Производные пиридазино [4',5':3,4]пирроло[2,1-а]изохинолина и их физиологически переносимые соли с кислотами и комплексообразователями

 

Производные пиридазино [4',5':3,4]пирроло[2,1-а]-изохинолина общей формулы I, где Х - атом кислорода или серы, группа NHO, R₁ - С_1-10-алкил, возможно замещенный феноксилом или фенилом, которые в свою очередь могут быть одно или двукратно замещены галогеном, алкилом или алкоксилом, R₂, R₃ - алкоксил, и их физиологически переносимые соли с кислотами и комплексообразователями, применимы в качестве кардиозащитных средств, средств для защиты головного мозга. 9 з.п. ф-лы, 2 табл.

Данное изобретение касается новых производных пиридазинопирролоизохинолинов, обладающих биологической активностью, более конкретно производных пиридазино [4',5':3,4]пирроло[2,1-а]изохинолина и их физиологически переносимых солей с кислотами и комплексообразователями.

Из выложенных заявок ФРГ N 3500941 и 3525048 известны действующие кардиотонически 9-амино-пиридазино[4,5:3,4]пирроло- [2,1-а]изохинолины. Из европейской заявки N 252299 известно также, что эти соединения обладают кардио- и нейрозащитным действием и поэтому способствуют кровообращению в ткани и снабжению ткани кислородом в центральной нервной системе.

Задачей изобретения является разработка новых производных пиридазино[4', 5': 3,4]пирроло[2,1-а]изохинолина, обладающих ценными биологическими свойствами.

Поставленная задача решается предлагаемыми производными пиридазино[4', 5':3,4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I где X - атом кислорода или серы, группа NHO, R₁ - алкил с 1 - 10 атомами углерода, возможно замещенный феноксилом или фенилом, которые в свою очередь могут быть одно- или двукратно замещены галогеном, алкилом с 1 - 4 атомами углерода или алкоксилом с 1 - 2 атомами углерода, R₂ и R₃ - алкоксил с 1 - 4 атомами углерода, и их физиологически переносимые соли с кислотами и комплексообразователями, за исключением соединений, у которых X означает атом серы и R₁ - алкил с 1-5 атомами углерода или бензил, а также их физиологически переносимыми солями с кислотами и комплексообразователями.

Новые соединения обладают ценными терапевтически полезными свойствами. Они применимы в качестве кардиозащитных средств, средств для защиты головного мозга (в частности, при лечении пациентов, которые перенесли удар или которым это угрожает), в качестве средств для лечения хронических воспалительных процессов (например бронхиальная астма, артриты). Далее, эти соединения можно применять как средства с антипролиферативным действием и как средство для лечения Colitis Ulcerosa и Morbus Crohn.

В первую группу предпочтительных производных пиридазино[4',5':3,4]пирроло- [2,1-а]изохинолина общей формулы (I) входят соединения, у которых Х - атом кислорода или серы, группа NHO, R₁ - алкил с 1 - 5 атомами углерода, возможно замещенный фенилом, который, в свою очередь, может быть одно- или двукратно замещен галогеном, алкилом с 1 - 4 атомами углерода или алкоксилом с 1 - 2 атомами углерода, R₂ и R₃ - алкоксил с 1-4 атомами углерода, и их физиологически переносимые соли с кислотами и комплексообразователями, за исключением соединений, у которых Х означает атом серы и R₁ - алкил с 1-5 атомами углерода.

Во вторую группу предпочтительных производных пиридазино[4',5':3,4]пирроло-[2,1-а]изохинолина общей формулы (I) входят соединения, у которых Х - атом кислорода или серы, группа NHO,
R₁ - алкил с 1-5 атомами углерода, возможно замещенный фенилом, который, в свою очередь, может быть одно- или двукратно замещен галогеном, алкилом с 1 - 2 атомами углерода или алкоксилом с 1 - 2 атомами углерода,
R₂ и R₃ - алкоксил с 1 - 4 атомами углерода, и их физиологически переносимые соли с кислотами и комплексообразователями, за исключением соединений, у которых Х означает атом серы и R₁ - алкил с 1 - 5 атомами углерода.

В третью группу предпочтительных производных пиридазино[4',5':3,4]пирроло-[2,1-а]изохинолина общей формулы (I) входят соединения, у которых
R₁ означает алкил с 1 - 4 атомами углерода, замещенный одной или двумя незамещенными фенильными группами или одной фенильной группой, замещенной галогеном, алкилом с 1 - 4 атомами углерода или алкоксилом с 1 или 2 атомами углерода.

При этом наиболее предпочтительны соединения, у которых
R₁ означает алкил с 1 - 4 атомами углерода, замещенный фенилом, незамещенным или одно- или двукратно замещенным атомами фтора, хлора или метилом.

В четвертую группу предпочтительных производных пиридазино[4',5':3,4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы (I) входят соединения, у которых
R¹ означает бензил.

В пятую группу предпочтительных производных пиридазино[4',5':3,4]пирроло-[2,1-а]изохинолина общей формулы (I) входят соединения, у которых
R₂ и R₃ означают метоксил.

В шестую группу предпочтительных производных пиридазино[4',5':3,4]пирроло-[2,1-а]изохинолина общей формулы (I) входят соединения, у которых
Х означает атом кислорода или серы или группу NHO, R₁ - 4-метилбензил, a R₂ и R₃ - метоксил.

В седьмую группу предпочтительных производных пиридазино[4',5':3,4]пирроло-[2,1-а]изохинолина общей формулы (I) входят соединения, у которых
Х означает атом кислорода или серы или группу NHO, R₂ и R₃ - метоксил, a R₁ - бензил, 3-хлорбензил или 4-фторбензил.

В восьмую группу предпочтительных производных пиридазино[4',5':3,4]пирроло- [2,1-а]изохинолина общей формулы (I) входят соединения, у которых
Х означает атом серы.

Соединения формулы (I) являются основаниями и могут известным образом переводиться с неорганическими или органическими кислотами, а также с соле- и комплексообразователями в любые физиологически безвредные аддукты (соли).

Для образования солей пригодны, например, такие кислоты, как соляная кислота, бромистоводородная кислота, иодистоводородная кислота, фтористоводородная кислота, серная кислота, фосфорная кислота, азотная кислота, уксусная кислота, пропионовая кислота, масляная кислота, капроновая кислота, валериановая кислота, щавелевая кислота, малоновая кислота, янтарная кислота, малеиновая кислота, фумаровая кислота, молочная кислота, винная кислота, лимонная кислота, яблочная кислота, бензойная кислота, пара-гидрокси-бензойная кислота, фталевая кислота, коричная кислота, салициловая кислота, аскорбиновая кислота, метансульфокислота и тому подобные кислоты.

Новые соединения можно получать известными способами.

Новые соединения формулы (I), в которой Х означает группу NHO, можно получать путем взаимодействия соединения обшей формулы (II)

с соединением общей формулы III
H₂N-OR₁, (III)
где R₁ имеет вышеприведенные значения.

При этом исходное соединение общей формулы II растворено в высококипящем инертном растворителе, например, диметилформамиде, диметилацетамиде, хлорбензоле или трисамиде гексаметилфосфорной кислоты и нагревается с аминным компонентом общей формулы (III) с обратным холодильником до завершения реакции. Время реакции при этом составляет от около 1 до 15 часов и зависит от применяемых исходных веществ.

В случае реакционноспособных гидроксиламинов можно также в качестве растворителя применять спирты или тетрагидрофуран; в некоторых случаях может быть полезным вести реакцию в автоклаве.

Если исходные гидроксиламины представляют собой жидкости и имеют достаточно высокую температуру кипения, реакцию можно вести в избыточном количестве амина без добавления растворителя (например, в случае орта-бензил-гидроксиламина), при необходимости, в атмосфере азота.

В некоторых случаях можно также применять реагент, который при взаимодействии служит также и растворителем.

Целевой продукт общей формулы (I), в которой Х означает атом серы или кислорода, можно получать взаимодействием соединения общей формулы IV

где Z означает атом кислорода или серы, с алкилирующим агентом формулы V
R₁ - Y, (V)
где R₁ имеет вышеуказанные значения и Y означает анионную отщепляемую группу, например, хлор, бром, йод, группу метансульфокислоты, остаток трифторметансульфокислоты, пара-толуолсульфокислоты, пара-нитробензолсульфокислоты или пара-бромбензолсульфокислоты. В качестве алкилирующего средства можно также применять и другие реагенты, пригодны при этом переносчики карбо-катиона, например, "ониевые" соединения, такие как соли Меервайна, например триэтилоксоний-тетрафторборат, -фосфат или - гексахлорантимонат.

При этом исходное соединение общей формулы (IV) взаимодействует в инертном растворителе, например, диметилацетамиде, трисамиде гексаметилфосфорной кислоты, хлорбензоле или ацетоне с алкилирующим средством общей формулы (V). Взаимодействие обычно осуществляют при комнатной температуре, в некоторых случаях и при температуре обратного потока, в каждом случае в зависимости от реакционной способности алкилирующего средства. Время реакции составляет при этом от около 1 до 20 часов и зависит от применяемых исходных веществ.

Получение соединений согласно изобретению поясняется следующими примерами.

Пример 1
Гидрохлорид 5,6-дигидро-2,3-диметокси-9-(орто-бензил)- гидроксиламино-пиридазино [4,5',:3,4]-пирроло [2,1-а]-изохинолина.

3 г S-метил-соединения, 5 г гидрохлорида орта-бензил-гидроксиламина и 50 мл толуола нагревали с обратным потоком в течение около 5 часов. По окончании взаимодействия (контролируемого методов ДК) смесь охлаждали и продукт отжимали на фильтре.

2 м-ал промывали толуолом и разделяли между дихлорэтаном и разбавленной натриевой щелочью. Органическую фазу несколько раз промывали водой, высушивали над сульфатом натрия и выпаривали. Остаток, при необходимости после очистки на колонке с силикагелем (элюент - смесь дихлорэтана с метанолом = 100+10 вес. частей), поглощали малым количеством дихлорэтана и при добавлении этанольной соляной кислоты переводили в гидрохлорид.

Выход 2,86 г (71,5% от теории).

Т.пл.: 235^oС.

Пример 2
5,6-дигидро-2,3-диметокси-Э-(4-бромбензил)-меркалто-пиридазино-[4', 5',: 3,4]-пирроло [2,1 -а]-изохинолин
1,28 г 5,6-дигидро-2,З-диметоксипиридазино-[4',5',3,4]- пирроло-[2,1-a] -изохинолин-9-(10Н)-тиона суспендировали в 30 мл диметилацетамида и затем при перемешивании при комнатной температуре в него добавляли 3,50 г 4-бромбензилбромида. Через около 20 минут образовался прозрачный оранжево-красный раствор, из которого после дальнейшего перемешивания при комнатной температуре выпадали кристаллы оранжевого цвета. После выдерживания в покое при комнатной температуре в течение 16 часов кристаллы отжимали на фильтре и растворяли в смеси метиленхлорида и метанола (100 + 20). Промывали сначала разбавленной натриевой щелочью, затем водой, высушивали над не содержащим воду сульфатом натрия и концентрировали. Остаток кристаллизовали из смеси дихлорэтана и метанола (100 + 20).

Выход 5,5 г (89,3% от теории).

Т.пл.: 210^oC.

Пример 3
5,6-дигидро-2,3,9-триметоксипиридазино-[4', 5', : 3,4]- пирроло[2,1-а]-изохинолин
В суспензии, содержащей 6,3 г 5,6-дигидро-2,3-диметокси-пиридазино-[4', 5': 3,4]-пирроло-[2,:1-а]-изохинолина и 50 мл диметилацетамида, осуществляли взаимодействие при комнатной температуре с 5 мл свежеперегнанного метилиодида. Через около 1 часа образовался прозрачный, из которого после дальнейшего перемешивания при температуре 50^oC, выпадали кристаллы отличного желтого цвета, которые отжимали на фильтре и растворяли в смеси метиленхлорида и метанола (100 + 20). Промывали сначала разбавленной натриевой щелочью, затем водой. Органическую фазу высушивали над не содержащим воду сульфатом натрия и концентрировали. Остаток растворяли в смеси дихлорэтана и метанола (100 + 20) и при добавлении этилового эфира кристаллизовали.

Выход 4,7 г (75,6% от теории).

Т.пл.: > 270^oC.

Аналогично примеру 2 получают сведенные в таблице 1 соединения (см. в конце описания).

2 Соединения согласно изобретению успешно применимы для лечения болезней головного мозга, связанных с перерождением и омертвением тканей. Равным образом возможна профилактика таких заболеваний для пациентов, для которых возможна опасность таких заболеваний. Это действие соединений основано не на улучшении кровоснабжения тканей. Таким образом, соединения применимы для лечения нового типа эпилепсии и болезни Альцгеймера, и особенно для лечения пациентов, которые перенесли удар или для которых возможна опасность такого удара. Соединения могут также применяться для получения средств лечения хронических воспалительных процессов, Colitis Ulcerosa и Morbus Crohn, а также средств с антипролиферативным действием. Действие соединений можно объяснить их подавлением неселективных каналов катионов (НКК).

В основе патофизиологии хронической бронхиальной астмы лежат процессы воспаления, которые способствуют активированию воспалительных клеток (Барнес, 1987 г.; Зайферт и Шультц, 1991 г.).

Регулируемое рецептором активирование воспалительных клеток (таких, как нейтрофильные гранулоциты и тучные клетки или соотв. их стойкие линии клеток HL-60 или сенсибилизированные, т.е. содержащие гаммаглобулин Е клетки RBL) не зависимо от вида стимулирующего агониста (такого, как эндотелии, ФАТ, лейкотриены, хемотактический пептид fMLP или антиген для сенсибилизированной тучной клетки) ингибируется блокатором неселективных каналов катионов (НКК) (Ринк, 1990 г.). Через эти каналы внеклеточный кальций поступает в клетки, что необходимо для персистенции происходящего при участии рецептора активирования клеток (Путин, 1990 г.). Если это поступление кальция прерывается, получается блокада активирования воспалительных клеток.

Классические антагонисты кальция типа дигидропиридина или соотв. фенилалкиламина не ингибируют ни НКК, ни процессы воспаления (Уеллс и др., 1986 г.). Для оценки активирования клеток или соотв. для оценки его ингибирования НКК- блокатором обсчитывается флюорометрически кинетика цитоплазменной концентрации кальция в содержащих Fura-2 клетках по методике, описанной Гринкевичем и др. (1985 г.). В рамках данного изобретения эта методика оказалась подходящим методом скриннинга для распознавания НКК-блокаторов.

Для специфической характеристики блокаторов неселективных каналов кальция подходит так называемое ингибирование "Талсигаргином". Тапсигаргин является описанным Таструпом и др. (Prос. Natl. Acad Sci. (USA), 87, 2466-2470, 1990) промотором опухолей, который селективно и необратимо подавляет чувствительный к IP₃ Ca²⁺-накопитель внутриклеточной аденозинтрифосфатазы Ca²⁺. Вследствие этого происходит быстрое опустошение Ca²⁺-накопителя. Как описано Путин ("Calcium", 11, 611-624, 1990), опустошение этого накопителя представляет собой физиологическое раздражение для отверстия неселективного канала катионов в мембране клетки. Следствием этого является массивный поток в клетку ионов натрия и кальция. На основании этих свойств Тапсигаргин является подходящим в качестве косвенного стимулятора для независимого от агонистов и от IР₃ отверстия неселективного канала катионов.

В рамках данного изобретения стимуляция Талсигаргином неселективных каналов катионов в клетках HL-60 (клетки лейкемии человека), в гиппокампальных и кортикальных клетках нейронов, а также в клетках RBL (клетки rat basophilic lymphoma) осуществляется успешно, что доказывает существование этих каналов в каждой линии клеток.

Цитоплазматическая концентрация Ca²⁺ ([Ca²⁺]_i) играет важную роль при профилерации клетки и при росте опухоли (см. обзор Л.Р.Зачарского и др. в "Медицинском журнале", т. 19, стр. 145-177, 1988 г. 1. В частности, поток Ca²⁺, стимулируемый активированием рецептором при последующем посредничестве инозитолтрифосфата-(IP₃-), в клетку должен иметь решающее значение при онкогенной пролиферации клетки (У.Киккава и И. Нишизука, Ann. Cell. Biol., 2, 149-178, 1986). Этот механизм также играет роль при образовании метастаз и при "полиустойчивости к лекарствам" (см. указанный выше обзор Л.Р.Зачарского).

Эта гипотеза подтверждается тем, что Тапсигаргин в качестве косвенного стимулятора неселективных каналов катионов (НКК) приводит к сверхнакоплению Ca²⁺ в клетке, а также является высокоактивным промотором опухоли (В.Таструп и др. "Proceedings of the Natl. Acad. Sci. (USA), 87, 2466-2470, 1990). Блокада потока Ca²⁺ через НКК приводит к нормализации внутриклеточной концентрации ионов Ca и тем самым к подавлению роста опухоли и т.д.

Классические антагонисты кальция не подавляют эти НКК. Неожиданно было установлено, что заявляемые согласно изобретению соединения подавляют поток кальция в клетку через НКК.

Как показали С.Х.Мерч и др. (Lancet, 339, 381-385, 15 февраля 1992 г.), эндотелии 1 играет важную патофизиологическую роль при воспалительных заболеваниях кишечника, таких как Colitis ulcerosa и Morbus Crohn. С помощью иммуногистохимических методов можно установить, что пациенты, страдающие М. Crohn в области Submucosa, и пациенты, страдающие Colitis ulcerosa в области Lamina propria эпителия толстой кишки, имеют существенные и сильно повышенные концентрации эндотелина 1 по сравнению с нормальными людьми. Предполагается, что локальное извержение эндотелина вызывает массивный вазоспазм с последующей диссеминированной ишемией с микроинфарктом, что считается собственно причиной указанных болезней. Вазоспазмогенная эффективность эндотелина объясняется перегрузкой Ca²⁺ вазкулярных миоцитов. При этом эндотелии разрешает прежде всего внутриклеточное выделение Ca²⁺ при посредничестве IP₃, к которому присоединяется массивный трансмембранный поток Ca²⁺ через интенсифицируемые дигидропиридином каналы (М. С. Симонсон и др. Clin. Invest. Med. , 14, 499-507, 1991; J. Cardiovasc. Pharmacol., 13, Suppi. 5, S1-S4, 1989; J. Pharmacol., 100, 383-392, 1990). В случае этих каналов речь идет о неселективных каналах катионов, существование которых и в клетках слизистой оболочки толстой кишки недавно было описано (Хр. Симер и Г. Гегеляйн, Europ. J. Physiol., 420, 319-328, 1992).

В качестве пригодной модели скриннинга для распознавания функциональных антагонистов эндотелина оказалось стимулируемое эндотелином активированние клеток лейкемии человека (клетки HL-60), содержащие Fura-2. Согласно заметке Дж. Гринкевича и др. (J. Biol. Chem., 260, 3440-3450, 1985) можно наблюдать внутриклеточную концентрацию Ca²⁺ в цитоплазме клеток HL-60 (суспензии) и измерять ее для оценки активирования клетки эндотелином. Стимуляция осуществляется добавлением 0,1 мм эндотелина, ее можно ингибировать в зависимости от дозы соединениями согласно данному изобретению.

Функциональному антагонизму к эндотелину соединений согласно изобретению способствует блокада неселективных каналов катионов. Поэтому полезно также доказательство функционального антагонизма к Талсигаргину в клетках RBL-hm1 как метод скриннинга для функциональных антагонистов эндотелина.

Методика испытаний:
Для целей скриннинга в несодержащей Ca²⁺ инкубационной среде стимулируют с применением 0,1 мМ Тапсигаргина прилипшие, содержащие Fura-2 клетки RBL-hml. Через четыре минуты восстанавливают внеклеточный Ca²⁺ до 1,5 мМ и с помощью флюоресценции Fura-2 регистрируют избыточный подъем цитоплазменной концентрации Ca²⁺ вследствие массивного трансмембранного потока Ca²⁺ через неселективные каналы катионов. Этот поток затем следует дозированно ингибировать блокатором неселективных каналов катионов. Ни классические антагонисты кальция, ни специфические блокаторы антагонистов, которые можно стимулировать обменом IP₃, не подавляют разрешенный косвенно Талсигаргином трансмембранный поток Ca²⁺. Соединения согласно данному изобретению отличаются тем, что они ингибируют НКК. Флюорометрическое измерение кальция в цитоплазме отдельных прилипших клеток RBL-hml осуществляется аналогично описанному Куда и Огура (1986 г.) методу для нейронных клеток. Применяют флюоресцентный микроскоп Axiovert 35 фирмы Пейсе в сочетании с прибором Imaging-System фирмы Хамамацу, состоящий из обрабатывающей изображение системы ICMS, остаточной камеры с контрольным узлом и усилителем изображения DVS3000.

Кинетику цитоплазменной концентрации Ca²⁺ записывают последовательно в виде кривой концентрация-время после активирования клеток Талсигаргином (0,1 мкМ).

Сравнивают кривые двух активированных культур клеток - в присутствии и в отсутствии 10 мкМ тестируемого соединения. Площадь под этими кривыми ("площадь под кривой" = ППК) интегрируется и является мерой активирования клеток. Интенсивность ингибирующего действия тестируемых блокаторов НКК оценивается по следующему отношению

где %Н = ингибирование в процентах потока кальция через неселективные каналы катионов, которые стимулированы и ингибированы 10 мкМ тестируемого вещества.

ППК_инг = площадь под кривой, записанной в присутствии стимулятора плюс 10 мкМ ингибирующего тестируемого вещества.

ППК_контр = площадь под кривой, записанная только с применением стимулятора. Литература к вышеприведенным пояснениям:
BARNES P. J. , I.W. RODGER und N.C. THOMSON Pathogenesis of asthma, in "ASTHMA, basic mechanisms and clinical management" ED by P.J. BARNES; ACADEMIC PRESS, LONDON, 1988.

GRYNKIEWICZ G., M. POENIE und R.Y. TSIEN A new generation of Ca²⁺-indicators with greatly improved fluorescence properties J. BIOL. CHEW. 260: 3440-3450, 1985.

HIDE, M. und M. A. BEAVEN Calcium influx in a rat mast cell (RBL-2H3) line J. BIOL CHEW. 266 15221-15229, 1991.

KUDO, Y. und A. OGURA Glutamate-induced increase in intracellular Ca²⁺-concentration in isolated hippocampal neurones BR. J, PHARMACOL 89: 191-198, 1986.

PUTNEY, J. W. , jr. Capacitative Calcium entry revised CELL CALCIUM II: 611 -624, 1990.

RINK, T. J. Receptor-mediated calcium entry FEBS LETT. 268: 381- 385, 1990.

SEIPERT, R. und G. SCHULTZ The superoxide forming NADPH oxidase of phagocytes: An enzyme system regulated by multiple mechanism REV. PHYSIOL. BIOCHEM. PHARMACOL, Vol. 117, SPRINGER VERL, 1991.

WELLS, E. , C.G. JACKSON, S.T. HARPER, J. MANN and R.P. EAOY Characterization of primate bronchoalveolar mast cells II, inhibition of histamine, LTC₄ and PGF_2a release from primate bronchoalveolar mast cells and a comparison with rat peritoneal mast cells
J. IMMUNOL 137: 3941-3945, 1986.

Результаты измерений:
Приводится выраженное в процентах ингибирование НКК после стимуляции Тапсигаргином (0,1 мкМ Талсигаргина) в клетках RBL-hm1. Концентрация испытуемых веществ 10^-5 моль, предпочтительно 10^-6 моль.

Результаты опыта сведены в таблице 2 (см. в конце описания).

Функциональную антивосполительную активность можно показать при следующих испытаниях.

Применяют отдельные прилипшие к стеклянной пластинке RBL-2H3 (линия клеток опухоли тучных клеток).

Культивирование и прилипание клеток RBL-2H3 осуществляют по методу, описанному Халде и Бивеном (1991 г.). Для сенсибилизирования налипших клеток RBL-2H3 их инкубируют в течение двух часов при комнатной температуре с разбавленным 1:2000 имеющимся в продаже раствором гаммаглобулина Е против комплекса динитрофенолальбумин бычьей сыворотки (ЛИФ-ЛЕС-антиген). Затем клетки промывают. Добавлением 0,1 мл раствора ЛИФ-ЛЕС (10 мкг/мл) осуществляют массивное иммунологическое активирование клеток, которому способствует цитоплазменное избыточное содержание Ca²⁺. Флюорометрическое измерение кальция в цитоплазме отдельных прилипших клеток RBL-2H3 осуществляют аналогично описанному Куда и Огура (1986 г.) методу для нейронных клеток.

Веществом для сравнения служит в этих испытаниях хромоглюкат (10 мкМ), который вызывает около 50%-ное ингибирование индуцированного антигеном активирования клеток.

В этом тесте указанные выше соединения демонстрируют величину % Н, которая сравнима с вышеприведенными величинами.

При исследованиях микрокультур различных линий клеток опухолей человека с помощью анализа тетразолием для установления антипролиферативного эффекта соединений согласно изобретению неожиданно оказалось, что испытуемое соединение оказывает в 5-10 раз более сильное действие, чем вещество для сравнения Верапамил.

Антипролиферативная эффективность испытуемых веществ определялась по описанному Мосманном (J. Immunol. Meth., 65, 55-63, 1983), Денизотом и др. (Int. J. Immunol. Meth., 89, 271-277, 1986) и Дж.Элиасоном и др. (Int. J. Cancer, 46, 113-117, 1990) МТТ-тесту. (MTT = [3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-тетразолий-бромид] фирмы Chemicon Inc. El Segundo, Ca, USA). Этот индикатор метаболизируется только в случае живых клеток с интактными митохондриями до голубого фармазон-продукта. В данном тесте применяли следующие линии клеток опухолей человека: A 549 (аленокардинома легких), A 431 (эпидермискардинома вульвы), PC 3 (аленокардинома простаты), SK BR 3 (аленокардинома молочной железы), НТ 29 (СХ1) (аденокардинома толстой кишки) и К 562 (клетки хронически-миеломной лейкемии).

Тест осуществляли на микротитрованной пластинке. Каждая ячейка содержала 100 мкл суспензии клеток (0,2 х 106 клеток/мл). Средой инкубации служила RPMI 1640 с 10% активируемой нагреванием фетальной сыворотки теленка и 50 мкг/мл гентамицина. Суспензии клеток инкубировали в течение 0, 24, 48 или 72 часов при 100%-ной влажности воздуха в смеси двуокись углерода (5%) и воздуха при температуре 37^oC в присутствии или в отсутствие тестируемых антипролиферативных веществ в различной концентрации. Тестируемые вещества были растворены в ДМСО (конечное разбавление: 0,1%). Затем добавляли 10 мкл раствора MTT (3 мг/мл) и через три часа 100 мкл 0,08 н. раствора соляной кислоты в изопропаноле. Еще через час измеряли поглощение света с длиной волны 570 нм (длина волны сравнения 630 нм) на устройстве считывания микроплатт. Поглощение света прямо пропорционально количеству живых клеток.

Полумаксимальная концентрация ингибирования испытуемых веществ составила 1 мкг/мл.

Вазоспазмолитическая эффективность описанных выше функциональных антагонистов эндотелина или соотв. Тапсигаргина была подтверждена на выделенном препарированном сосуде: на катаболически перфундирующих, спонтанно бьющихся по Лангендорфу сердцах из крыс измеряли коронарную перфузию посредством электромагнитного измерителя тока (аппаратура фирмы Hugo Sachs Elektronik, March). При таких измерениях можно было регистрировать масштаб, продолжительность и форму протекания спазм сосудов с большой достоверностью. Когда перфундировали с эндотелином при концентрации 100 нМ, коронарный перфузионный ток снижался от 11 до 5 мл/мин. Сокращение перфузии можно было поднять соединениями согласно изобретению. Сила действия веществ согласно изобретению ингибирования Тапсигаргина в клетках RBL-hm1, содержащих Fura-2, или соотв. эффективность ингибирования эндотелина в клетках HL-60, содержащих Fura-2, отчетливо коррелировала с вазоспазмолитической эффективностью испытуемых веществ, доказанной на препаратах Лангендорфа. Из этого можно заключить, что вазоспазмолитический антагонизм к эндотелину испытуемых веществ обусловлен блокадой неселективных каналов катионов.

Соединения согласно изобретению можно принимать как энтерально, так и парентерально. Для орального приема предлагаются дозы от 0,1 до 500 мг активного вещества на одну дозу, для внутривенного введения предлагается от 0,05 до 150 мг на одну дозу. Требуемая терапевтическая доза зависит от показания и от формы применения и может быть установлена экспериментально.

Подходящими формами применения являются, например таблетки, капсулы, капли, растворы, соки, эмульсии, аэрозоли или диспергируемые порошки. Соответствующие таблетки можно получать, например, смешением одного или нескольких активных веществ с известными вспомогательными веществами, например, инертными разбавителями, такими как карбонат кальция фосфат кальция или молочный сахар, разрыхлителями, такими как кукурузный крахмал или альгиновая кислота, связующими, такими как крахмал или желатин, смазками, такими как стеарат магния или тальк, и/или средствами для достижения эффекта депо, такими как карбоксиполиметилен, карбоксиметилцеллюлоза, ацетатфталат целлюлозы или поливинилацетат. Таблетки могут также состоять из нескольких слоев.

Соответственно, можно получать драже путем нанесения на ядра, полученные аналогично получению таблеток, веществ, обычно применяемых для оболочек драже, например, коллидон или шеллак, гуммиарабик, тальк, двуокись титана или сахар. Для достижения эффекта депо или для предотвращения несовместимости ядро может состоять из нескольких слоев. Аналогично, и оболочка драже может для достижения эффекта депо состоять из нескольких слоев, причем можно применять указанные выше для таблеток вспомогательные вещества.

Соки, содержащие вещества согласно изобретению или соотв. сочетание таких веществ, могут еще дополнительно содержать подслащивающие средства, такие как сахарин, цикламат, глицерин или сахар, а также улучшающие вкус средства, например, ароматизаторы, такие как ванилин или апельсиновый экстракт. Они могут, кроме того, содержать суспендирующие вспомогательные средства или загустители, такие как карбоксиметилцеллюлоза натрия, смачиватели, например, продукт конденсации жирных спиртов с этиленоксидом, или защитные вещества, такие как пара-гидроксибензоат.

Растворы для инъекций получают обычным образом, например, при добавлении консервантов, таких как пара-гидроксибензоаты, или стабилизаторов, таких как соли щелочных металлов этилендиаминтетрауксусной кислоты, и разливают по пузырькам для инъекций или ампулам.

Содержащие одно или несколько активных веществ капсулы можно получать, например, тем, что активное вещество смешивают с инертным носителем и инкапсулируют в капсулы из желатина.

Годные для употребления капли получают, например, путем смешивания активного вещества с предусмотренным носителем, таким как нейтральные жиры или полиэтиленгликоль или соотв. их производные.

Формула изобретения

1. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I

где X - атом кислорода или серы, группа NHO;
R₁ - алкил с 1 - 10 атомами углерода, возможно замещенный феноксилом или фенилом, которые, в свою очередь, могут быть одно- или двукратно замещены галогеном, алкилом с 1 - 4 атомами углерода или алкоксилом с 1 - 2 атомами углерода;
R₂ и R₃ - алкоксил с 1 - 4 атомами углерода,
и их физиологически переносимые соли с кислотами и комплексообразователями, за исключением соединений, у которых X означает атом серы и R₁ - алкил с 1 - 5 атомами углерода или бензил.

2. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по п.1, где X - атом кислорода или серы, группа NHO, R₁ - алкил с 1 - 5 атомами углерода, возможно замещенный фенилом, который, в свою очередь, может быть одно- или двукратно замещен галогеном, алкилом с 1 - 4 атомами углерода или алкоксилом с 1 - 2 атомами углерода, R₂ и R₃ - алкоксил с 1 - 4 атомами углерода, и их физиологически переносимые соли с кислотами и комплексообразователями, за исключением соединений, у которых X означает атом серы и R₁ - алкил с 1 - 5 атомами углерода или бензил.

3. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по п.1, где X - атом кислорода или серы, группа NHO, R₁ - алкил с 1 - 5 атомами углерода, возможно замещенный фенилом, который, в свою очередь, может быть одно- или двукратно замещен галогеном, алкилом с 1 - 2 атомами углерода или алкоксилом с 1 - 2 атомами углерода, R₂ и R₃ - алкоксил с 1 - 4 атомами углерода, и их физиологически переносимые соли с кислотами и комплексообразователями, за исключением соединений, у которых X означает атом серы и R₁ - алкил с 1 - 5 атомами углерода или бензил.

4. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по пп.1, 2 или 3, где R₁ означает алкил с 1 - 4 атомами углерода, замещенный одной или двумя незамещенными фенильными группами или одной фенильной группой, замещенной галогеном, алкилом с 1 - 4 атомами углерода или алкоксилом с 1 или 2 атомами углерода.

5. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по п.4, где R₁ означает алкил с 1 - 4 атомами углерода, замещенный фенилом, незамещенным или одно- или двукратно замещенным атомом фтора, хлора или метилом.

6. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по пп.1, 2 или 3, где R₁ означает бензил.

7. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по п.6, где R₁ и R₃ означает метоксил.

8. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по п.1 или 2, где X означает атом кислорода или серы или группу NHO, R₁ - 4-метилбензил, а R₂ и R₃ - метоксил.

9. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по п.1 или 2, где X означает атом кислорода или серы или группу NHO, R₂ и R₃ - метоксил, а R₁ - бензил, 3-хлорбензил или 4-фторбензил.

10. Производные пиридазино [4', 5':3, 4]пирроло[2,1-а]изохинолина общей формулы I по пп.1 - 9, где X означает атом серы.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2