Способ получения протеолитических ферментов из бактерий рода bacillus

 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для производства бактерийных и ферментных препаратов. Используют антагонистически активный штамм Bacillus subtilis 3H (ГИСК 248), обладающий способностью продуцировать нейтральную протеазу. Культивирование штамма проводят при посевной дозе (3 - 5) x 10⁹ кл/мл, насыщении среды кислородом в пределах 70 - 90%. Культуральную жидкость отделяют от биомассы микрофильтрацией с последующей стерилизующей фильтрацией целевого ферментного препарата. Полученная биомасса является основой для получения препарата-пробиотика. Протеолитическая активность культуральной жидкости 46 ± 6 ПЕ/г, готового концентрата 50 ± 5 ПЕ/г. 1 табл.

Изобретение относится к биотехнологии, производству бактерийных и ферментных препаратов.

Известные способы культивирования бактерий рода Bacillus являются основной для технологии получения ряда бактериальных и ферментных препаратов. Ферментные препараты с различной активностью выделяют из культуральных супернатантов, полученных при гомогенном глубинном культивировании различных штаммов бактерий рода Bacillus [1, 2]. Биомасса при этом является неиспользуемым отходом производства.

В то же время в известных способах получения бактерийных препаратов на основе биомассы Bacillus subtilis, выращенной на жидких питательных средах в условиях аэрации и перемешивания [3] , производственным отходом является бесклеточная культуральная жидкость, содержащая гидролитические ферменты в различных количествах.

Наиболее близким по техническому решению к заявленному является способ получения протеолитических ферментов путем совместного культивирования бактерий Bacillus thuringiensis v. galleriae 69-6 - продуцента инсектицида и Bacillus thuringiensis v. galleriae GFP-51 - продуцента протеазы [4]. При такой технологии выращивания за одну ферментацию получают два продукта - ферментный препарат и биологический инсектицид.

В известном способе полученную культуральную жидкость, содержащую два продуцента, разделяют центрифугированием на биомассу и супернатант, из которого в последующем методом ацетонового осаждения выделяют ферментный комплекс.

Недостатками описанной технологии являются присутствие балластной примеси биомассы второго штамма в препарате инсектицида из-за одновременного культивирования двух штаммов; нетехнологичный, трудоемкий и энергоемкий этап центрифугирования для разделения культуральной жидкости, а также ацетоновый способ осаждения целевого продукта, требующий использования оборудования во взрывобезопасном исполнении и небезопасный для обслуживающего персонала.

Задачей настоящего изобретения является создание технологии, позволяющей одновременно получать протеолитические ферменты и препарат-пробиотик.

Поставленная задача решена подбором производственного штамма, биомассы которого по своим свойствам является основной препарата-пробиотика и способна в процессе жизнедеятельности продуцировать протеазу, отработкой оптимальных условий его культивирования для накопления антагонистически активной биомассы и высокого уровня протеолитической активности фермента в культуральной жидкости, а также разработкой способа выделения и очистки ферментного комплекса.

Сущность изобретения заключается в использовании антагонистически активного штамма Bacillus subtilis 3H (ГИСК N 248), обладающего способностью продуцировать нейтральную протеазу [5] . Процесс культивирования штамма проводят при посевной дозе (3 - 5)·10⁹ кл/мл, насыщении среды кислородом в пределах 70 - 90%. Супернатант отделяют от биомассы методом микрофильтрации с последующей стерилизующей фильтрацией целевого ферментного препарата. Полученная биомасса является основой для получения препарата-пробиотика.

Решение поставленной задачи иллюстрируется следующими примерами.

Пример 1. Штамм Bacillus subtilis 3H высевают на 2 матраса с агаризованной синтетической питательной средой, содержащей пептон, мальтозу, минеральные соли, микроэлементы и помещают в термостат при 37^oC на 18 - 20 ч. Далее смытую с агара микробную взвесь засевают в аппарат культивирования для подращивания на жидкой среде того же состава в объеме 5 л и растят 3 - 4 ч. до достижения культурой фазы экспоненциального роста.

Далее эту культуру в дозе (1,0 ±0,5)·10⁹ кл/мл используют в качестве посевного материала для проведения основного процесса в реакторе "Биор" вместимостью 100 л. Выращивание проводят при температуре 37^oC, насыщении среды кислородом 70 - 80%, перемешивании со скоростью вращения мешалки 400 об/мин, в течение 16 - 20 ч. до перехода культуры в споровую форму и прекращения нарастания протеолитической активности культуральной жидкости.

В полученной при этом способе культуральной жидкости уровень протеолитической активности колеблется в пределах 10±3 ПЕ/г, а количество микробных клеток составляет (20 ± 5)·10⁹ кл/мл.

Протеолитическую активность культуральной жидкости определяют методом Ансона при нейтральных значениях pH. Антагонистическую активность биомассы оценивают методом отсроченного антагонизма к тестовым штаммам патогенных микроорганизмов, и она составляет не менее 10 мм задержки роста.

Ферментсодержащий супернатант отделяют от биомассы методом микрофильтрации в плоскокамерных аппаратах, заправленных мембранами "Мифил". Биомассу используют для получения бактериального препарата-пробиотика.

После микрофильтрации протеолитическая активность культуральной жидкости падает до 2,0 - 4,0 ПЕ/г из-за неспецифической сорбции фермента на мембранах "Мифил".

Очищенный от микробных клеток ферментсодержащий пермеат концентрируют на отечественной ультрафильтрационной установке AP-2,0, изготовленной на основе волокон ВПУ-15. Для снижения неспецифической сорбции фермента мембраны установки перед ультрафильтрацией обрабатывают 0,5%-ным раствором альбумина, а затем отмывают нейтральным фосфатным буфером. Фермент концентрируют до объема 3,8 ± 0,3 л и достижения активности (50 ± 5) ПЕ/г. После чего проводят стерилизующую фильтрацию.

Таким образом, использование в данном примере посевной дозы, достаточной для получения биомассы, не обеспечивает высокого уровня активности фермента в культуральной жидкости.

Пример 2. Штамм Bacillus subtilis 3H высевают на 10 матрасов с агаризованной синтетической питательной средой, содержащей пептон, мальтозу, минеральные соли, микроэлементы, и помещают в термостат при 37^oC на 18 - 20 ч. Далее смытую с агара культуру засевают в реактор "Биор" вместимостью 100 л, содержащий 32 л синтетической питательной среды. Подращивание проводят при температуре 37^oC, 80 - 90%-ном насыщении среды кислородом, перемешивании со скоростью вращения мешалки 430 об/мин в течение 9 - 10 ч. до достижения концентрации микробных клеток 10·10⁹. Затем доливают в реактор 40 л той же среды, при этом посевная доза должна составлять (4,2 ± 0,2) · 10⁹ кл/мл. Скорость вращения мешалки увеличивают до 450 об/мин, температурный режим и оксигенацию сохраняют без изменений в течение 14 - 16 ч. до перехода культуры в споровую форму и прекращения нарастания протеолитической активности.

Уровень протеолитической активности культуральной жидкости, полученной при этих условиях, колеблется в пределах 46 ± 6 ПЕ/г. Далее ферментосодержащий супернатант отделяют от биомассы методом микрофильтрации, используя мембраны "Мифил", при этом его протеолитическая активность остается на уровне 12 ± 3 ПЕ/г.

Полученный пермеат концентрируют ультрафильтрацией, как в примере 1, до объема (10,5 ± 0,5) л активности 50 ± 5 ПЕ/г и подвергают стерилизующей фильтрации. Биомассу используют для получения препарата-пробиотика.

Пример 3. Культивирование проводят, как в примере 2. Но фермент отделяют от биомассы методом микрофильтрации, используя мембраны "Millipore", "Pall", "Gelman Sciense", что позволяет сохранять протеолитическую активность культурального супернатанта в пределах 46 ± 6 ПЕ/г, а конечный объем фермента соответствует 60 ± 1 л.

Биомассу используют для получения препарата-пробиотика.

Поскольку уровень активности полученного фермента соответствует уровню его активности в концентратах, произведенных по примерам 1 и 2, то в данном случае может быть исключен этап дальнейшего концентрирования целевого продукта. Стерилизующую фильтрацию проводят сразу после микрофильтрации, используя мембраны фирм "Millipore", "Pall", "Gelman Sciense". Полученный фермент используют в жидкой форме или лиофильно высушивают.

Сравнительная характеристика получения фермента и биомассы по примерам 1 - 3 представлена в таблице.

Из данных таблицы следует, что способ получения биомассы и фермента по примеру 3 обеспечивает более высокий выход фермента.

Таким образом, при использовании предлагаемого способа повышается коэффициент использования оборудования, так как за один цикл культивирования из одного реактора можно получить два продукта - протеолитический фермент и бактериальный препарат-пробиотик; расход питательной среды сокращается вдвое, продукты культивирования используются полностью, что предлагается возможность организации безотходного производства.

Источники информации.

1. А. с. СССР N 899646, кл. C 12 N 9/54, 23.01.82. Способ получения щелочной протеазы.

2. Патент DE N 3834550, кл. C 12 N 9/54, 19.04.90. Протеолитический фермент, его получение и применение.

3. Патент РФ N 2056855, кл. A 61 K 35/74, 27.03.96. Способ получения препарата Споробактерин".

4. А.с. СССР N 1316239, кл. C 12 N 9/54, 30.07.91. Способ получения протеолитических ферментов.

5. Патент РФ N 2067616, кл. C 12 N 1/20, 10.10.96. Штамм бактерий Bacillus subtilis, несущий свойство антибиотикорезистентности, используемый для получения препарата "Бактиспорин".

Формула изобретения

Способ получения протеолитических ферментов из бактерий рода Bacillus, включающий культивирование бактерий рода Bacillus на жидкой питательной среде в условиях аэрации и перемешивания, отделение ферментсодержащей культуральной жидкости и биомассы с последующим выделением целевого продукта, отличающийся тем, что для культивирования используют штамм Bacillus subtilis 3Н (ГИСК N 248), процесс культивирования проводят при посевной дозе (3 - 5) · 10⁹ кл/мл, исходной концентрации растворенного в среде кислорода 0,8 - 1,8 г/л, отделение ферментосодержащей культуральной жидкости от биомассы проводят микрофильтрацией с последующей стерилизующей фильтрацией целевого продукта.

РИСУНКИ

Рисунок 1