Применение замещенных производных аденина для лечения рассеянного склероза

 

Предложен новый способ лечения пациентов, страдающих рассеянным склерозом, с помощью терапевтических средств, содержащих производные аденина, такие как 2-хлор-2-дезоксиаденозин. Препарат значительно улучшает состояние больного, не дает технических побочных эффектов в виде тошноты, рвоты, кожной сыпи, почечные или печеночные нарушения. 5 з.п.ф-лы, 1 табл.

Изобретение относится к терапевтическим методам лечения рассеянного склероза. Более конкретно, данное изобретение касается применения замещенных производных аденина для лечения рассеянного склероза.

Рассеянный склероз (PC) является результатом демиелинизации в головном и спинном мозге (центральной нервной системе). Симптомы демиелинизации - слабость, зрительная недостаточность, отсутствие координации движения и парестезия (спонтанно возникающее неприятное ощущение онемения, покалывания и т.п. ). Течение этого заболевания весьма непредсказуемо, однако часто прогрессирует через цикл обострения симптомов с последующей ремиссией.

При традиционных методах лечения в настоящее время применяют терапию с помощью АКТГ (адренокортикотропного гормона) или кортикостероидов, таких как преднизон. Контрольные исследования предполагают, что такие методы лечения индуцируют более быстрое устранение острых симптомов и признаков болезни, однако они не влияют на отдаленные последствия заболевания. Длительная поддерживающая терапия с помощью АКТГ или кортикостероидов противопоказана, так как иммуносупрессанты не оказывают продолжительного воздействия на течение болезни. (Cecil. Textbook of Medicine, Beeson et al, eds., 15th ed., W.B. Sauders Company, Philadelphia, (1979) page 847).

Этиология рассеянного склероза неизвестна, однако связана с целым рядом генетических и окружающих факторов. Как клеточноопосредованные, так и гуморальные иммунные реакции, стимулированные чужеродными или аутоантигенами (аутологичными антигенами), могут иметь значение в патогенезе рассеянного склероза. Некоторые гены иммунного ответа могут быть ассоциированы с повышенной подверженностью этому заболеванию. Заболевание может быть опосредовано Т-клетками, распознающими еще не идентифицированный аутоантиген. Например, экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЭАЭ), животная модель демиелинизирующих болезней, таких как рассеянный склероз, может быть индуцирован иммунизацией мышей цельным миелином или специфическими компонентами миелина, такими как основной белок миелина.

У людей с рассеянным склерозом обострения болезни коррелируются с высокими уровнями неоптерина в крови и цереброспинальной жидкости. Неоптерин представляет собой фактор, высвобождаемый из активированных моноцитов и макрофагов, что тем самым вовлекает эти клетки в обострения рассеянного склероза. (Fredrickson et al. (1987), Acta Neurol. Scand., 75:352-355; Huber et al. (1984), J. Exp. Med., 160:310-316). На микроскопическом уровне моноциты и микроглиальные клетки (макрофаги центральной нервной системы) обнаруживаются в пределах демиелинизированных областей нервных клеток во время обострения рассеянного склероза. (Cecil, textbook of Medicione (1979), Beeson et al. (eds.), W.B. Sauders Company, Philadelphia, PA).

Разнообразные традиционные методики лечения используются с целью ослабления симптомов рассеянного склероза. Многие из них предусматривают использование паллиативных, противовоспалительных агентов. На сегодняшний день ни одно из лечений не принесло существенного положительного эффекта в течение болезни.

Недавно описано применение специфических дезоксирибозидов в качестве противовоспалительных средств. Например, патент США 4481197 (Rideout et al.) относится к использованию незамещенных производных 3-деаза-2'- дезоксиаденозина при лечении воспаления. Патент США 4381344 (Rideout et al.) касается метода синтеза дезоксирибозидов, который предусматривает использование бактериальной фосфорилазы.

Обнаружено, что производное дезоксиаденозина, 2-хлоро-2'-дезоксиаденозин (CdA), является эффективным средством для лечения хронической лимфоцитарной лейкемии и некоторых видов Т-клеточных злокачественностей. (Carson et al. (1984) Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., 81:2232-2236; Piro et al. (1988), Blood 72: 1069-1073). Описана и сравнена фармакокинетика перорально и подкожно введенного 2-хлоро-2'-дезоксиаденозина при лечении хронической лимфоцитарной лейкемии. (Liliemark et al. (1922) Journal of Clinical Oncology, 10, (10): 1514-1518; Juliusson et al. (1922) Blood, 80 (Suppl, 1): 1427). Хроническая лимфоцитарная лейкемия является злокачественностью лимфоцитов B, которые переносят поверхностный антиген Leu-1.

В-клетки leu-1 представляют меньшее содержание нормального пула лимфоцитов В, обычно менее 20 процентов. Клетки Leu-1 экспрессируют поверхностные маркеры, которые обычно находятся на моноцитах (антиген Мас-1) и т-лимфоцитах (антиген Leu-1). Приблизительно 10 процентов пациентов с хронической лимфоцитарной лейкемией проявляют сопровождающуюся аутоиммунную реакцию, а недавно клетки Leu-1 стали иметь значение в патогенезе аутоиммунных болезней.

Клинические исследования фазы 1 на пациентах из числа людей с хронической лимфоцитарной лейкемией показывают, что инфузия возрастающих дозировок 2-хлор-2'-дезоксиаденозина [0,1-0,5 мг на 1 кг массы тела в день (мг/кг/день)] приводит к повышенным концентрациям плазмы лекарственного препарата [10-50 наномоль (нМ)] . Эти инфузии показали, что лекарственный препарат хорошо переносился и не индуцировал тошноту, рвоту или лихорадку. Доза, ограничивающая токсичность, представляла собой супрессию костного мозга, которая обычно встречается при дозах свыше 0,2 мг/кг/день или при уровнях плазмы крови свыше 20 нМ.

Другие исследования, Montgomery et al. (1959) J. Am. Chem. Soc., 82: 463-468, показывают, что 2-фтораденозин проявляет относительно высокую степень цитотоксичности. Эти разработчики отмечают, что черные мыши С57, которым имплантирована Аденокарцинома 755 (Ад755), могут переносить только около 1 мг на 1 кг массы тела. Обнаружено, что 2-фтораденозин неактивен на этом уровне в отношении Ад755, а также лейкемии Л1210 и опухоли асцита Эрлиха.

Патент США 4751221 и выделенный из него патент 4918179 на имя Watanabe et al. описывают синтез и использование нескольких 2-замещенных 2'-дезокси-2'-фторарабино-фуранозил нуклеозидов, включая производные аденина. Эти соединения, как отмечают, имеют противоопухолевую и противотрипаносомную биологическую активность. Приводятся данные по цитотоксичности, показывающие противоопухолевую активность производных 2-амино-6-тиопурина, гуанина и тиопурина против мышиных и человеческих линий клеток.

Патент США 5034518 на имя Montgomery et al. описывает синтез 2-замещенных 2'- дезокси-2'-фторарааденозинов. Эти соединения обладают противораковой активностью, и данные по продлению жизни мышей, которым трансплантированы клетки лейкемии Р-388, также приведены в этой работе.

Биохимическая активность 2-CdA в клетках рассмотрена в работе Ernest Beutler. (The Lancet (1992), 340:952-956 - введена в данное описание в качестве ссылки).

2',3'-Дидезоксинуклеозиды фосфорилироны в положении 5' в клетках Т с образованием производных 5'- нуклеотидтрифосфата. Эти производные хорошо известны в качестве субстратов для молекул обратной транскриптазы. (Ono et al. (1986) Biochem. Biophys. Res. Comm., 2:498-507).

Эти 2',3'-дидезоксинуклеозид 5'-трифосфаты также используются бета и гамма ДНК-полимеразами млекопитающих. (Waquar et al. (1984) J. Cell. Physiol., 121:402-408). Они, тем не менее, являются плохими субстратами для ДНК-полимеразы-альфа, которая представляет собой основной фермент, отвечающий как за репарационный, так и за репликативный ДНК-синтез в лимфоцитах человека. Частично эти свойства могут объяснить селективную анти-ВИЧ активность 2',3'- дидезоксинуклеозидов.

Chan et al. (1982) J. Cell Physiol., 111:28-32, исследовали пути метаболизма пиримидин-нуклеотида в мышиных перитонеальных макрофагах и моноцитах и привели необнаруживаемые уровни дезоксицитидин-киназы или тимидин-киназы в данных клетках. Однако были обнаружены высокие уровни аденозин-киназы.

Аналогичные высокие уровни аденозин-киназы обнаружены в человеческих моноцитах и макрофагах, имеющих человеческое происхождение (MDM). Обнаружено, что MDM проявляют приблизительно от одной десятой до одной четвертой активности нуклеозид-киназы Т-лимфобластов GEM (например, АТОС CCL 119) по отношению к уридину, дезоксицитидину и тимидину и приблизительно две трети активности аденозин-киназы клеток GEM. Кроме того, эта активность аденозин-киназы клеток MDM по крайней мере в 10 раз выше, нежели активность других киназ. Данные исследования также показывают относительно низкие уровни нуклеозид-фосфорилирования с использованием АЗТ, дидезоксицитидина(ддЦ) и 2', 3'-дидезоксиаденозина (ддА) в интактных Т-лимфобластах GEM и еще более низкие уровни с использованием MDM.

Приведено несколько 2-замещенных производных аденозина, которые не деаминированы аденозин-деаминазой. Например, Coddington (1965) Biochem. Aota, 99: 442-451, описывает, что дезоксиаденозин-1-N-оксид, а также 2-гидрокси-, 2-метил-, 2-хлоро-, 2- ацетамидо- и 2-метилтиоаденозины не являются ни субстратами, ни ингибиторами аденозин-деаминазы. Montgomery в работе Yucleosides, Nucleotides, and Their Biological Applications, Rideout et al. eds., Academic Press, New York, page 19, (1983), приводят таблицу сравнительных данных K_m и V_max относительно деаминирования аденозина,2-гало-аденозинов, 2-галодезоксиаденозинов и 2-фторо-арабиноаденозина. Таблица показывает также, что эти 2-гало-производные аденина являются плохими субстратами для фермента относительно самого аденина. Stoeckler et al. (1982) Biochem. Pharm., 31: 1723-1728, раскрывают, что производные 2'-дезокси-2'-азидорибозил- и 2'-дезокси-2'-азидорабинозил-аденина являются субстратами для человеческой эритроцитной аденози-деаминазы, тогда как исследование других авторов показывает, что 2-фтораденозин имеет незначительную активность с использованием аденозин-деаминазы.

2-Хлор-2'-дезоксиаденозин фосфорилирован неделимыми (нормальными) лимфоцитами человеческой периферической крови и конвертирован в 5'- трифосфат. Это производное аденина не катаболизируется в значительной степени интактными человеческими клетками или клеточными экстрактами и фосфорилируется эффективно с помощью Т-лимфоцитов. (Carson et al. (1980) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77: 6865-6869).

Как описано выше, высокие уровни аденозин-киназы обнаружены в мышиных перитонеальных макрофагах и в человеческих моноцитах. Аденозин-киназа может фосфорилировать производные 2'-дезоксиаденозина, однако делает это менее эффективно, нежели дезоксицитидин-киназа. (Hershfield et al. (1982) J. Biol. Chem., 257: 6380-6386).

Ниже описаны химиотерапевтические вещества, которые можно использовать в качестве терапевтических средств в лечении рассеянного склероза.

Настоящее изобретение предусматривает способ лечения рассеянного склероза. В данном способе пациента, страдающего рассеянным склерозом, лечат композицией, имеющей фармакологически приемлемый носитель и замещенное производное аденина, растворенное или диспергированное в носителе. Замещенное производное аденина присутствует в фармакологически приемлемом носителе в количестве, достаточном для получения терапевтически эффективной дозы в течение курса лечения.

Предпочтительные замещенные производные аденина, пригодные для лечения рассеянного склероза, могут быть представлены формулой I, имеющей следующую структурную формулу: где Z обозначает O^- или отсутствует; Y - водород или заместитель, содержащий от 1 до приблизительно 20 атомов, который свободен от захватывающего заряда иона при физиологических значениях pH, продуцирует растворимое производное аденина и чье присутствие на части аденина ингибирует деаминирование указанного производного аденина аденозин-деаминазой; X - водород или фтор при условии, что Y - водород только в том случае, когда присутствует Z.

Особенно предпочтительные соединения формулы I свободны от группы Z, то есть, Z отсутствует, и содержит галогруппу в 2 положении. Наиболее предпочтительными соединениями являются 2-хлор-2'-дезоксиаденозин и 2- хлор-2'-дезокси-2'-арафтораденозин.

Способы синтеза всех этих соединений указаны в патенте США 5106837 (Carson et al. , 21 апреля 1992 года, введен в данное описание в качестве ссылки).

Изобретение показывает, что болезненное состояние пациента, страдающего рассеянным склерозом, может быть улучшено путем введения количества вышеописанной композиции, содержащей достаточное количество соединения формулы I, с получением терапевтически эффективной дозы. Примерные дозировки варьируются в приблизительных диапазонах от 0,04 до 1,0 мг/кг/день, причем более предпочтительные дозы составляют приблизительный диапазон от 0,04 до 0,2 мг/кг/день. Как правило, такое количество достаточно для получения концентрации в плазме крови пациента от около 0,5 наномоль (нМ) до около 50 нМ, более предпочтительно от около 1 нМ до около 10 нМ.

Предпочтительно, чтобы агентом, предполагаемым для использования в настоящем изобретении, был 2-гало-2'-дезоксиаденозин (2-гало-2'-дезокси-9,1'-бета-рибофуранозиладенин) или 2-гало-2'- дезокси-2'-арафтораденозин, и наиболее предпочтительно, если галогруппой является хлор.

Другой вариант в соответствии с настоящим изобретением предполагает применение подкожной инъекции для введения эффективного количества активного ингредиента (агента) по изобретению для лечения рассеянного склероза.

Альтернативный вариант в соответствии с настоящим изобретением предполагает пероральное введение эффективного количества активного ингредиента (агента) изобретения в способе лечения болезни. Предпочтительные соединения формулы I для перорального введения включают соединения, в которых X обозначает фтор.

В каждом из вышеупомянутых способов замещенное производное 2'-дезоксиаденозина вводят в терапевтически эффективном количестве. Эффект соединения формулы I зависит от пути введения и от времени и дозировки. Как следствие, можно отследить дозировку и продолжительность введения конкретного соединения для стадии болезни и состояния пациента. Если стадия рассеянного склероза развитая или угрожает жизни, лечение может быть более агрессивным, и терапевтически эффективное количество представляет собой такое количество, которое достаточно для уничтожения по крайней мере 50% присутствующих моноцитов, однако меньше того количества, которое по существу придает костному мозгу функцию, определяемую обычными методиками, когда введение лекарственного средства осуществляют in vivo. Количество соединения формулы 1, уничтожающее моноциты, является другой величиной терапевтически эффективной дозы, и гибель моноцитов измеряют через семь дней после первоначального введения препарата.

A. Соединения. Настоящее изобретение предусматривает применение замещенного производного аденина, то есть, замещенного 2'-дезокси-арабинофуранозиладенина, для лечения рассеянного склероза. Предпочтительные замещенные производные аденина имеют структуру формулы I где Z обозначает оксидный радикал (O^-) или отсутствует; Y - водород или радикал, содержащий от 1 до приблизительно 20 атомов, который свободен от захватывающего заряда иона (net ionic chrage) при физиологических значениях pH, продуцирует растворимое производное аденина и чье присутствие в адениновой части ингибирует деаминирование указанного производного аденина аденозин-деаминазой; X - водород или фтор при условии, что Y - водород только в том случае, когда присутствует Z.

Предпочтительно Y обозначает хлор. Другие заместители Y могут быть выбраны из группы, состоящей из радикалов низшего алкила, низшего алкано-иламидо, низшего алкилтио и гидроксила. В особенно предпочтительных вариантах, когда Y обозначает хлор, X обозначает фтор.

Предпочтительным соединением формулы I является 2-хлоро-9,1'- бета-D- 2'-дезоксирибозиладенозин, иначе известный как 2- хлородезоксиаденозин или CdA.

Соединения формулы I, в которых X обозначает фтор, находятся среди предпочтительных соединений для использования пероральным путем.

Другими примерами соединений, включенных в формулу I, являются: 2-бром-9,1'-бета-D-2'-дезоксирибозиладенин;
2-метил-9,1'-бета-D-2'-дезоксирибозиладенин;
2-фтор-9,1'-бета-D-2'-дезоксирибозиладенин;
2-ацетамидо-9,1'-бета-D-2'-дезоксирибозиладенин;
2-метилтио-9,1'-бета-D-2'-дезоксирибозиладенин;
2-хлор-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин;
2-бром-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин;
2-(N-ацетамидо)-9,1'бета-2'дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин;
2-метилтио-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин.

Другими примерами соединений формулы I являются следующие арабинофуранозилпроизводные аденина:
2-метил- 9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин;
2- изопропил-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин;
2- гидрокси-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин;
2- хлор-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин-1-N-оксид;
2-фтop-9,l'-бeтa-2'-дeзoкcи-2'-фтop-D-apaбинoфуpaнoзилaдeнин-1-N- оксид;
2-бром-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D- арабинофуранозиладенин-1-N-оксид;
2-метил-9,1'-бета-2'-дезокси-2'- фтор-D-арабинофуранозиладенин-1-N-оксид;
2- (N-ацетамидо)-9,1'- бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин-1-N-оксид;
2- гидрокси-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин-1-N- оксид;
2-(2-метилбутил)-9,1'-бета-2'-дезокси-2'-фтор-D - арабинофуранозиладенин-1-N-оксид;
2-фтор-9,1'-бета-D-2'-дезоксиаденозин-1-оксид;
2-хлор-9,1'-бета-D-2'-дезоксиаденозин-1-оксид.

Следует отметить, что, когда X обозначает водород, кольцо сахара может быть названо как радикал 2'-дезоксирибозил или 2'- дезоксиарабинофуранозил. В данном описании используются оба названия. При описании класса соединений, охватываемых формулой I, все соединения рассматриваются здесь как производные арабинозы. Однако, когда рассматриваются специфические соединения подкласса, где X = H, используется более известное название дезоксирибоза, как в случае дезоксиаденозина. Эти соединения также упоминаются здесь просто как производные аденина.

В вышеприведенных формулах, а также во всех других формулах данного описания не показаны атомы водорода в кольцах пурина и фуранозидила без необходимости специальной оговорки показа конформации относительно конкретной связи. Так, не показан атом водорода аденина в 8 положении.

Следует также учитывать, что D-изомеры соединений этих формул являются подполагаемыми изомерами. Следует также отметить, что обозначение "гало", используемое в описании, подразумевает включение производных фтора, хлора и брома и исключение производных иода, которые не являются устойчивыми и разлагаются, а также производных астатина, которые радиоактивны. Если предполагаются специфические галогенпроизводные, эти соединения называются специально.

Используемый в описании термин "заместитель, свободный от захватывающего заряда иона" (net ionic charge) включает как заряженные, так и незаряженные радикалы, при этом в случае, если радикал заместителя заряжен, присутствует внутренняя пара цвиттерионового заряда, которая приводит к потере результирующего заряда иона для молекулы при физиологических значениях pH. N-оксидные соединения являются примерами таких заместителей.

Используемый в описании термин "растворимое производное аденина" представляет собой производное аденина, которое способно растворяться и оставаться растворимым в жидкости организма, такой как кровь, при терапевтически эффективной дозе, описанной выше.

Используемое в описании выражение "заместитель, присутствие которого на части аденина ингибирует деаминирование производного аденина аденозин-деаминазой" означает, что при инкубировании 100 мкл 1 мМ раствора замещенного производного аденина в течение 3 часов при комнатной температуре с помощью 25 единиц аденозин-деаминазы телячьей селезенки (1 единица катализирует деаминирование 1 мкМ аденозина в минуту) заместитель продуцирует одно УФ-абсорбирующее пятно при тонкослойной хроматографии на целлюлозе реакционной смеси, величина R_f которой та же самая, что и данная величина используемого замещенного производного аденина.

Метаболизм соединения под действием аденозин-деаминазы можно исследовать с помощью следующей методики. Отдельные нуклеозиды при концентрации от 5 до 200 мкМ в 10 мМ растворе натрий-фосфата, pH 7,5, инкубируют при температуре 18-20^oC с помощью 0,01 единицы/мл телячьей кишечной аденозин-деаминазы. Изменение оптической плотности при 265 нм и 250 нм измеряют спектрофотометрически. Значения K_m и V_max определяют методом Lineweaver-Burke с использованием ΔE^м₂₆₅ между аденозином и инозином.

Отношение V_max/K_m также характеризует величину относительной эффективности деаминирования ферментом. Заместитель, который создает отношение V_max/K_m, составляющее около 1% или меньше от значения отношения, полученного с использованием 2'- дезоксиаденозина, также является "заместителем, присутствие которого в адениновой части ингибирует деаминирование производного аденина аденозин-деаминазой".

Используемые в описании радикалы низшего алкила включают C₁-C₆-прямоцепочечные, разветвленные и циклические алкильные группы, например метил, этил, n-бутил, трет.-бутил, n-гексил, 1-этил-бутил, циклопентил, циклогексил и тому подобные. Низшие алканоиламидо-радикалы включают С₁-C₆ -радикалы, например формамидо, ацетиламидо, пропионамидо, гексамоиламидо и тому подобное. Низшие алкилтио-радикалы включают С₁-С₆-прямоцепочечные, разветвленные и циклические алкильные группы, приведенные выше, которые присоединены к тиорадикалу.

Также используются фармакологически приемлемые соли соединения вышеприведенной формулы I или формулы II. Фраза "фармакологически приемлемые соли", как она используется в данном описании, относится к нетоксичным кислым аддитивным солям, которые получают в основном путем взаимодействия соединения с соответствующей органической или неорганической кислотой. Характерные соли включают хлоргидрат, бромгидрат, сульфат, фосфат, цитрат, ацетат, малеат и тому подобное.

B. Композиции.

Соединение формулы I, растворенное или диспергированное в фармакологически приемлемом носителе, или вместе с ним, составляет композицию в соответствии с настоящим изобретениям.

Соединение формулы I и его фармакологически приемлемые соли пригодны как при короткосрочном, так и при долговременном лечении. Например, 2-замещенный-9,1'-бета-2'-дезокси- 2'-фтор-D-арабинофуранозиладенин вводят пациенту внутрь, например подкожно, путем инъекции, парентерально, перорально или ректально в виде суппозитория, в эффективном количестве.

Хотя соединение формулы I и его фармакологически приемлемые соли могут быть введены в виде чистого химического вещества, предпочтительно, чтобы оно вводилось в виде фармацевтической композиции. В любом случае, его вводят в количестве, достаточном для получения терапевтически эффективной дозы, описанной выше.

Соответственно, настоящее изобретение использует фармацевтическую композицию, содержащую терапевтически эффективную дозу соединения формулы I или его фармакологически приемлемой соли, далее упоминаемые как "активный ингредиент" или "агент", растворенных или диспергированных в фармакологически приемлемом носителе или разбавителе.

Фармацевтическую композицию получают любым известным в области фармацевтического дела способом, который предусматривает приведение во взаимодействие активного соединения и его носителя. Для терапевтического использования соединение, применяемое в настоящем изобретении, может быть введено в форме традиционных фармацевтических композиций. Такие композиции могут быть составлены таким образом, чтобы быть пригодными для перорального, подкожного или парентерального введения, либо в виде суппозиториев. В этих композициях агент обычно растворяют или диспергируют в физиологически толерантном носителе.

Носитель или разбавитель представляет собой вещество, пригодное для введения активного соединения, поэтому оно должно быть "фармакологически приемлемым" в отношении совместимости с другими ингридиентами композиции и не быть вредным для их реципиентов. Таким образом, используемые в данном описании фразы "физиологически толерантный" и "фармакологически приемлемый" взаимозаменяемы и относятся к молекулярным частицам и композициям, которые не продуцируют аллергическую или подобную неблагоприятную реакцию, такую как желудочно-кишечное расстройство, головокружение и тому подобное, при введении млекопитающему. Физиологически толерантный носитель может быть разнообразной формы в зависимости от препарата, предназначенного для введения, и предполагаемого пути его введения.

Как пример соответствующей композиции, соединение формулы I может быть использовано в жидких композициях, таких как стерильные суспензии или растворы, либо в виде изотонических препаратов, содержащих подходящие консерванты. Особенно подходят для настоящих целей инъецируемые среды, составленные из водных инъецируемых изотонических и стерильных солевых или глюкозных растворов. Дополнительные жидкие формы, в которые эти соединения могут вводиться для применения, включают вкусовые эмульсии со съедобными маслами, такими как хлопковое масло, кунжутное масло, кокосовое масло, арахисовое масло и тому подобное, а также эликсиры и аналогичные фармацевтические наполнители.

Агенты могут быть также введены в форме липосом. Как известно в данной области, липосомы обычно получают из фосфолипидов или других липидных веществ. Липосомы образуются моно- или многоламинарными гидратированными жидкими кристаллами, которые диспергированы в водной среде. Можно использовать любой нетоксичный, физиологически приемлемый и метаболизированный липид, способный образовывать липосомы. Настоящие композиции в липосомной форме могут содержать в дополнение к агенту стабилизаторы, консерванты, наполнители и тому подобное. Предпочтительными липидами являются фосфолипиды и фосфатидилхолины (лецитины), как натуральные, так и синтетические.

Способы образования липосом известны. См. например, Prescott, Ed., Methods in Cell Biology, Volume XIV, Academic Press, New York, N.Y. (1976), p. 38 et seq.

Агент формулы I может быть также использован в таких композициях, как таблетки или пилюли, предпочтительно с содержанием унифицированной дозы соединения. Для этой цели вещество (активный компонент) смешивают с традиционными таблетирующими ингредиентами, такими как кукурузный крахмал, лактоза, сахароза, сорбит, тальк, стеариновая кислота, стеарата магния, дикальцийфосфат, камеди или аналогичные вещества, например, нетоксичные, физиологически толерантные носители. Таблетки или пилюли могут быть ламинированы или компаундированы иным образом с получением унифицированных дозированных форм, позволяющих осуществлять пролонгированное или замедленное действие.

Следует иметь в виду, что кроме вышеупомянутых компонентов-носителей, фармацевтические составы, описанные в данной заявке, могут включать, при необходимости, один или более дополнительных компонентов-носителей, таких как разбавители, буферные растворы, вкусовые вещества, связующие, поверхностно-активные вещества, загустители, смазочные вещества, консерванты (включая антиокислители) и тому подобное, а также вещества, включаемые в композицию с целью придания ей изотоничности с кровью предполагаемого реципиента.

Таблетки или пилюли также могут быть покрыты энтеросолюбильной оболочкой в форме конверта, который служит для ограничения распада в желудке и позволяет активному компоненту проходить интактным в двенадцатиперстную кишку или быть задержанным при выделении. Целый ряд веществ может быть использован с целью получения таких энтеросолюбильных покрытий или слоев, включая полимерные кислоты или смеси таких кислот с такими веществами, как шеллак, шеллаковый и цетиловый спирт, целлюлоза-ацетат-фталат и тому подобное. Особенно подходящее энтеросолюбильное покрытие включает сополимер стирола и малеиновой кислоты вместе с известными веществами, которые способствуют получению тонкокишечных свойств покрытия. Способы получения энтеросолюбильных покрытий таблеток описаны в патенте США 4079125 на имя Sipos, который упоминается в настоящем описании в качестве ссылки.

Термин "унифицированная доза", используемый в данном описании, относится к физически дискретным единицам, соответствующим стандартным дозировкам для введения пациентам, и каждая такая унифицированная доза содержит предварительно установленное количество вещества, вычисленное для получения желаемого терапевтического эффекта вместе с фармацевтически приемлемым разбавителем. Примерами таких унифицированных форм доз в соответствии с настоящим изобретением являются таблетки, капсулы, пилюли, порошки, гранулы, облатки, крахмальные капсулы, чайные ложки, капельницы, ампулы, пробирки, совокупность вышеприведенных средств и тому подобное.

Введение соединения путем подкожной инъекции является наиболее удобным способом вследствие его благоприятной фармакокинетики.

Пероральное введение соединения также является привлекательным путем. Один недостаток, обычно ассоциируемый с пероральным введением биологически активного нуклеозидного соединения, состоит в потенциальном распаде в кислотных условиях желудка. То есть, гликозидная связь имеет тенденцию к гидролизу в кислотных условиях.

Однако, при необходимости осуществления перорального введения замещения в положении 2 кольца аденина соединения формулы I используются вместе с 2'-фторозамещенным кольцом арабинофуранозидила.

Marques et al. (1987) Biochem. Pharm., 36:2719-2722, описывают получение производных 2'-фторо-2',3'- дидезоксирибозы и 2'-фторо-2',3'-дидезоксиара-бинозы аденина. Они указывают, что оба производных стабильны при значении pH равном 1, при температуре 37^oC, тогда как дидезоксиаденозин имеет период полураспада 35 секунд при таких же условиях.

Способность производных аденина быть или не быть субстратом для аденозин-деаминазы является больше функцией 2-заместителя или его отсутствием в адениновой части молекулы, нежели функцией заместителей в части кольца сахара, по крайней мере, насколько это касается заместителей в обоих кольцах.

C. Методы.

Как указано выше, в соответствии с настоящим изобретением предлагается метод лечения рассеянного склероза. В широком понятии данный метод предусматривает лечение пациента, страдающего рассеянным склерозом, композицией, содержащей фармакологически приемлемый носитель, имеющий растворенный или диспергированный в нем в качестве активного ингредиента замещенное производное аденина (замещенный 2'-дезоксиаденин), структура которого соответствует структуре ранее приведенной формулы I. Замещенное производное аденина присутствует в композиции в количестве, достаточном для получения терапевтически эффективной дозы в течение периода взаимодействия. Вышеприведенное лечение обычно повторяют периодически, например, еженедельно или ежемесячно в течение периода от нескольких месяцев до приблизительно одного года.

Количество соединения формулы I, присутствующего в композиции и используемого в методе, описанном выше, зависит от нескольких переменных. К таким переменным относится и данный способ лечения. Примерные концентрации для различных режимов введения лекарственного препарата приведены ниже.

При введении in vivo количество вводимого препарата меньше того, которое в основном придает костному мозгу функции, определенные обычными методиками. Количество, достаточное для уничтожения по меньшей мере 50% моноцитов, первоначально присутствующих, но в основном не придающее костному мозгу функцию в течение периода введения лекарственного средства, является одним путем определения терапевтической дозы.

Вышеупомянутое количество 2'- дезоксиаденинпроизводного формулы I или его фармакологически приемлемой соли, присутствующего в композиции, также является количеством, достаточным для обеспечения приблизительно от 0,04 до 1,0 мг/кг массы тела лечащегося пациента в день. Более предпочтительно количество приблизительно от 0,04 до 0,20 мг/кг/день, еще более желательно приблизительно от 0,05 до 0,15 мг/кг/день, и наиболее предпочтительно около 0,1 мг/кг/день, когда вводится in vivo. Это количество является другим путем определения терапевтически эффективной дозы, которая особенно эффективна при введении соединения формулы I путем инфузии.

Молярная концентрация в плазме крови соединения формулы I или его фармакологически приемлемых солей во время лечения находится предпочтительно в диапазоне приблизительно от 1 наномоль (нМ) до 100 нМ, особенно от 5 нМ до 50 нМ, и более предпочтительно около 10-20 нМ. Молярность 2'- дезоксиаденинпроизводного в плазме крови пациента, подвергаемого лечению (введению препарата), таким образом представляет собой другой способ определения терапевтически эффективной дозы, из которой можно вывести требуемое количество в композиции.

Очевидно, что вышеприведенные терапевтически эффективные дозировки не являются обязательно результатом одного введения, а обычно представляют собой результат введения множества унифицированных доз. Эти стандартные дозы, в свою очередь, включают порции ежедневной или еженедельной дозировки, и поэтому терапевтически эффективную дозу препарата определяют в течение полного периода лечения (контактирования).

Пероральное введение и подкожное введение являются предпочтительными способами введения, как уже отмечалось выше. Для достижения желаемой концентрации вещества в плазме крови можно использовать диапазон дозировок в зависимости от конкретного способа введения, цели данного лечения, определенного вида используемого соединения и подобных факторов.

Например, для перорального введения суточная доза может составлять, исходя из расчета приблизительно от 0,04 до 1,0 мг/кг массы тела лечащегося пациента в день. Более предпочтительно приблизительно от 0,04 до 0,20 мг/кг/день, еще более предпочтительно приблизительно от 0,05 до 0,15 мг/кг/день, и наиболее предпочтительно около 0,1 мг/кг/день. Вообще вводимое количество активного замещенного производного аденина может варьироваться в относительно широком диапазоне с тем, чтобы получить и предпочтительно сохранить желаемую концентрацию в плазме.

Формы унифицированных доз производного аденина могут содержать приблизительно от 0,1 мг до 15 мг его. Предпочтительная форма унифицированной дозы содержит приблизительно от 0,1 до 1 мг вещества и может быть введена от 2 до 5 раз в сутки. Тем не менее, следует отметить, что также предлагается непрерывная инфузия с интенсивностью, рассчитанной для поддержания вышеописанной концентрации в плазме.

Продолжительность конкретного лечения также может варьироваться в зависимости от сложности заболевания, независимо от того, предназначено ли лечение для острой манифестации или для профилактических и других целей. Обычное введение длится в течение периода около 5-14 дней, причем 7-дневный курс является обычным. Курсы (циклы) введения могут быть также повторены с месячными интервалами, либо парентеральные стандартные дозы могут быть введены с недельными интервалами. Пероральные унифицированные дозы могут вводиться с интервалами от одного до нескольких дней с тем, чтобы определить терапевтически эффективную дозировку. Так, введение in vivo вышеописанной дозировки в течение периода около 5-14 дней, либо с недельными или суточными интервалами позволяет получить количество, достаточное для уничтожения по крайне мере около 50% первоначально присутствующих моноцитов.

Данный метод лечения приводит к снижению уровня содержания моноцитов в крови вследствие токсичности используемых соединений формулы I против моноцитов. Этот метод может быть использован для снижения числа моноцитов, циркулирующих в кровотоке подлежащего лечению млекопитающего, примерно на 90% от числа моноцитов, присутствующих перед лечением, в течение семидневного периода лечения, при этом уровень циркулирующих моноцитов возвращается к долечебному уровню приблизительно через две недели после прекращения лечения. Пример такого исследования приводится ниже.

Также предусматривается менее жесткий режим лечения, при котором вновь используют вышеописанную дозировку, например, концентрации в плазме крови, однако в течение более короткого времени контактирования с тем, чтобы ослабить функцию моноцитов, но в основном не уничтожить моноциты, как в случае применения вышеприведенного режима лечения. Ослабление функции моноцитов в данном случае определяют как уменьшение количества по крайней мере на 25% при спонтанной секреции интерлейкина-6 (ИЛ-6) моноцитами, культивируемыми в присутствии соединения формулы I в течение 72 часов. Соответствующий анализ на ослабление моноцитов приводится ниже.

В примерной лечебной схеме соединения формулы I вводят в количестве приблизительно от 0,04 до 1,0 мг/кг/день, более предпочтительно приблизительно от 0,04 до 0,20 мг/кг/день, еще более предпочтительно приблизительно от 0,05 до 0,15 мг/кг/день, и наиболее предпочтительно около 0,1 мг/кг/день. Такие схемы, как правило, приводят к получению концентрации в плазме приблизительно от 0,5 нМ до 50 мкМ, и более предпочтительно приблизительно от 10 нМ до 10 мкМ. Это однократное введение повторяют периодически, например, еженедельно в течение общего периода в несколько месяцев, например от трех до девяти месяцев. При обычной практике лекарственные препараты вводят в течение периода около 5-7 дней и повторяют примерно с четырехнедельными интервалами в течение нескольких месяцев, например около 3-9 месяцев.

Такое введение можно осуществить на основе амбулатурного лечения людей с применением внутривенной инфузии, продолжающейся в течение около 2-4 часов в кабинете врача. Как таковое, это лечение намного менее инвазивное, нежели чем при постоянной инфузии в течение нескольких дней, которая обычно требует нахождения в больнице хозяина-млекопитающего, то есть, человека. Менее инвазивный метод продолжающейся инфузии с использование насоса, присоединенного к катетеру, через который автоматически вливается заранее определенная доза, позволяет применять амбулаторное лечение во время инфузии.

Любой из вышеописанных методов может быть осуществлен во время лечения пациента предыдущим лекарством или лекарствами, либо после прекращения такого лечения. Когда прекращается лечение пациента даже частично эффективным средством, иногда происходит внезапное обострение симптомов, которое обычно исчезает через несколько месяцев. Кроме того, когда приостанавливается более ранняя схема лечения при одновременном использовании вышеописанного метода, этот более ранний метод лечения может быть продолжен после прекращения вышеописанного метода, часто с очень положительными результатами.

Дозировки и методики введения 2- хлородезоксиаденозина для лечения пациентов, имеющих заболевания иные, нежели рассеянный склероз, описаны в литературе. (Ernst Beutler (1992), The Lancet, 340: 952-956). Фармакокинетика 2- хлородезоксиаденозина и ее воздействие на уровень содержания моноцитов не зависят от состояния заболевания, подлежащего лечению.

D. Синтез соединений.

Соответствующее соединение по данному изобретению, в котором Z отсутствует, может быть получено конденсированием должным образом замещенного денина непосредственно с помощью должным образом замещенного кольца сахара, как описано в работе Montgomery et al., (1986) J. Med. Chem., 29: 2389-2392, в патенте США 4082911, либо как описано в работах Herdewijn et al. (1987) J. Med. Chem. , 30: 2131- 2137, которые упомянуты в данном описании в качестве ссылок. Должным образом замещенный аденин может быть получен следующими методами синтеза или аналогичным синтезом. Wright et al., (1987) J. Org. Chem. , 35: 4617-4618, недавно получили 2-хлоро- и 2-бромо-2'-дезоксиаденозины путем прямой реакции соответствующего 2,6-дигалопурина с 3',5'- замещенной-альфа-1-хлорорибозой, используя гидрид натрия в ацетонитриле, с последующей обработкой метанольным аммиаком при температуре 60^oC для освобождения от защиты полученных 3',5'- гидроксилов и образования 6-аминогруппы полученного конечного аденозина. Fukukawa et al. , (1983) Chem. Pharm. Bull., 31(5): 1582- 1592, также предлагают синтез 2'-дезокси-2'-арагалозамещенных производных аденозина.

Соединения 2'-дезокси-2'- фторарабинофуранозиладенина настоящего изобретения получают, как описано в примерах ниже. Синтез аналогичен тому, который описан в работе Marques et al., (1987) Biochem. Pharmacol., 36: 2719-2722, упомянутой в качестве ссылки, при котором 6-хлорпурин конденсируют с помощью 3-O-ацетил-5-O-бензоил-2-дезокси-2-фтор-D-арабинофуранозил- бромида. Функционализированный галосахар получают в соответствии с методом, приведенным Reichman et al., (1975) J. Carbohyd. Res., 42: 233, a 2'-дезокси-2'-фторарабинофуранозиладенин получают аммонолизом с концентрированным метаноловым аммиаком, который отщепляет защитные группы. Синтез 2-замещенных-2'-дезокси-2'-фрафтораденозинов также описан в патентах США 4918179 и 5034518, которые приведены в данном описании в качестве ссылки.

Аденозин-1-N-оксидная группа соединений, то есть, в которых Z присутствует, представляет особый интерес, поскольку эти вещества, per se, наиболее вероятно не введены в растущую полинуклеотидную цепь, так как присутствие N-оксидной группы, по-видимому, препятствует водородному связыванию во время этого синтеза. Полагают, что N-оксидные соединения редуцированы эндогенной редуктазой перед их введением и терминацией растущей цепи.

Тем не менее, свободные от результирующего заряда ионов, но обладающие внутренней цвиттерионовой парой зарядов, N-оксидные соединения могут проникать в клеточные мембраны. Эти соединения также в некоторой степени более растворимы в воде, нежели соответствующие неокисленные соединения.

Не придерживаясь какой-либо теории, тем не менее считается, что N-оксидные соединения проникают в клетку и фосфорилируются, и такое фосфорилирование описано в работе Lindberg et al., (1967) J. Biol. Chem., 242: 350-356. Группа таких производных сохраняется внутриклеточно до определенного времени, пока N-оксидная функция не уменьшится и нуклеотид не инкорпорируется с целью терминации подходящей, растущей полинуклеотидной цепи.

1-N-Оксидные соединения легко получить методом Klenow et al., (1961) Biophys. Acta, 52: 386-389, с незначительной модификацией, как описано ниже.

Настоящее изобретение далее иллюстрируется следующими примерами, которые ни коим образом не ограничивают объем предлагаемого изобретения.

Пример 1. Лечение рассеянного склероза с помощью CdA.

Было проведено исследование четырех пациентов с хроническим рассеянным склерозом. Каждого пациента вначале осматривали для определения функций печени, почек и костного мозга с целью установления базисных значений. Затем каждому пациенту вводили CdA, растворенного в стерильном изотоническом солевом растворе, свободном от консерванта. CdA вводили внутривенно с дозировкой 0,1 мг/кг каждый день в течение семи дней. Каждый пациент получил шесть курсов внутривенной терапии, один раз в месяц в течение шести месяцев. Госпитализированных пациентов исследовали ежедневно. В течение этого времени каждый пациент подвергался ежедневной гемограмме и дважды в неделю клинической биохимии крови. Уровни CdA также измеряли в крови и цереброспинальной жидкости.

Неврологическую функцию каждого из этих пациентов измеряли с использованием расширенной шкалы состояния нетрудоспособности Krutzke (EDSS) и шкалы неврологических оценок Soripps (SNRS).

Не было отмечено никаких значительных токсических побочных эффектов. Ни у единого из четырех пациентов не было тошноты, рвоты, кожной сыпи или почечных или печеночных нарушений. У каждого пациента наблюдалась лимфопения (пониженное содержание лимфоцитов в крови) при абсолютном содержании лимфоцитов, супрессированном наполовину до приблизительно 10% более чем за один год.

Уровни содержания моноцитов снижались после каждого курса лечения. Например, у одного пациента моноциты снизились на 40% после первого курса лечения и по существу отсутствовали после каждого из последующих пяти курсов. У другого пациента моноциты по существу отсутствовали после двух проведенных курсов лечения, и их уровень снижался приблизительно на 85, 50, 40 и 73% после проведения других четырех курсов лечения.

В некоторых случаях наблюдалась лейкопения (пониженное содержание лейкоцитов в крови). Также наблюдался умеренный макроцитоз у всех пациентов, который продолжался от шести до восьми месяцев после прекращения лечения. Однако содержание тромбоцитов у всех четырех пациентов оставалось в нормальных пределах. В сущности не отмечалось никакой токсичности у этих четырех пациентов с нормальной функцией печени и почек. Аналогичным образом, побочные эффекты CdA у всех четырех пациентов были незаметными.

Измерение неврологической функции с использованием EDSS и SNRS показало улучшение состояния всех четырех пациентов во время лечения с помощью CdA. Исследования цереброспинальной жидкости (CFR) показали заметное падение уровня содержания лимфоцитов, и что особо следует отметить, это полное исчезновение олигоклональных связей lgG во всех случаях. Не отмечено никакого существенного изменения в общем lgG CFS.

В частности, данные SNRS показали улучшение на 5-50% относительно базисных значений до лечения для всех пациентов. Один из четырех пациентов был совершенно прикован к постели в начале лечения, и этот пациент мог ходить с помощью провожатого к концу лечения. Все пациенты отмечали субъективные ощущения повышенной энергии и жизнеспособности.

Пример 2. Лечение рассеянного склероза с помощью CdA.

Приведенное в примере 1 исследование с привлечением четырех пациентов затем было расширено. Двойной метод слепого исследования с использованием плацебо с привлечением 50 пациентов осуществляли с целью дальнейшей демонстрации эффективности 2-CdA для лечения рассеянного склероза. Дозировки и методики для этого второго исследования были аналогичными или практически такими же как и дозировки и методики, используемые в примере 1. Также использовались две шкалы оценок, то есть, шкала SNRS и шкала EDSS. 28 пациентов обследовали по шкале SNRS и 23 пациента по шкале EDSS. Шкала SNRS в основном более чувствительна, чем шкала EDSS. Последние данные изобретателей показывают, что чрезвычайно значительное улучшение (p=0,0004) наблюдалось у пациентов, леченных 2-CdA, по сравнению с плацебо у 28 пациентов, обследованных на изменения по шкале SNRS (см. таблицу).

Приведенные описания и примеры предназначены для пояснений и не должны рассматриваться как ограничивающие. Другие варианты в пределах сущности и объема настоящего изобретения возможны и станут очевидными для специалиста в данной области.

Формула изобретения

1. Способ лечения пациента, страдающего рассеянным склерозом, при котором пациенту вводят композицию, содержащую терапевтически эффективную дозу замещенного производного аденина или его фармакологически приемлемой соли в качестве активного ингредиента, растворенного или диспергированного в физиологически толерантном носителе, причем указанное замещенное производное аденина или его соль вводят в количестве, достаточном для снижения уровня моноцитов в крови пациента по крайней мере приблизительно на 50%, в течение курса лечения, и имеющего структуру формулы

где Z обозначает O^- или отсутствует;
Y - водород или заместитель, содержащий от 1 до приблизительно 20 атомов, который свободен от результирующего заряда иона при физиологических значениях pH, продуцирует растворимое производное аденина и чье присутствие в адениновой части ингибирует деаминирование указанного производного аденина аденозин-деаминазой;
X обозначает водород или фтор, при условии, что Y - водород только в том случае, когда присутствует Z.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное производное аденина вводят в количестве приблизительно от 0,04 до 0,20 мг на 1 кг массы тела в день.

3. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное производное аденина представляет собой 2-хлор-2'-дезоксиаденозин.

4. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное введение периодически повторяют.

5. Способ по п.1, отличающийся тем, что указанное производное аденина вводят пациенту путем подкожной инъекции.

6. Способ по п.5, отличающийся тем, что указанное производное аденина представляет собой 2-хлор-2'-дезоксиаденозин.

РИСУНКИ

Рисунок 1