулярно поверхности монослоя в PBS-буфере, содержащем экзогенную ДНК в концентрации 10-40 мкг/мл, стекло убирают, а клетки инкубируют (в буфере с донорной ДНК) в течение 40-60 мин при 37^oC.

Пример. Для введения трансгена, т.е. экзогенной ДНК плазмид, в клетки, культивируемые in vitro, использовали ДНК плазмид: pCMV-lacZ, содержащую ген lacZ; pSV-neo; ДНК спермы лосося (Sigma). В опыте использовали клетки почки эмбриона свиньи (СПЭВ); клетки трахеи эмбриона коров (FBT) и клетки эмбриональных фибробластов мыши (ЗТЗ Bald/C).

За день перед трансфекцией клетки рассеивают в чашки Петри с d=3,5 см в концентрации 10⁵ см² и инкубируют при 37^oC в течение ночи. Непосредственно перед трансфекцией клетки промывают 2-3 раза буфером PBS pH 7,2. Переосаждают двухкратно в 70^o этаноле при 5 тыс. оборотов в течение 15 мин донорную ДНК и растворяют в буфере (0,1 мМ ЭДТА, 1 мМ трис-HCl, pH 8,0) а затем добавляют к клеткам, находящимся в PBS, до конечной концентрации ДНК 10-40 мкг/мл. Клетки в растворе с донорной ДНК накрывают стерильным покровным стеклом и придавливают перпендикулярно поверхности монослоя равномерными, круговыми движениями. Затем покровное стекло удаляют, а клетки инкубируют при 37^oC с 5%-ным CO₂ в этом же растворе в течение 40-60 мин. После клетки тщательно промывают буфером PBS 3 раза и среду меняют на нормальную ростовую среду.

Температура 37^oC и наличие CO₂ является одним из основных общепринятых условий, необходимых для культивирования клеток in vitro.

Временная экспрессия гена lacZ, связанная с выявлением β-gal активности в трансформированных клетках, была обнаружена на второй день после проведения трансфекции.

Установлено, что оптимальное время инкубирования культивируемых клеток в растворе экзогенной ДНК, при котором наблюдается экспрессия трансгена, составило от 40 до 60 мин (табл. 1). Ниже этого значения экспрессия трансгена не наблюдалась, при более длительной инкубации клеток в растворе с ДНК наблюдалась гибель клеток.

Результаты опытов показали также, что оптимальный уровень концентрации экзогенной (донорной) ДНК в буфере PBS составил 10-40 мкг/мл (табл. 2). При величине этого показателя ниже и выше отмеченного уровня экспрессия трансгена не была установлена.

Частота трансформации, т. е. число трансформантов на использованное в опыте количество клеток, составила 2,7 · 10^-4-5,2 · 10^-4 клеток. Эффективность трансформации, выраженная числом трансформантов в расчете на 1 мкг/мл плазмидной ДНК, составляла 1,3 · 10^-4-2,8 · 10^-4.

Изобретение применимо в генно-инженерных лабораториях для быстрого анализа и характеристики клонированных генов. Это удобный способ для изучения генетических элементов (промоторов, энхансеров), участвующих в регуляции экспрессии гена, в научных исследованиях, направленных на изучение экспрессии трансгена (в частности тканеспецифичности). Изобретение может быть использовано для получения генетически трансформированных клеток млекопитающих, в том числе сельскохозяйственных животных в культуре, продуцирующих биологически активные белки, используемые в народном хозяйстве, медицине, ветеринарии.

Формула изобретения

Способ введения экзогенной ДНК плазмид в клетки млекопитающих, культивируемые in vitro, включающий механическую обработку клеток, содержащихся в PBS буфере, с ДНК, отличающийся тем, что механическую обработку клеток осуществляют придавливанием клеток покровным стеклом перпендикулярно поверхности монослоя в буфере, содержащем экзогенную ДНК в концентрации 10 - 40 мкг/мл, затем стекло удаляют, а клетки инкубируют в том же растворе в течение 40 60 мин при 370^oC.

РИСУНКИ

Рисунок 1