Способ получения средства, обладающего гипогликемической активностью

 

Изобретение относится к фармации. Побеги черники обыкновенной, траву горца птичьего, корневища и корни девясила высокого, листья крапивы двудомной, кору ивы козьей экстрагируют 40 - 45% этиловым спиртом в соотношении сырье - экстрагент 1 : (12 - 14). Процесс повторяют трижды при 55 - 65 ^oC. Время экстракции при первом и втором контактах фаз 60 мин, при третьем контакте фаз 30 мин. Изобретение позволяет повысить активность средства. 13 табл.

Изобретение относится к области фармации и касается способа получения средства из растительного сырья, обладающего гипогликемической активностью.

Поиск и разработка новых лекарственных средств, предназначенных для лечения и профилактики сахарного диабета, обусловлены широким распространением, особой тяжестью течения и наличием ряда вариантов в патогенезе данного заболевания. В настоящее время доказана эффективность применения лекарственных препаратов из растительного сырья для лечения некоторых форм сахарного диабета, при этом фитопрепараты не оказывают побочного действия и безвредны при длительном применении.

Известен способ получения отвара из официнального сбора "Арфазетин", применяемого как гипогликемическое средство. Для приготовления отвара сбор заливают водой в соотношении 1:10, настаивают на кипящей водяной бане при частом перемешивании в течение 30 мин, охлаждают при комнатной температуре 10 мин, процеживают (отжимая растительное сырье) и прибавляют воду до требуемого объема извлечения [4].

Недостатком данного способа является менее выраженная гипогликемическая активность получаемого средства по сравнению со средством, получаемым по заявляемому способу.

Целью изобретения является повышение гипогликемической активности средства за счет более высокого содержания действующих веществ (сумма флавоноидов).

Для достижения указанной цели растительный материал (сырье) - побеги черники обыкновенной - 30%, траву горца птичьего - 20%, корневища и корни девясила высокого - 20%, листья крапивы двудомной -20% и кору ивы козьей - 10% экстрагируют 40-45% этиловым спиртом в соотношении сырье-экстрагент, равном 1: (12-14) (с учетом коэффициента водопоглощения), при температуре 55-65^oC и постоянном перемешивании. Процесс повторяют трижды. Время экстракции при 1-ом и 2-ом контактах фаз - 60 мин, при 3-ем контакте фаз - 30 мин. Извлечения фильтруют через серошинельное сукно, объединяют, упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Выход готового продукта составляет 20.9 ± 0.5% от массы растительного сырья.

Предложенный способ позволяет получить конечный продукт, представляющий собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом, с содержанием влаги - не более 5%.

Способ иллюстрируется нижеследующими примерами.

Пример 1.

300 г побегов черники обыкновенной, 200 г корневищ и корней девясила высокого, 100 г коры ивы козьей измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 3 мм (сито N 30 ГОСТ 214-83), 200 г травы горца птичьего и 200 г листьев крапивы двудомной измельчают до размера частиц диаметром 5 мм (сито N 50 ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 12 л 40% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент, равном 1: 12 с учетом коэффициента водопоглющения сырья. Экстрагируют при температуре 60^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор 40% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения, 1-ый слив - 9.85 л, 2-ой слив - 10.05 л, 3-ий слив - 9.87 л.

Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 208.3 г готового продукта, что составляет 20.83% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 4.05%.

Гипогликемическую активность полученного продукта определяли при аллоксановом диабете у крыс [1, 2]. Опыты проводили на 36 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 280-300 г. Экспериментальный диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением аллоксана в дозе 55 мг/кг массы. Испытуемый экстракт вводили внутрижелудочно, в оптимальной условно-терапевтической дозе 300 мг/кг, превентивно в течение 5 дней и далее до конца эксперимента. В качестве препарата сравнения использовали отвар официнального сбора "Арфазетин", приготовленного в соотношении 1:10 [4]. Препарат сравнения вводили в объеме 10 мл/кг по схеме, аналогичной схеме введения испытуемого экстракта. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в соответствующем объеме. Определение содержания глюкозы в крови лабораторных животных проводили через 3 суток после введения аллоксана. Из полученных данных, представленных в таблице 1, следует, что испытуемый экстракт обладает выраженной гипогликемической активностью, снижая содержание глюкозы в крови крыс на 34.7% по сравнению с показателями животных контрольной группы, при этом аналогичное снижение для препарата сравнения составило 22.4%.

Во второй серии экспериментов исследовали гипогликемическую активность полученного продукта при дитизоновом диабете у кроликов. Опыты проведены на 8 кроликах-самках с исходной массой 2.9 ± 0.5 кг.

Экспериментальный диабет вызывали однократным внутрибрюшинным введением дитизона в дозе 30 мг/кг [7]. Испытуемый экстракт вводили внутрижелудочно в оптимальной условно-терапевтической дозе 300 мг/кг, превентивно в течение 5 дней и далее до конца эксперимента. В качестве препарата сравнения использовали вышеописанный отвар сбора "Арфазетин", который вводили в объеме 10 мл/кг по схеме, аналогичной схеме введения испытуемого экстракта. Животные контрольной группы получали дистиллированную воду в соответствующем объеме. Определение содержания глюкозы в крови лабораторных животных проводили через 24 ч после введения дитизона. Данные представлены в таблице 2.

Из полученных данных следует, что испытуемый экстракт обладает выраженной гипогликемической активностью, снижая содержание глюкозы в крови кроликов на 72.8% по сравнению с показателями животных контрольной группы, при этом аналогичное снижение для препарата сравнения составило 42.2%.

Пример 2.

300 г побегов черники обыкновенной, 200 г корневищ и корней девясила высокого, 100 г коры ивы козьей измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 3 мм (сито N 30, ГОСТ 214-83), 200 г травы горца птичьего и 200 г листьев крапивы двудомной измельчают до размера частиц диаметром 5 мм (сито 50, ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 13 л 43% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент, равном 1:13 с учетом коэффициента водопоглощения сырья. Экстрагируют при температуре 65^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор 43% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения, 1-ый слив - 10.67 л, 2-ой слив - 10.93 л, 3-ий слив - 11.12 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 204.6 г готового продукта, что составляет 20.46% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 3.92%.

Гипогликемическую активность полученного продукта определяли при аллоксановом диабете у крыс. Опыты проводили на 36 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 280-300 г. Описание схемы эксперимента изложено в примере 1. Из полученных данных, представленных в таблице 3, следует, что испытуемый экстракт обладает выраженной гипогликемической активностью, снижая содержание глюкозы в крови крыс на 35.5% по сравнению с показателями животных контрольной группы, при этом аналогичное снижение для препарата сравнения составило 24.3%.

В последующем исследовали гипогликемическую активность полученного продукта на фоне дитизонового диабета у кроликов. Опыты проведены на 8 кроликах-самках с исходной массой 2.9±0.5 кг. Описание схемы эксперимента изложено в примере 1. Данные представлены в таблице 4. Из полученных данных следует, что испытуемый экстракт обладает выраженной гипогликемической активностью, снижая содержание глюкозы в крови кроликов на 72.8% по сравнению с показателями животных контрольной группы, при этом аналогичное снижение для препарата сравнения составило 46.3%.

Исследовали острую токсичность полученного продукта по общепринятому методу Кербера [8]. Опыты проведены на 42 белых беспородных крысах обоего пола с исходной массой 150-160 г. Испытуемый экстракт вводили однократно внутрибрюшинно в дозах 1500-5000 мг/кг. Наблюдения за животными проводили в течение 14 суток. Проведенные исследования показали, что LD₅₀ испытуемого экстракта при внутрибрюшинном введении составляет 2800 мг/кг. При внутрижелудочном введении экстракта не отмечали гибели животных в течение всего срока наблюдения, что позволяет классифицировать испытуемое средство как малотоксичное вещество по классификации Сидорова [61.

Пример 3.

300 г побегов черники обыкновенной, 200 г корневищ и корней девясила высокого, 100 г коры ивы козьей измельчают на мельнице до размера частиц диаметром 3 мм (сито N 30, ГОСТ 214-83), 200 г травы горца птичьего и 200 г листьев крапивы двудомной измельчают до размера частиц диаметром 5 мм (сито N 50, ГОСТ 214-83). Измельченное сырье загружают в экстракционный аппарат с мешалкой и внешним паровым обогревом. Заливают 14 л 45% этилового спирта в соотношении сырье-экстрагент, равном 1: 14 с учетом коэффициента водопоглощения сырья. Экстрагируют при температуре 55^oC и постоянном перемешивании в течение 60 мин. Извлечение фильтруют через серошинельное сукно в сборник. Проводят еще две экстракции в течение 60 и 30 мин, подавая каждый раз в экстрактор 45% спирт в количестве, равном объему слитого извлечения, 1-ый слив - 11.78 л, 2-ой слив - 11.61 л, 3-ий слив - 11.54 л. Объединенные извлечения упаривают до 1/3 первоначального объема и очищают сепарированием. Очищенный экстракт доупаривают до 1/5 первоначального объема, высушивают в вакуумной сушилке при температуре 60^oC в течение 8 ч и измельчают на мельнице пропеллерного типа. Получают 212.7 г готового продукта, что составляет 21.27% от веса исходного сырья. Сухой экстракт представляет собой мелкодисперсный порошок коричневого цвета с приятным запахом и горьковатым вяжущим вкусом; комкуется, содержание влаги - 4.47%.

Гипогликемическую активность полученного продукта определяли при аллоксановом диабете у крыс. Опыты проводили на 36 белых беспородных крысах-самцах с исходной массой 280-300 г. Описание схемы эксперимента изложено в примере 1. Из полученных данных, представленных в таблице 5, следует, что испытуемый экстракт обладает выраженной гипогликемической активностью, снижая содержание глюкозы в крови крыс на 38.5% по сравнению с показателями животных контрольной группы, при этом аналогичное снижение для препарата сравнения составило 25.3%.

В другой серии опытов исследовали гипогликемическую активность полученного продукта при дитизоновом диабете у кроликов. Опыты проведены на 8 кроликах-самках с исходной массой 2.9±0.5 кг. Описание схемы эксперимента изложено в примере 1. Данные представлены в таблице 6. Из полученных данных следует, что испытуемый экстракт обладает выраженной гипогликемической активностью, снижая содержание глюкозы в крови кроликов на 73.9% по сравнению с показателями животных контрольной группы, при этом аналогичное снижение для препарата сравнения составило 46.4%.

На основании качественного фитохимического анализа в полученном сухом экстракте установлено наличие: 1. Флавоноидов 1.1.0.1 г экстракта растворяют в 50 мл 50% этилового спирта. К 5 мл полученного раствора прибавляют 3 мл 2% спиртового раствора алюминия хлорида; появляется желто-зеленое окрашивание (флавоноиды).

1.2. Двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системах растворителей: А. Изопропанол-уксусная кислота-вода (2:5:5) Б. н-Бутанол-уксусная кислота-вода (40:12:28) При просмотре хроматограммы в УФ-свете до и после проявления 5% спиртовым раствором алюминия хлорида обнаружены: кверцетин - R_f = 0.22(А), 0.73(Б); мирицетин - R_f = 0.60(А), 0.40(Б); гиперозид - R_f = 0.66(А), 0.55(Б); авикулярин - R_f = 0.60(А), 0.65(Б);
идентификацию проводили со стандартными образцами.

2. Дубильных веществ
0.05 г экстракта растворяют в 5 мл воды дистиллированной. К 2 мл полученного раствора прибавляют 2-3 капли раствора железоаммониевых квасцов, появляется черно-зеленое окрашивание (дубильные вещества).

3. Фенолкарбоновых кислот
Двумерной восходящей хроматографией на бумаге марки FN-12 в системах растворителей:
А. н-Бутанол-уксусная кислота-вода (4:1:2)
Б. 15% уксусная кислота
При просмотре хроматограммы в УФ-свете, после обработки парами аммиака, идентифицированы со стандартными образцами:
кофейная кислота - R_f = 0.80(А), 0.42(Б);
хлорогеновая кислота - R_f = 0.67(А), 0.70(Б).

4. Фенолгликозидов
Одномерной восходящей хроматографией на пластинке "Силуфол УФ-254", в системе растворителей: этилацетат-изопропанол-вода (65:12:5,5). При просматривании хроматограммы в УФ-свете при длине волны 254 нм идентифицирован со стандартным образцом триандрин, R_f = 0.5.

2. Количественное определение
Около 0.05 г (точная навеска) экстракта растворяют в мерной колбе вместимостью 25 мл в 10 мл теплой воды (40-60^oC), прибавляют 5.2 мл 96% спирта, доводят объем раствора до метки водой (раствор А). 3 мл раствора А помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 2 мл 2% раствора алюминия хлорида в 96% спирте, доводят объем раствора 20% спиртом до метки. Через 40 мин измеряют оптическую плотность раствора на спектрофотометре при длине волны 415 нм в кювете с толщиной слоя 10 мм. В качестве раствора сравнения используют раствор, состоящий из 3 мл раствора А, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 20% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл. Параллельно измеряют оптическую плотность государственного стандартного образца (ГСО) рутина. 1 мл приготовленного раствора ГСО рутина помещают в мерную колбу вместимостью 25 мл, прибавляют 1 мл 2% раствора алюминия хлорида в 95% спирте и доводят объем раствора 20% спиртом до метки. Раствором сравнения является раствор, состоящий из 1 мл ГСО рутина, 1 капли разведенной уксусной кислоты и доведенный 20% спиртом до метки в мерной колбе вместимостью 25 мл.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин и абсолютно сухой экстракт в процентах (X) рассчитывают по формуле:

D - оптическая плотность испытуемого раствора;
D₀ - оптическая плотность раствора ГСО рутина;
m - масса экстракта в граммах;
m₀ - масса ГСО рутина в граммах;
W- потеря в массе при высушивании экстракта в процентах.

Примечание. Приготовление раствора ГСО рутина: около 0.05 г (точная навеска) ГСО рутина, предварительно высушенного при температуре 130-135^oC в течение 3 ч, растворяют в 85 мл 95% спирта в мерной колбе вместимостью 100 мл при нагревании на водяной бане, охлаждают, количественно переносят в мерную колбу вместимостью 100 мл, доводят объем раствора тем же спиртом до метки и перемешивают.

Найдено: 4.72±0.18%.

Предложенный способ получения достаточно прост, не требует сложной схемы очистки, позволяет получать продукт постоянного состава. Технология может быть внедрена на предприятиях, выпускающих лекарственные препараты.

Для выявления оптимальных технологических режимов нами были изучены основные факторы, влияющие на процесс экстрагирования растительного сырья: природа экстрагента, его соотношение с сырьем, температурный режим, степень измельчения сырья, продолжительность и количество экстракций.

Количественная оценка проводилась по выходу экстрактивных веществ [3] и суммы флавоноидов [4]. Метрологические характеристики представлены в таблице 7.

В качестве экстрагентов были использованы вода и этиловый спирт различных концентраций (20, 30,40, 50, 60, 70, 80,90, 96%).

Как видно из таблицы 8, 40-45% спирт является оптимальным экстрагентом, так как позволяет добиться максимального выхода суммы флавоноидов с учетом выхода экстрактивных веществ.

Выявление оптимальной степени измельчения сырья проводили отдельно для каждого вида сырья. Количественную оценку проводили по выходу экстрактивных веществ. На основании полученных данных (таблица 9) и с учетом того, что слишком мелкое измельчение растительного материала ведет к загрязнению извлечения труднофильтруемыми высокомолекулярными соединениями, измельчение каждого вида сырья следует проводить отдельно до размера частиц: для побегов черники обыкновенной, корневищ и корней девясила высокого, коры ивы козьей - не более 3 мм, для листьев крапивы двудомной и травы горца птичьего - не более 5 мм.

В связи с тем, что в исходном растительном сырье содержатся термолабильные вещества (витамины, антоцианы), изучение влияния температуры на процесс экстракции проводили в интервале температур от 20 до 60^oC. Данные представлены в таблице 10, оптимальная температура - 60±5^oC. При изучении влияния соотношения сырье-экстрагент на процесс экстракции установлено (таблица 11), что с увеличением количества экстрагента возрастает выход экстрактивных веществ и суммы флавоноидов, но рост этот для соотношений 1:12 и выше незначителен, поэтому для предотвращения дополнительного расхода экстрагента выбрано соотношение, равное 1:(12-14) (с учетом коэффициента водопоглощения).

Для определения продолжительности и необходимого количества экстракций установлено время достижения равновесных концентраций экстрактивных веществ и флавоноидов в системе сырье-экстрагент в ходе трехкратной экстракции. Для этого проводили экстракцию измельченного сырья 40% этиловым спиртом в соотношении 1:12 на водяной бане при температуре 60^oC и постоянном перемешивании в колбе с обратным холодильником. Извлечения, полученные через определенные промежутки времени (15, 30, 45, 60, 75, 90 мин), в процессе трех экстракций, анализировали на содержание экстрактивных веществ и флавоноидов. Установлено, что равновесные концентрации устанавливаются при 1-ом и 2-ом контактах фаз через 60 мин, при 3-ем контакте фаз через 30 мин (таблица 12). Трехкратная экстракция обеспечивает достаточно полное истощение сырья - извлекается до 96% действующих веществ.

Предлагаемый способ по сравнению с известным (таблица 13) позволяет получить препарат постоянного состава с более высокой гипогликемической активностью за счет более высокого содержания действующих веществ (флавоноидов).

Посчитать экономическую эффективность предлагаемого способа в настоящее время не представляется возможным, однако вышеуказанные преимущества в сочетании с простой схемой получения способствуют рациональному использованию лекарственного растительного сырья и открывают перспективу внедрения данного способа в фармацевтическую промышленность.

Источники информации
1. Баранов В.Г., Соколоверова И.М., Гаспарян Э.Г., Ярошевский Ю.А., Никитин А.И. Экспериментальный сахарный диабет. Роль клинической диабетологии. - Л.: Наука, 1983. - 240 с.

2. Гольдберг Е. Д. , Ещенко В.А., Бовт В.Д. Сахарный диабет. Этиологические факторы. - Томск.: Изд-во ТГУ, 1975. - 126 с.

3. Государственная Фармакопея СССР. Вып. 1. Общие методы анализа /М3 СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1987. - 336 с.

4. Государственная Фармакопея СССР: Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье /М3 СССР. - 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. - 400 с. - прототип.

5. Диагностика и лечение внутренних болезней: Руководство для врачей. Т. 2. /Под ред. Е.В. Гембицкого. - М.: Медицина, 1991. - 512 с.

6. Сидоров К. К. О классификации токсичности ядов при парентеральных способах введения. /Токсикология новых промышленных химических веществ. - М. , 1973. - С. 47-51.

7. Торопцев И. В., Ещенко В.А. Экспериментальный дитизоновый диабет. - Томск.: Изд-во ТГУ, 1975. - 126 с.

8. Требования к доклиническому изучению общетоксического действия новых фармакологических веществ. - М.: Медицина, 1984.

Формула изобретения

Способ получения средств, обладающего гипогликемической активностью, путем экстрагирования растительного материала, отличающийся тем, что в качестве растительного материала используют сбор лекарственных растений, состоящий из побегов черники обыкновенной, травы горца птичьего, корневищ и корней девясила высокого, листьев крапивы двудомной, коры ивы козьей, который экстрагируют 40 - 45%-ным этиловым спиртом в соотношении растительный материал - экстрагент, равном 1 : (12 - 14), два раза по 60 мин, а третий раз - 30 мин при температуре 55 - 65^oC.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8