Способ получения экзополисахаридов

 

Способ относится к биотехнологии и используется для получения капсулярных полимеров углеводной природы. Целью изобретения является оптимизация и повышение эффективности процесса получения экзополисахаридов, для чего в качестве сырья используются естественные ассоциации бактерий, поселяющиеся на поверхности стеклянных пластин, погруженных в морскую воду. Сырье подвергают воздействию "активным хлором" в концентрациях 0,5 - 1,5 мг/л в течение 4 ± 0,2 ч. 4 ил., 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для получения капсулярных полимеров углеводной природы, широко применяемых в медицине, пищевой, косметической, текстильной промышленности, в металлургии, а также при бурении скважин.

Поиск штаммов, продуцирующих эти соединения, а также способов и средств, интенсифицирующих их синтез, представляет несомненный интерес для народного хозяйства.

Известно получение полисахаридов из штаммов бактерий (Авт. св. СССР N 1366528, кл. C 12 P 19/04, 1988). Недостатком известных способов является, во-первых, отсутствие средства интенсификации процесса образования полисахаридов; во-вторых, технологическая сложность - необходимость специального микробиологического оборудования.

Известно (Сенцова О.Ю., Максимов В.Н. Действие тяжелых металлов на микроорганизмы. //Успехи микробиологии. 1985. Вып. 20. с. 227-251.), что в ответ на неблагоприятные воздействия, в частности на присутствие ионов тяжелых металлов, бактерии активизируют синтез экзополисахаридов, связывающих металлы с образованием малотоксичных комплексов (прототип).

Недостатком этого способа является ограниченность применения полученных полисахаридов из-за присутствия в них тяжелых металлов в виде металлорганических комплексов.

Целью изобретения является оптимизация и повышение эффективности процесса получения экзополисахаридов.

Поставленная цель достигается тем, что в способе, включающем предварительную обработку биологического сырья этанолом и водой с последующей экстракцией 2%-ной серной кислотой и 2%-ной щелочью в сочетании с термообработкой и выделением целевого продукта, в качестве исходного сырья используют естественные ассоциации бактерий, поселяющиеся на поверхности стеклянных пластин, погруженных в морскую среду, причем перед предварительной обработкой на сырье воздействуют "активным хлором" (АХл) и в концентрациях 0,5-1,5 мг/л в течение 4±0,2 ч.

В изобретении в качестве агента отрицательного воздействия, инициирующего синтез защитных фракций бактериальных полисахаридов, предлагается комплекс соединений "активного хлора", образующийся в процессе электролизного хлорирования морской воды. В это понятие входит группа соединений, в частности растворенный молекулярный хлор, двуокись хлора, хлорамины и т.д. При характерных для морской воды величинах pH 8,0±0,5 основными составляющими "активного хлора" являются гипохлорит-ион, хлорноватистая кислота. Продукты электролиза быстро разлагаются и превращаются в компоненты, обычно содержащиеся в морской воде. Экспериментально установлено, что интенсивность синтеза экзополисахаридов зависит от концентрации реагента, длительности воздействия и характера исходного биологического материала.

На фиг. 1 приведена схема размещения биологического материала; на фиг. 2 - движения хлорированной воды в экспериментальных емкостях; на фиг. 3 - схема экспериментальной установки для обработки биологического материала "активным хлором"; на фиг. 4 - данные об изменении содержания экзополисахаридов, выполняющих защитную функцию (а - кислоторастворимая фракция; б - щелочерастворимая фракция, % к контролю).

Способ реализуется следующим образом.

Стеклянные пластины закрепляют в окрашенные нейтральным составом металлические рамки и погружают в морскую воду на глубину 1-1,5 м. В летние месяцы (май-август) при температуре воды 20±3^oC за 10 дней в естественных условиях на их поверхности формируются бактерии, отнесенные к родам Pseudomonas, Vibrio, Bacterium, Micrococcus (Краткий определитель бактерий Берги. М.: Мир, 1980. 495 с.). Одновременно на пластинах отмечались простейшие, питающиеся бактериями, в небольших количествах диатомовые водоросли, проростки макрофитов.

По завершении формирования биологической системы пластины доставляют в аквариальное помещение и погружают в экспериментальные сосуды емкостью 5-10 л, в которые подается хлорированная морская вода (см. фиг. 1).

На фиг. 1 обозначены: 1 - емкость; 2 - пластины с естественными ассоциациями бактерий; 3 - труба подачи хлорированной воды.

В качестве контрольных использовали пластины, помещаемые в сосуды с проточной морской водой, не содержащей АХл.

"Активный хлор" получают методом бездиафрагменного электролиза морской воды (см. фиг. 2).

На фиг. 2 обозначены: 4 - труба, подающая морскую воду, 5 - электролизеры, 6 - устройство измерения и регулировки скорости протока, 7 - емкости для размещения экспериментального материала, 8 - стол-кювета.

Морская вода непрерывно поступает в электролизер 5, где в процессе электролиза образуется АХл, и стекает в экспериментальную емкость 7, куда помещается биологический материал. Заданная концентрация активного хлора поддерживается по токовой нагрузке на электролизере 5 и рассчитывается по формуле , где C - концентрация активного хлора, мг/л; K_э - электрохимический эквивалент хлора, K_э!=1,32 г/А·ч; η - выход по току активного хлора, η = 0,65; I - ток, А; W - расход воды, м³/ч.

Концентрацию "активного хлора" определяли стандартными методами (Унифицированные методы анализа воды. - М.: Химия, 1973). Определение проводили немедленно после отбора пробы.

Постоянная концентрация "активного хлора" в опыте обеспечивается стабильными значениями токовой нагрузки и расхода морской воды. Показания контролируются амперметром и ротаметром соответственно.

После 4-часовой экспозиции пластин в растворе биоцида с них соскабливают биомассу, которую обрабатывают на пару последовательно 80%-ным этанолом и дистиллированной водой (соотношение биомассы и экстрагента 1:100) для удаления углеводов, включаемых в энергетические процессы (моносахаров, запасных полисахаридов типа гликогена и крахмала). Остатки навески обрабатывают последовательно 2%-ной серной кислотой и 2%-ным едким натром, в кислотных и щелочных гидролизатах, объемы которых фиксируют, содержатся экзополисахариды, их количества определяют с антроновым реактивом (Trevelayn W.E. Marrison j. z. Fractionation and microdetermination of cell carbohydrates - j. Biochem, 1952, v. 50, p. 3-7).

Пример 1. Изучают эффективность воздействия различных концентраций активного хлора на интенсивность синтеза экзополисахаридов, выполняющих протекторные функции, естественными ассоциациями прикрепленных бактерий. Уже при концентрации "активного хлора" 0,25 мг/л содержание кислых полисахаридов превышает контрольный уровень 60% (фиг. 3,а). Максимальная (примерно трехкратная) стимуляция синтеза этой фракции углеводов отмечается при концентрации АХл 1 мг/л. Дальнейшее увеличение интенсивности отрицательного воздействия на бактерий приводит к снижению эффекта стимулирования синтеза экзополисахаридов (фиг. 3, а) до 140% от контроля. В присутствии 0,25 мг/л соединений "активного хлора" количество углеводов, содержащихся в щелочном гидролизате навески, превышает контрольный уровень на 40%. Двукратное увеличение концентрации агента (0,5 мг/л) сопровождается интенсификацией синтеза этой фракции углеводов примерно в 2,5 раза по сравнению с контролем. В присутствии 2 мг/л "активного хлора" отмечается ингибирование их синтеза (количество щелочерастворимых углеродов снижается до уровня контроля, фиг. 3,б).

Таким образом, под влиянием соединений "активного хлора" в концентрации 0,25 - 1,5 мг/л и продолжительности воздействия 4 ч в метаболических процессах закрепленных естественных ассоциаций бактерий происходят изменения: стимулируется синтез полисахаридов, выполняющих протекторную функцию, имеющих народно-хозяйственное значение.

Пример 2. Испытывают влияние продолжительности непрерывного воздействия АХл в концентрации 1 мг/л (см. таблицу) на синтез защитных полисахаридов организмами изучаемой биологической системы. При экспозиции в течение 2 ч количество углеводов каждой фракции (кислотной и щелочной) снижается крайне незначительно. При увеличении времени контакта с биоцидом в 2 раза отмечается 15-20%-ное возрастание их содержания. Дальнейшее удлинение экспозиции (8, 16, 24 часа) сопровождается той же направленностью процессов: количество кислых полисахаридов возрастает, достигая максимума (170% от контрольного уровня) при 24 ч воздействия (см. таблицу).

Самое высокое содержание щелочерастворимых углеводов отмечается при продолжительности воздействия, равной 8 ч. Удлинение воздействия до 16 и 24 ч вызывает незначительное падение их количества в навеске (см. таблицу).

Следует отметить, что интенсификация синтеза защитных полисахаридов в значительной мере зависит от их уровня в контроле. Если он достаточно высок, что может в значительной мере определяться вспышкой проростков макрофитов на стеклах обрастания, и защитные механизмы уже включены, то увеличение их содержания в ответ на действие АХл будет выражено несколько слабее.

Сравнительный анализ полученных данных свидетельствует о том, что более четкое стимулирование синтеза бактериальных полисахаридов достигается при варьировании концентраций биоцида. При возрастании продолжительности воздействия эта же направленность процессов сохраняется, хотя количественные ее оценки более низки.

Предлагаемый способ обладает следующими преимуществами по сравнению с известными.

1. Способ предполагает управление синтезом экзополисахаридов, существенно повышая эффективность процесса.

2. Доступность сырья и относительная простота его наращивания.

3. Соединения, входящие в состав "активного хлора", образуются из компонентов морской воды и в связи с их нестойкостью разлагаются с образованием исходных продуктов, что позволяет использовать воду повторно.

4. При возврате отработанной воды в водоем используемые концентрации нестойких соединений, входящих в состав "активного хлора", не принесут ущерба окружающей среде.

Формула изобретения

Способ получения экзополисахаридов, включающий предварительную обработку биологического сырья 80%-ным этанолом и дистиллированной водой с последующей экстракцией 2%-ной серной кислотой и 2%-ной щелочью в сочетании с термообработкой и выделение целевого продукта, отличающийся тем, что в качестве биологического сырья используют естественные ассоциации бактерий преимущественно родов Pseudomonas, Vibrio, Bacterium, Micrococcus, поселяющихся на поверхности стеклянных пластин, выставленных в морскую среду в летнее время, а перед предварительной обработкой на биологическое сырье воздействуют "активным хлором" в концентрации 0,5 - 1,5 мг/л в течение 4 ± 0,2 г.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5