Штамм бактерий bacillus subtilis - продуцент вещества, обладающего противогрибковой активностью

 

Использование: сельскохозяйственная биотехнология и касается получения средств защиты культурных растений от поражений возбудителями грибковых заболеваний и касается нового штамма бактерий для получения вышеуказанного средства. Сущность изобретения: селекционным путем получен штамм Bacillus subtilis В-40, обладающий искомыми свойствами. Штамм депонирован в Коллекции промышленных микроорганизмов в Hаучно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-6554. Штамм проявляет антагонические свойства в отношении грибов вида Beaweria bassiana, Gliocladium vide, Verticillium nigrescens, Verficillium dahiae, Fusarium graminearum, Selerotinia scleotiorum, Phytophtora infestaus. 1 табл.

Изобретение относится к сельскохозяйственной биотехнологии и касается методов защиты культурных растений от поражений возбудителями грибковых заболеваний.

Потери урожая от повреждений сельскохозяйственных растений вредителями и возбудителями заболеваний ощутимы и постоянно проводятся работы, направленные на расширение арсенала средств защиты растений и их совершенствование.

С учетом остро стоящих экологических проблем, наиболее перспективный путь защиты растений изыскание эффективных биологических средств защиты растений, в том числе, от инфекционных болезней.

Известен метод защиты растений от болезней, сводящийся к получению отдельных сортов культурных растений, устойчивых к определенным заболеваниям [1] Практическая реализация этого метода связана с длительными исследовательскими работами и, кроме того, придать устойчивость к конкретным заболеваниям можно только некоторым, наиболее ценным сортам.

Известна возможность повысить устойчивость растений к возбудителям заболеваний в результате предварительной обработки растений несовместимыми расами фитопатогенов или их ослабленными культурами [2] Использование этого метода, однако, не может полностью исключить возможности возникновения эпифитотий.

Описан способ защиты растений от инфекционных болезней, состоящий в том, что растения обрабатывают липогликопротеидным комплексом, выделенным из мицелия возбудителя фитофтороза и придающим, в частности, картофелю резистентность к этому заболеванию [3] Относительный недостаток этого способа состоит в необходимости предварительного накопления значительных объемов биомассы фитопатогенного гриба, из которой следует выделять защитный препарат.

Общеизвестно, что многие бактерии образуют комплексы биологически активных веществ, обладающих антибиотической активностью, что делает отдельные штаммы таких бактерий и синтезируемые ими продукты потенциальными средствами защиты растений от фитопатогенов.

Ряд бактерий способен синтезировать биологически активные вещества, проявляющие антигрибковую активность, в том числе, в отношении фитопатогенных грибов, вызывающих такие заболевания растений, как корневая гниль, фитофтороз и подобные.

Известен, например, штамм бактерий Bacillus subtilisESC} ИПМ- 215, являющийся ближайшим аналогом (прототипом) предлагаемого штамма, который образует комплекс биологически активных веществ, потенциально применимый для борьбы с возбудителями грибковых заболеваний растений [4] Однако, этот штамм образует комплекс биологически активных продуктов, не обладающих достаточной для практического использования противогрибковой активностью как по спектру биологической активности, так и по выраженности этого свойства.

Цель изобретения изыскать бактериальный штамм, биосинтезирующий метаболиты, обладающие выраженной противогрибковой активностью по отношению к фитопатогенам растений, который мог бы найти практическое применение в сельскохозяйственной практике.

В результате длительной поисковой и селекционной работы заявителем был выделен и идентифицирован штамм Bacillus subtilis B 40, обладающий искомыми свойствами.

Этот штамм был выделен из почвы Средней Полосы России после проведения многоступенчатого естественного отбора на агаризованной среде.

Заявляемый штамм обладает следующими характеристиками.

Морфолого-культуральные признаки. Мясопептонный агар. Колонии имеют диаметр 4 6 мм. Светло-серые, матовые, с волнистым краем, плоские, возвышающиеся к центру. По консистенции колонии по краю сухие, в центре - вязкие, тянущиеся при снятии с поверхности среды.

Картофельный агар. Колоннии достигают в диаметре 5 8 мм. Кремово-бежеватые, со складчатой поверхностью и волнистым краем. Плоские, слегка возвышающиеся над поверхностью.

В препарате живой капли под микроскопом представляют собою подвижные палочки овальной формы размером 0,5 0,8 х 1,0 2,0 мкм. Окраска по Граму отрицательная. Располагаются по одной или парами. Споры имеют субтерминальное расположение.

Физиолого-биохимические признаки.

Слабо усваивает глюкозу, мальтозу, сахарозу.

Не усваивает сорбит, лактозу, маннит, арабинозу, рамнозу, салицин.

Активен по отношению к эскулину.

Молоко коагулирует и пептонизирует без образования пигмента, дает зоны просветления на молочном агаре.

Желатин разжижает.

Не образует лецитиназу на яично-желтковых средах.

Не образует уреазу на среде с мочевиной.

На ломтиках картофеля дает обильный рост без образования пигмента.

На мясопептонном бульоне на третьи сутки образует пленку без образования пигмента.

Культура хранится на скошеном мясопептонном или картофельном агаре в пробирках при температуре от -2 до -4 градусов в течение 2 3 месяцев без пересевов или в лиофилизированном виде в ампулах в течение 1 2 лет.

Антагонические свойства.

Подавляет рост грибов. Beaweria bassiana возбудителя белой мускардины. Gliocladium vide возбудителя виноградной гнили. Sclerotinia sclerotiorum - возбудителя белой гнили. Verticillium dahliae возбудителя вилта хлопчатника. Phytophtora infestans возбудителя картофельной гнили.

Сильно подавляет рост гриба. Fusarium graminearum возбудителя корневой гнили злаков.

Штамм выделяет в среду комплекс неидентифицированных биологически активных веществ, обладающих противогрибковой активностью.

Штамм депонирован в Коллекции промышленных микроорганизмов Hаучно-исследовательского института генетики и селекции промышленных микроорганизмов под регистрационным номером В-6554.

Преимущества предложенного штамма Bacillus subtilis В-40 перед наиболее близким его аналогом вытекают из приводимых в следующей таблице данных сравнительных испытаний этих штаммов.

Кроме того, предложенный штамм, в отличие от известного, синтезирует рестриктазу Bam HI, которая используется в генной инженерии.

Более подробно сущность предложения поясняется нижеследующими примерами.

Пример 1. Посевным материалом Bacillus subtilis В-40, полученным смывом культуры с косяка, засеяли жидкую питательную среду, содержащую (мас.) кормовые дрожжи (2,5) и кукурузную муку (1,5). Значение pH среды составляло 7,1.

Выращивание проводили в колбах на 250 мл, заполненных 40 мл среды, на качалке при скорости ее вращения 350 об/мин при температуре 37 градусов.

В процессе роста отмечались следующие стадии развития культуры: прорастание спор 0,6 1,0 ч вегетативный рост 1,0 10,0 ч спорообразование 10,0 16,0 ч созревание спор 16,0 24,0 ч Полученная на 12 ч роста культуральная жидкость на 95% подавляла развитие тест культуры Phytophtora infectans шт. 216 и шт. 97
Пример 2. Ферментер, объемом 5,0 л был засеян посевным материалом Ваcillus subtilis В-40, полученным путем смыва 0,85% р-ром хлорида натрия культуры с агаризованной средой ("МПА" КА).

Ферментационная среда содержала (мас.) кормовые дрожжи 2,5% кукурузную муку 1,5 и воду.

Выращивание проводили при температуре 37 + 1 градус и интенсивности аэрации 0,5 1,0 л воздуха/объем среды.

Длительность ферментации составила 16 ч.

Фильтрат культуральной жидкости на 90% подавлял развитие тесткультуры Phytophtora infestans.

Предложенный штамм, исходя из его изученных свойств, может найти практическое применение в двух качествах:
как продуцент комплекса биологически активных веществ или индивидуальных компонентов этого комплекса, обладающих противогрибковой активностью в отношении ряда фитопатогенов;
как активный компонент биологических средств защиты растений, будучи включенным в состав этих средств для непосредственной обработки растений.

Представленные результаты свидетельствуют о достаточно высоком уровне накопления предложенным штаммом субстанций с противогрибковой активностью и о возможности его успешного выращивания в производственных условиях.

Формула изобретения

Штамм бактерий Bacillus subtilis ВКПМ В-6554 продуцент вещества, обладающего противогрибковой активностью.

РИСУНКИ

Рисунок 1