Консорциум бактерий pseudomonas sp., pseudomonas fluorescens, pseudomonas putida, thiobacillus sp., используемый для очистки сточных вод от алкилсульфонатов

 

Использование: биотехнология, очистка сточных вод. Сущность изобретения: очистка сточных вод от алкилсульфонатов с помощью консорциума бактерий Pseudomonas sp. , Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Thiobacillus sp. Использование данного консорциума позволяет проводить очистку сточных вод с концентрацией солей до 45 г/л и температурой до 41^oC. 1 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, в частности к очистке сточных вод от алкилосульфонатов с помощью консорциума бактерий.

Известен штамм Pseudomonas rahtonis T, используемый для очистки промышленных сточных вод от алкилосульфонатов (волгоната). Процесс деструкции алкилсульфонатов осуществляют в проточном режиме со скоростью протока 0,013 ч^-1 [1] . С помощью данного штамма осуществляют деструкцию алкилсульфонатов в сточных водах с общим солесодержанием до 2,6 г/л при 28-30^oC.

Недостатком штамма Pseudomonas rahtonis T является его непригодность при очистке сточных вод с повышенной концентрацией солей и температурой.

С помощью предлагаемого консорциума решается задача деструкции алкилсульфонатов при повышенной солености и температуре сточных вод.

Технический результат, получаемый при использовании предлагаемого консорциума по сравнению с прототипом [1], заключается в следующем: очистку сточных вод проводят при концентрации солей до 45 г/л и температуре до 41^oC; очистку проводят на локальных установках без предварительного разбавления и охлаждения сточных вод; использование для очистки сточных вод от алкилсульфонатов консорциума обеспечивает более высокую стабильность процесса.

Последний результат объясняется тем, что в очистных сооружениях реально работают ассоциации микроорганизмов. В случае применения монокультуры штамма-деструктора, как предполагается по прототипу, неизбежно приходится решать вопрос о его поддержании в составе спонтанно сформированной ассоциации в очистных сооружениях. Селективно получаемый консорциум в этом смысле более устойчив.

Экономический эффект от применения данного консорциума обусловлен расширением возможностей микробной очистки сточных вод от алкилсульфонатов. При повышенной солености и температуре сточных вод существует дилемма: либо проводить очистку с помощью дорогостоящих физико-химических способов, либо перед применением известного штамма [1] предварительно разбавлять и охлаждать сточные воды, что также приводит к увеличению затрат на очистку. Использование данного консорциума позволяет применять в подобных условиях менее дорогостоящую микробную очистку без дополнительных затрат на разбавление и охлаждение сточных вод.

Бактерии Pseudomonas sp., Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Thiobacillus sp., входящие в состав консорциума, идентифицированы по определению бактерий Берджи [2] и методическому руководству [3 и 4]. Функции идентифицированных бактерий при деградации алкилсульфонатов и процентное содержание их клеток в консорциуме приведены в таблице.

Бактерии, входящие в консорциум, обладают следующими свойствами. Pseudomonas sp.

Культурно-морфологические свойства.

Клетки представляют собой подвижные грамотрицательные палочки 0,7-0,8х1,2-2,3 мкм. В мазке клетки одиночные.

Рыбно-пептонный агар (30^oC, 48 ч) Образует колонии бежевого цвета, диаметром до 10 мм, выпуклые, гладкие, матовые, профиль колоний конусовидный, края ровные.

Пигмента не образует.

Физико-биологические свойства.

Облигатный аэроб.

Растет при 20-41^oC.

Не нуждается в ростовых факторах.

Продуцирует поли-β-оксимасляную кислоту.

Использует аргинин в качестве источника углерода.

Обладает аргининдигидролазной активностью.

Денитрификацию не осуществляет.

Желатину не гидролизует.

Способностью к автотрофному росту в присутствии водорода не обладает.

Растет на цитратном агаре.

Растет на среде с парафинами.

Лизиндекарбоксилазную активность не проявляет.

Использует в качестве источников углерода фруктозу, сорбозу, ксилозу, галактозу, сахарозу, рамнозу, маннозу.

Непатогенен.

Бактерии по своим свойствам близки к виду Pseudomonas pseudoalcaligenes, однако в отличие от Pseudomonas pseudoalcaligenes способны использовать кроме фруктозы другие сахара. Поэтому данные бактерии были идентифицированы нами как Pseudomonas sp.

Pseudomonas fluorescens.

Культурно-морфологические свойства.

Клетки представляют собой подвижные грамотрицательные палочки 0,7-0,8х2,0-2,5 мкм. В мазке клетки одиночные.

Рыбно-пептонный агар (30^oC, 48 ч) Образует колонии бежевого цвета, диаметром 5-7 мм, гладкие, матовые, профиль колоний конусовидный, края ровные, консистенция маслянистая.

Образует пигмент.

Физико-биологические свойства.

Факультативный аэроб.

Растет при 20-41^oC.

Не нуждается в ростовых факторах.

Продуцирует поли-β-оксимасляную кислоту.

Обладает оксидазой.

Обладает аргининдигидролазой.

Денитрификацию осуществляет.

Желатину гидролизует.

Растет на среде с парафинами.

Использует в качестве источников углерода фруктозу, сорбозу, ксилозу, галактозу, глюкозу, сахарозу, рамнозу, маннозу.

Непатогенен.

Pseudomonas putida.

Культурно-морфологические свойства.

Клетки представляют собой подвижные грамотрицательные палочки 0,7-0,8х2,0-2,5 мкм. В мазке клетки одиночные.

Рыбно-пептонный агар (30^oC, 48 ч) Образует колонии розоватого цвета, диаметром 5-7 мм, гладкие, матовые, профиль колоний конусовидный, края ровные, консистенция маслянистая.

Образует пигмент.

Физико-биологические свойства.

Облигатный аэроб.

Растет при 4-40^oC.

Не нуждается в ростовых факторах.

Не продуцирует поли-β-оксимасляную кислоту.

Обладает оксидазой.

Обладает аргининдигидролазой.

Денитрификацию не осуществляет.

Желатину не гидролизует.

Использует в качестве источников углерода фруктозу, сорбозу, ксилозу, галактозу, глюкозу, сахарозу, рамнозу, маннозу.

Непатогенен.

Наличие в консорциуме бактерий, относящихся к роду Thiobacillus подтверждается способностью консорциума окислять тиосульфат и ростом колоний на среде Бейеринка с тиосульфатом после посева консорциума на эту среду.

Thiobacillus sp.

Культурно-морфологические свойства.

Клетки представляют собой подвижные грамотрицательные палочки 0,4-0,5х1,7-2,5 мкм. В мазке клетки одиночные.

Рыбно-пептонный агар (30^oC, 48 ч) Образует колонии кремового цвета, диаметром 3-4 мм, гладкие, прозрачные, профиль колоний конусовидный, края неровные, консистенция маслянистая.

Окисляет тиосульфат.

При поддержании в чистых культурах на рыбно-пептонном агаре и среде Бейеринка тионовые бактерии теряют способность к росту и окислению тиосульфата. Поэтому определить тионовые бактерии до вида не представляется возможным и они идентифицированы как Thiobacillus sp.

Очистку сточных вод с помощью консорциума осуществляют следующим образом.

Биореактор наполняют сточной водой, вносят инокулят и наращивают биомассу микробного консорциума в периодическом режиме, пока не будет деградировано 95% алкилсульфонатов. Затем подачу сточной воды в реактор осуществляют непрерывно. Одновременно в реактор подают раствор биогенных компонентов, необходимых для эффективной работы. Скорость протока достигает 0,4 ч^-1. Аэрация обеспечивает концентрацию кислорода в сточной воде на уровне не менее 10% от насыщения. Температуру сточной воды поддерживают в пределах 20-41^oC, pH 6,4-8,5. Степень очистки воды от алкилсульфонатов составляет 95-99%.

Консорциум бактерий, осуществляющий деструкцию алкилсульфонатов в соленой воде получен путем автоселекции в длительном непрерывном процессе из спонтанной микрофлоры, взятой из вод Японского и Каспийского морей, пластовых вод нефтяного месторождения г. Баку, а также из соленых озер Красноярского края. Первоначально культивирование спонтанной микрофлоры из воды Японского моря осуществляли в лабораторном аппарате при скоростях протока 0,05-0,1 ч^-1, температуре 29-31^oC на среде следующего состава (в г/л водопроводной воды): NH₄HCO₃ - 1,0; NaCl - 30; MgSO₄·7H₂O -0,25; KH₂PO₄ - 1,0; алкилсульфонаты - 0,5; pH воды - 6,4-6,8. Затем в аппарат с интервалом в 3 мес последовательно вносили спонтанную микрофлору из других указанных выше природных источников. Культивирование проводили в микроаэрофильных условиях. Контролировали концентрацию алкилсульфонатов на выходе из аппарата.

По истечении одного года начали ступенчато повышать концентрацию алкилсульфонатов на входе аппарата до 1500 мг/л, солесодержание до 45 г/л и температуру среды до 41^oC. Культивирование перевели в аэробные условия и продолжали в течение года, что явилось достаточным для получения консорциума бактерий, обеспечивающего устойчивую очистку воды от алкилсульфонатов.

Выделяемые из консорциума в чистую воду бактерии при их поддержании на питательных средах быстро теряют деструктивную активность и жизнеспособность. Для гарантированного сохранения образец проточной культуры консорциума отбирают в пробирку и проводят лиофилизацию. Лиофилизированные образцы хранятся в запаянных ампулах при 0^oC. Активность консорциума в ампулах сохраняется в течение года. Для поддержания консорциума после годичного срока хранения лиофилизированным материалом инокулируют жидкую среду. Культивирование ведут в периодическом режиме. При обнаружении снижения активности и других культурных свойств (скорость деградации алкилсульфонатов, степень пенообразования и т. д. ) консорциум переводится в проточный режим на 1-2 мес. При непрерывном культивировании консорциума в реакторе контролируют его дыхательную активность, остаточную концентрацию субстрата и численность микроорганизмов. Питательная среда для поддержания консорциума готовится на сточной воде производства синтетического каучука с добавками мочевины, фосфорнокислого калия 1 замещенного и сернокислого магния. Активность консорциума определяют путем измерения остаточной (фоновой) концентрации алкилсульфонатов. Видовой состав и численность микроорганизмов определяют путем высева на РПА, среду Бейеринка и синтетическую среду с алкилсульфонатами.

Стабильность консорциума и его устойчивость к заражению посторонними микроорганизмами проверена в условиях непрерывного культивирования в течение четырех лет. За этот период не отмечено изменений видового состава, снижения активности консорциума и заражения изменений видового состава, снижения активности консорциума и заражения посторонними микроорганизмами. Содержание клеток отдельных видов в консорциуме не выходило за пределы, указанные в таблице. Скорость разложения алкилсульфонатов составляла 0,07-0,15 г алкилсульфонатов на 1 г сухой массы консорциума в час. Консорциум бактерий отличается от прототипа следующими признаками: в прототипе все стадии деградации алкилсульфонатов осуществляются одним штаммом {Pseudomonas rathonis T}; в консорциуме между видами бактерий существует разделение функций при деградации алкилосульфонатов и утилизации продуктов расщепления; консорциум бактерий по сравнению с Pseudomonas rathonis T обладает устойчивостью к повышенным солености и температуре сточных вод.

Пример 1. Деструкцию алкилсульфонатов проводили на лабораторном ферментере с рабочим объемом 0,75 л, представляющем собой стеклянный сосуд, оборудованный барботером и системой термостатирования. В ферментер наливали 0,75 л концентрированных сточные воды (серума) Красноярского завода синтетического каучука, вносили в серум консорциум бактерий и проводили культивирование в периодическом режиме в течение недели. Затем с помощью перистальтического насоса НП-1М в ферментер стали подавать серум следующего состава, г/л: алкилсульфонаты 0,8-1,2; NaCl 30-35. Кроме того, на входе ферментера в серум добавляли мочевину и KH₂PO₄ в таких количествах, чтобы их концентрация в серуме составляла соответственно 0,2 г/л и 0,05 г/л. Количество подаваемых сточных вод 1,1 л/сут, аэрация 0,2-0,3 л воздуха/мин, температура воды в ферментере 35^oC. После включения протока ферментер работал 5 месяцев. Концентрация алкилсульфонатов в очищенной жидкости составляла 7-11 мг/л.

Пример 2. Деэмульгацию серума Красноярского завода синтетического каучука проводили на пилотной установке (фиг. 1), в состав которой входят: емкость 1 объемом 6 м³, использованная как аэротенк, оборудованная мешалкой 2 со скоростью вращения 60-100 об/мин, барботером 3, датчиками pH и температуры 4, имеющая коммуникации подачи серума 5 и слива среды по уровню 6; емкость 7 объемом 1 м³ для растворов биогенных добавок; перистальтический насос 8 для подачи добавок в аэротенк; центробежный насос 9 для подачи серума из отстойника 10; стойка с самописцами 11, регистрирующими pH и температуру среды в аэротенке.

Запуск установки проводили следующим образом.

В емкость 1 заливали около 2 м³ серума. Затем добавляли 100 л консорциума, предварительно выращенного в лабораторных условиях, 0,6 кг мочевины и 0,12 кг калия фосфорнокислого однозамещенного, включали мешалку и подачу воздуха.

Через 5 суток в емкость добавили еще 4 м³ серума и процесс ферментации был продолжен в периодическом режиме еще 7 сут. По окончании этого периода был включен центробежный насос, подающий серум из отстойника 10 в емкость 1.

Режим деэмульгации серума на протоке.

Скорость подачи серума 0,3-0,4 м³/ч.

Скорость подачи раствора биогенных добавок 0,03 м³/ч.

Состав добавок: мочевина (1 кг/м³), калий фосфорнокислый однозамещенный (0,2 кг/м³).

Температура серума в емкости 1 25-35^oC, величина pH 7-8 ед, концентрация растворенного кислорода в серуме - 5,8 мг/л, концентрация солей 13-15 г/л, в том числе концентрация поваренной соли 12 г/л.

Расход воздуха 10-50 м³/м³ в час.

Концентрация алкилсульфонатов в серуме на входе аэротенка 800-1100 мг/л.

После включения протока концентрация алкилсульфонатов в результате деэмульгации серума не превышала уровень (20 мг/л) установленный для сброса сточных вод завода на городские очистные сооружения 5. Степень очистки сточных вод составила не менее 98%.

Литература.

1. Авторское свидетельство СССР N 962304, кл. С 12 N 15/00, С 02 F 3/34, 1982, (прототип).

2. Bergey's manual of determinative bacteriology, 1974 eighth edition, 1268 p.

3. The Prokaryotes. A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, 1981, volume 1, 1102 p.

4. The Prokaryotes. A Handbook on Habitats, Isolation and Identification of Bacteria, 1981, volume 2, p. 1103-2284.

5. Грушко Я. М. Вредные органические соединения в промышленных сточных водах.- Л.: Химия, 1982, с. 142.

Формула изобретения

Консорциум бактерий Pseudomonas sp. Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas putida, Thiobacillus sp. используемый для очистки сточных вод от алкилсульфонатов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2