Способ получения туберкулина

 

Изобретение относится к получению аллергенов для диагностики туберкулеза крупного рогатого скота. Микобактерии туберкулеза бычьего вида выращивают на синтетической среде. Проводят стерилизацию биомассы при 1 атм в течение 1,5-2 ч до выделения 0,8-0,9 мг/мл туберкулопротеина и аллергенной активности до 70 тысяч Т.Е. в 1 мл. После чего добавляют деминерализованную воду и проводят водно-температурный гидролиз биомассы. Затем отделяют фильтрацией культуральную жидкость. К полученному фильтрату снова добавляют деминерализованную воду до активности препарата 50 тысяч Т.Е. в 1 мл. Выход с 1 л синтетической среды нативного туберкулина составляет до 10 тыс. диагностических доз. Изобретение позволяет максимально сохранить первоначальные свойства аллергена и снизить содержание солевых остатков в продукте, что позволяет обойтись без диализа культурального фильтрата. 2 табл.

Изобретение относится к способам получения аллергенов, в частности к получению туберкулина для аллергической диагностики туберкулеза крупного рогатого скота.

Известен способ получения альттуберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза на мясо-гидролизатно-пептонном-картофельно-глицериновом бульоне, температурное воздействие на биомассу в процессе стерилизации при 1 атмосфере в течение 1 - 3 часов и выпаривание культуральной жидкости при 100^oC в течение 20 - 24 часов до активности 90 тысяч туберкулиновых единиц /Т.Е/ в 1 мл.

Недостатком вышеуказанной технологии является длительное температурное воздействие на биомассу микобактерий туберкулеза в процессе стерилизации и выпаривания, что приводит к высокой концентрации балластных веществ среды, на которой выращивались микробы, в первую очередь пептона и продуктов гидролиза белков мяса в конечном продукте, т.к. очистка туберкулина по технологии не предусмотрена.

За прототип взят способ получения очищенного туберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза бычьего вида на жидкой синтетической среде, стерилизацию при 1 атм в течение 30 мин, отделение фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы, концентрацию вакуумным выпариванием, осаждение и очистку аллергеноактивных веществ дегидратантом-трихлоруксусной кислотой, сернокислым аммонием, диализ и лиофйилизацию. При этом выход конечного продукта с 1 литра синтетической среды составляет 500 - 600 диагностических доз/ А.С. N 431877 "Способ получения очищенного туберкулина", авт. Н.С.Шевырев, А.61 К 23/00, 72 г/.

Недостатком указанного способа получения туберкулина является необходимость выпаривания культуральной жидкости, использование ядовитой трихлоруксусной кислоты и сернокислого аммония, проведение диализа и лиофилизация препарата. При этом выход конечного продукта составляет в среднем 20%. Кроме того, физико-химическое воздействие на культуральную жидкость указанных средств и методов нарушает структуру белка, изменяет конфигурацию аллергенных детерминант, это снижает специфичность аллергена и, как следствие, может служить причиной появления неспецифических реакций на туберкулин у животных, сенсибилизированных атипичными микобактериями. В то же время следует отметить, что попытка очистить белок от полисахаридов, липидов, нуклеиновых кислот с помощью трихлоруксусной кислоты и сернокислого аммония не достигает цели, т.к. очищенный туберкулин РРД-млекопитающих содержит 4 - 7% полисахаридов, 1 - 7% нуклеиновых кислот, 2,4 - 12% липидов/ В.М.Безгин. "Совершенствование промышленной технологии /ППД/ туберкулина и его биохимическая характеристика". Автореф. дис. канд.биол.наук. Москва, 1990. С. 12 - 13, 23, 25/. Чрезмерная очистка туберкулина от полисахаридов, нуклеиновых кислот и особенно липидов приводит к снижению активности препарата. Использование всех известных методов "очистки" туберкулина не повышает их специфичность и диагностическую эффективность.

Для устранения вышеперечисленных недостатков разработан экономически выгодный, технологически простой, экологически безопасный способ получения туберкулина.

Способ включает выращивание микобактерий туберкулеза бычьего вида/бовис/ на синтетической среде, стерилизацию, отделение фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы. Стерилизацию биомассы проводят при 1 атм в течение 1 ч 30 мин - 2 ч обеспечивающую выход 0,8 - 0,9 мг/мл белка при аллергенной активности до 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл, затем добавляют деминерализованную воду в количестве 20 - 25% к исходному объему, проводят гидролиз в режиме 1 атм в течение 1 ч 30 мин - 2 ч до аллергенной активности 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл культуральной жидкости, а после отделения фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы к полученному фильтрату добавляют деминерализованную воду до активности препарата 50 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл. Выход с 1 литра синтетической среды нативного синтетического туберкулина составляет до 10 тысяч диагностических доз.

Следует отметить, что попытки увеличить выход аллергеноактивных веществ за счет увеличения продолжительности времени стерилизации до 2 ч 30 мин - 3 ч, равно как и усиление температурного режима гидролиза биомассы до 1,5 атм, приводило к частичной термоденатурации белков, которые выпадают в осадок.

Таким образом, при обеспечении вышеуказанного режима и последовательности проведения операций в наибольшей степени сохраняются первоначальные свойства аллергена, а содержание солевых остатков среды в конечном продукте снижается с 12 - 13 г/л до 8 - 9 г/л, что позволяет обойтись без диализа культурального фильтрата.

Полученный таким способом нативный синтетический туберкулин сохраняет первоначальные физико-химические и аллергеные свойства в течение 3-х лет при хранении в режиме 5 + 20^oC /срок наблюдения/.

Пример осуществления способа. Для получения нативного синтетического туберкулина использовали биобутыли с объемом культуральной жидкости 1,2 л после двухмесячного выращивания микобактерий туберкулеза бовис, штамм N 8 на жидкой синтетической среде Курской биофабрики. Выращенную культуру микобактерий туберкулеза подвергли стерилизации при 1 атмосфере в течение 2 ч до выделения 0,9 мг/мл белка и аллергенной активности до 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл культуральной жидкости, после чего в культуральную жидкость добавили 25% дименирализованный воды и провели гидролиз биомассы при 1 атм в течение 2 ч до аллергенной активности 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл культуральной жидкости. Затем культуральную жидкость отделили фильтрацией от автоклавированной биомассы микобактерий туберкулеза в стерильную стеклянную бутыль. В полученный культуральный фильтрат добавили необходимое количество деминерализованной воды, с тем чтобы аллергенная активность конечного продукта-туберкулина находилась в пределах требуемой и составляла не менее 50 тыс. туберкулиновых единиц в 1 мл.

При биохимическом исследовании полученного туберкулина установлено, что содержание белка в нем составляет в среднем 0,7 мг/мл, полисахаридов - 0,06 ± 0,01 мг/мл, нуклеиновых кислот - 0,025 ± 0,01 мг/мл, липидов - 0,06 ± 0,01 мг/мл, т.е. он не имел достоверных различий по их количественному содержанию с так называемым очищенным туберкулином. Содержание солевых остатков синтетической среды в полученном туберкулине составляло в среднем 0,9 мг/мл, что было на уровне концентрации хлористого натрия в физиологическом растворе.

Специфические свойства нативного синтетического туберкулина нами были испытаны в экспериментальных опытах на искусственно аллергизированных разными видами микобактерий морских свинках и молодняке крупного рогатого скота и приведены в таблицах N 1 и N 2 (см. в конце описания). В опытах, для сравнения результатов исследований, использовали серийный очищенный туберкулин РРД-млекопитающих Курской биофабрики.

Таким образом, преимущество нативного синтетического туберкулина перед очищенным туберкулином РРД проявилось в том, что в отличие от прототипа, при внутрикожном методе туберкулинизации на моделях гетерологичной аллергизации/ авиум, scrofulaceum, nonchromogenicum/ выявлялось достоверно меньшее количество реагирующих животных, что свидетельствует о повышенной специфичности данного диагностикума.

Формула изобретения

Способ получения туберкулина, включающий выращивание микобактерий туберкулеза бычьего вида на синтетической среде, стерилизацию, отделение фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы, отличающийся тем, что стерилизацию проводят при 1 атм в течение 1 ч 30 мин - 2 ч до выделения 0,8 - 0,9 мг/мл белка и аллергенной активности до 70 тысяч туберкулиновых единиц в 1 мл, затем добавляют деминерализованную воду в количестве 20 - 25% к исходному объему и проводят гидролиз при 1 атм в течение 1 ч 30 мин - 2 ч до аллергенной активности 70 тыс. туберкулиновых единиц в 1 мл культуральной жидкости, а после отделения фильтрацией культуральной жидкости от бактериальной массы к полученному культуральной фильтрату добавляют деминерализованную воду до активности препарата 50 тыс. туберкулиновых единиц в 1 мл.

РИСУНКИ

Рисунок 1