Вектор для введения желаемого гена в растение (варианты), способ получения трансгенного растения и способ введения, по крайней мере, двух желаемых генов в растение

 

Изобретение может быть использовано в селекции растений. Вектор содержит ген, который предполагается ввести в растение, и маркерный ген. Ввиду того, что маркерный ген представлен геном, индуцирующим морфологическую аномальность, причем легко удаляемым из ДНК после введения вектора в растение, становится возможным избежать присутствия обычного селективного гена-маркера в трансгенном растении, присутствия, часто характеризующегося нежелательными последствиями для трансформации растений. 4 с. и 25 з.п. ф-лы, 29 ил., 3 табл.

Настоящее изобретение относится к новому вектору для введения желаемого гена в растение, используя методы генной инженерии для получения трансгенного растения; к способу получения трансгенного растения, не подверженного влиянию селектируемого гена-маркера, используя указанный вектор; и способ введения по крайней мере двух желаемых генов в растение, используя указанный вектор.

Предшествующий уровень техники Трансформация микроорганизмов и культивируемых клеток с использованием генной инженерии в настоящее время применяется в производстве физиологически активных веществ, используемых в качестве лекарственных препаратов, внося таким образом большой вклад в данную отрасль. В области селекции растений промышленное применение генной инженерии отстает, поскольку цикл жизни растений намного дольше цикла микроорганизмов. Однако ввиду того, что данная технология позволяет вводить желаемый ген прямо в селекционируемые растения, она имеет следующие преимущества по сравнению с классическим селекционированием, которое требует множественного скрещивания.

(а) Возможно изменение только улучшаемого свойства.

(б) Возможно придание свойств видов, отличных от растений (таких как микроорганизмы и т.п.).

(в) Возможно значительное сокращение селекционного периода.

Таким образом, активно изучались методы генной инженерии для селекции растений.

Получение трансгенных растений включает следующие три стадии.

(1) Введение желаемого гена в клетку растения (включая введение гена в хромосомы, ядро и т.п.).

(2) Отбор ткани растений, состоящей только из клеток, в которые был введен желаемый ген.

(3) Регенерирование растения из отобранной ткани растения.

С целью отбора трансгенных тканей, в которые был введен желаемый ген, необходима визуальная идентификация ткани, в которой происходит экспрессия желаемого гена, без регенерирования нового растения. Для этого желаемый ген обычно вводится в клетку растения вместе с селектируемым геном-маркером, экспрессия которого может быть легко выявлена на стадии культивирования клетки. Это значит, что экспрессия селектируемого гена-маркера используется в качестве показателя введения желаемого гена. Примерами обычных селектируемых генов-маркеров могут служить гены резистентности к антибиотикам, такие как ген резистентности к канамицину (т.е. ген неомицинфосфотрансферазы); ген резистентности к гигромицину (т. е. ген гигромицинфосфотрансферазы); гены синтетаз аминокислот, такие как ген синтетазы нопалина, ген синтетазы октопина, и ген резистентности к сульфонилмочевине (т.е. ген синтетазы аминоактата), который придает сельскохозяйственную химическую сопротивляемость.

Однако экспрессия селектируемого гена-маркера может вызвать серьезные проблемы при использовании трансгенного растения в пищевых целях. Т.е. трудно утверждать, что генный продукт, произведенный путем экспрессии селективного гена-маркера, безопасен для человека. Следовательно, если трансгенное растение, содержащее селективный ген-маркер, будет продаваться в качестве пищевого продукта, необходимо проведение детального исследования с целью определения влияния селективного гена-маркера на человеческий организм. Например, ген фосфотрансферазы неомицина использовался в качестве селективного гена-маркера на лабораторном уровне с начала 1980 гг. В 1994 г. продукт этого гена был окончательно принят в качестве пищевой добавки Администрацией по контролю качества пищевых и лекарственных продуктов США. С этого времени трансгенные растения, содержащие ген фосфотрансферазы неомицина в качестве селективного гена-маркера, использовались в пищевых целях. Однако некоторые потребители продуктов, содержащих ген трансферазы неомицина, до сих пор обеспокоены воздействием этого гена.

Более того, селективные гены-маркеры, которые используются практически, являются единственными генами, такими как ген фосфотрансферазы неомицина, способствующими детоксикации фактора подавления роста клеток растений. Поэтому для отбора трансгенной ткани растения, в которую был введен желаемый ген, такая ткань культивируется в культуральной среде, содержащей фактор подавления роста и экспрессию селективного гена-маркера, а именно, определяется сопротивляемость ткани фактору подавления роста и используется в качестве показателя. Однако даже если ткань обладает такой сопротивляемостью, культивирование в присутствии фактора подавления может привести к нежелательному побочному действию на клетки растения, такому как снижение пролиферации и трансдифференцировке трансгенной ткани.

Далее, экспрессия селективного гена-маркера в клетке растения после отбора трансгенной ткани серьезно препятствует селекции растения путем последующего введения гена. Это означает, что при введении в трансгенное растение, содержащее селективный ген-маркер, другого гена, введение такого гена должно контролироваться с использованием другого селективного гена-маркера. Однако эффективность селективного гена-маркера зависит от вида растения, поэтому для определения условий для каждого селективного гена-маркера необходимо проведение предварительного теста (например, сообщается о том, что ген фосфотрансферазы гигромицина более эффективно воздействует на рисовые растения, чем ген фосфотрансферазы неомицина (K. Shimamoto et al., Nature (London), т. 338, стр. 274, 1989 г.). Более того, поскольку разновидности селективного гена-маркера ограничены, множественное введение гена не может повторяться бесконечно, просто путем замены селективного гена-маркера. Это значит, что число введений гена в определенное растение ограничено само по себе разновидностью селективного гена-маркера, который может быть использован для такого растения. Кроме того, вид селективного гена-маркера, который может быть действительно использован, ограничен, как указано выше. Соответственно, желательно найти способ удаления селективного гена-маркера из хромосомы после селекции трансгенной ткани растения, чтобы исключить влияние селективного гена-маркера на клетку, ткань и растение.

Известны два способа устранения воздействия селективного гена-маркера. В соответствии с первым способом, селективный ген-маркер и транспозон растения вводятся в его хромосому, а затем удаляются из нее (международная выложенная заявка N WO 92/01370). В соответствии со вторым способом, вместо транпозона используется сайт-специфичная рекомбинационная система фага P1 (Международная выложенная заявка N WO 93/01283). Используя эти методы, можно получать клетку, в которой селективный ген-маркер удаляется из хромосомы растения при данном отношении после введения гена. К сожалению, вероятность того, что селективный ген-маркер удаляется, очень низка.

Далее, клетки растения, из которого были удалены селективные гены-маркеры с использованием указанных способов, рассеяны среди клеток, в которых все еще присутствуют и экспрессируются селективные гены-маркеры. Эти два вида клеток нельзя различить визуально.

Клетки растений, содержащие селективные гены-маркеры и желаемые гены, могут быть отобраны исходя из их химической сопротивляемости, питательных требований и т.п. Однако во время селекции клетки, не содержащие селективные гены-маркеры, проявляют сильное ингибирование роста и часто разрушаются. Естественно, такие отборы не могут использоваться для получения клеток, не содержащих селективных генов-маркеров.

С целью получения растений, не содержащих селективного гена-маркера и содержащих желаемый ген с использованием вышеуказанных способов, ткань растения, в котором перемешаны клетки, не содержащие селективный ген-маркер, и клетки, содержащие селективные гены-маркеры, пролиферируются, регенерируются, а затем анализируются на отбор, используя такие методы, как Southern гибридизация или полимеразная цепная реакция.

Этот метод основывается на предпосылке, что регенерированная клетка получается от одной клетки и поэтому все клетки растения должны иметь одинаковые свойства. Таким образом, продукт, полученный из клетки, не содержащей селективного гена-маркера, состоит только из таких клеток. К сожалению, клетки, составляющие такой регенерированный продукт, не обязательно равномерны. Клетки, не содержащие хромосомы селективного гена-маркера, и клетки, содержащие селективный ген-маркер, присутствуют вместе и довольно неравномерно распределены даже в одном и том же отдельном регенерированном растении и в одной и той же его ткани. Таким образом, чрезвычайно трудно получить продукт, состоящий только из клеток, не содержащих селективный ген-маркер, на стадии, когда культивированная ткань трансдифференцируется с целью регенерации продукта.

Кроме того, известные аналитические методы отбора используют ткань, такую как лист, в качестве образца для тестирования (не весь продукт или отдельную клетку). Следовательно, анализируется только общая тенденция по отношению к состоянию селективного гена-маркера, присутствующего в одном листе. В этом случае обычно в одном и том же продукте или ткани присутствует как клетка, не содержащая селективный ген-маркер, так и клетка, содержащая указанный ген-маркер. Итак, даже при образовании продукта, состоящего только из клеток, не содержащих селективного гена-маркера, его трудно выделить. Даже если присутствие селективного гена-маркера в этой ткани не обнаруживается, ткани на других сайтах этого же продукта могут содержать селективный ген-маркер, или это просто означает, что количество селективного гена-маркера ниже предела обнаружения. Поэтому невозможно определить, является ли образец для теста полностью свободным от клеток, содержащих ген-маркер.

Используя вышеуказанные методы, можно получить продукт, не содержащий селективный ген-маркер, только из зародышевой клетки, такой как пыльца, клетка яйца и т.п. В результате самоопыления с использованием клетки яйца, не содержащего селективный ген-маркер, получается оплодотворенное яйцо, не содержащее селективный ген-маркер, с постоянным отношением в соответствии с классическим наследственным законом, и из этого оплодотворенного яйца получается продукт, имеющий такие же свойства, как и оплодотворенное яйцо. Используя этот продукт, можно осуществлять обычные аналитические методы, такие как Southern гибридизация. В частности, даже если клетка, не содержащая селективного гена-маркера, получается с использованием метода, описываемого в приводимой здесь ссылке, продукт, изготавливаемый из такой клетки, получают в первый раз путем трансдифференцирования растения из культуральной ткани, содержащей такую клетку, проводя перекрещивание регенерированного растения и получая потомство F₁ или более поздние генерации. Полученный таким образом продукт может быть выделен как продукт, не содержащий селективного гена-маркера.

С целью удаления селективного гена-маркера из трансгенного растения JP-A-6-276872 описывает способ введения гена, в соответствии с которым селективный ген-маркер вставляется в отдельный плазмидный вектор, отличный от вектора, содержащего желаемый ген. Плазмида, содержащая селективный ген-маркер, удаляется из клетки после завершения введения гена (термин "JP-A", используемый здесь, означает опубликованную Японскую заявку на патент). Однако этот способ требует стадии перекрещивания для удаления селективного гена-маркера. В этом отношении, данный метод такой же, как и обе вышеупомянутые ссылки.

Вышеуказанные способы трудноприменимы к древесным растениям, имеющим длительный период роста, стерильным продуктам или гибридному продукту, в котором F₁ ценен сам по себе. Далее, при использовании удаляемых элементов ДНК, таких как транспозон и т.п., отношение, при котором эти элементы удаляются из хромосомной ДНК, вирусного вектора ДНК и т.п., где эти элементы присутствуют и функционируют, обычно чрезвычайно низкое. Соответственно, необходимо, чтобы удаление этих элементов (в частности, удаление селективного гена-маркера) легко прослеживалось в действительности по крайней мере на стадии культивированной ткани. В том случае, если это нельзя проследить до трансдифференцирования культивированной ткани и образования более позднего поколения через перекрещивание регенерированного продукта, способ не является практичным.

Раскрытие изобретения Соответственно, целью настоящего изобретения является обеспечение вектора, содержащего ген, который желательно ввести в растение, и селективный ген-маркер, при котором растение, содержащее указанный ген, не оказывает при потреблении побочного воздействия на человеческий организм, даже при экспрессии селективного гена-маркера.

Другой целью настоящего изобретения является обеспечение вектора для введения желаемого гена в растение, при котором вектор содержит селективный ген-маркер, обеспечивающий отбор трансгенной ткани, без использования фактора подавления роста клетки растения, снижающего активность клетки растения.

Следующей целью настоящего изобретения является обеспечение вектора для введения желаемого гена в растение, при котором вектор содержит селективный ген-маркер и действует таким образом, чтобы исключить воздействие селективного гена-маркера путем удаления селективного гена-маркера из ДНК, в которой селективный ген-маркер присутствует и функционирует. Используя этот вектор, желаемый ген может быть эффективно введен повторно.

Очередной целью настоящего изобретения является обеспечение способа получения трансгенного растения, используя такой вектор, который может устранить воздействие селективного гена-маркера, не включая стадию производства F₁ или более поздних генераций путем скрещивания, и способа разнообразного введения генов в растение путем применения вышеописанного способа.

Эти и другие цели настоящего изобретения достигаются использованием вектора, включающего желаемый ген и по крайней мере один ген с индукцией морфологической аномальности в качестве селективного гена-маркера.

Далее, эти и другие цели настоящего изобретения достигаются использованием такого вектора, в котором селективный ген-маркер удаляется из ДНК после его экспрессии. Экспрессия селективного гена-маркера и прекращение его функции определяется путем морфологических изменений ткани, в которую был введен селективный ген-маркер.

Более того, эти и другие цели настоящего изобретения достигаются использованием вектора, включающего желаемый ген, по крайней мере один ген с индукцией морфологической аномальности в качестве селективного гена-маркера, и удаляемый элемент ДНК. Ген с индукцией морфологической аномальности размещается таким образом, что он ведет себя так же, как и удаляемый элемент ДНК. Желаемый ген размещается таким образом, что он не ведет себя так же, как и удаляемый элемент ДНК.

Далее, эти и другие цели настоящего изобретения достигаются путем обеспечения способа производства трансгенного растения, свободного от воздействия селективного гена-маркера, включающего следующие стадии: (A) введение вектора в клетку растения, при котором указанный вектор включает желаемый ген, по крайней мере один ген с индукцией морфологической аномальности и удаляемый элемент ДНК, при этом указанный ген с индукцией морфологической аномальности размещается таким образом, что он ведет себя так же, как и удаляемый элемент ДНК, а желаемый ген размещается таким образом, что он не ведет себя так же, как и удаляемый элемент ДНК; (B) культивирование клетки растения, полученной в (A), выявление морфологической аномальной ткани растения, которая появляется во время культивирования, и отбор морфологически аномальной ткани, и (C) культивирование указанной морфологически аномальной ткани, отобранной по подпункту (B), выявление морфологически нормальной ткани, которая появляется во время культивирования, и отбор морфологически нормальной ткани.

Далее, эти и другие цели настоящего изобретения достигаются путем обеспечения способа введения по крайней мере двух желаемых генов в растение, включающего по крайней мере двукратное проведение следующих стадий: (A) введение вектора в клетку растения, при котором указанный вектор включает желаемый ген, по крайней мере один ген с индукцией морфологической аномальности в качестве селективного гена-маркера, и удаляемый элемент ДНК, при этом указанный ген с индукцией морфологической аномальности размещается таким образом, что он ведет себя так же, как и удаляемый элемент ДНК, а указанный желаемый ген размещается таким образом, что он не ведет себя так же, как и удаляемый элемент ДНК, (B) культивирование клетки растения, полученной в (A), выявление морфологически нормальной ткани растения, которая появляется во время культивирования, и отбор указанной морфологически аномальной ткани, и (C) культивирование указанной морфологически аномальной ткани, отобранной в (B), выявление морфологически нормальной ткани, которая появляется во время культивирования, и отбор указанной морфологически нормальной ткани.

Кроме того, эти и другие цели настоящего изобретения достигаются путем регенерации растения посредством культивирования вышеописанной морфологически нормальной ткани.

Краткое описание чертежей Фиг. 1 представляет собой диаграмму плазмиды Ti и рестрикционную карту эндонуклеазы фрагмента Pst I на участке T-DNA штамма A. tumefaciens PO22.

Фиг. 2 представляет собой диаграмму конструкции pIPT2.

Фиг. 3 представляет собой диаграмму конструкции pIPT3 из pIPT2.

Фиг. 4 представляет собой диаграмму конструкции pIPT4 из pIPT3.

Фиг. 5 представляет собой рестрикционную карту эндонуклеазы участка T-ДНК в структуре pIPT4.

Фиг. 6 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи крайнего побега фенотипа табака, в который был введен ген с использованием pIPT4.

Фиг. 7 представляет собой диаграмму конструкции pNPI102.

Фиг. 8 представляет собой диаграмму конструкции pNPI103 из pIPT4 и pNPI102.

Фиг. 9 представляет собой диаграмму конструкции pNPI106 из pNPI103.

Фиг. 10 представляет собой рестрикционную карту эндонуклеазы участка T-ДНК в структуре pNPI106.

Фиг. 11 представляет собой фотографию побега N 2 через месяц культивирования, как описано в примере 2.

Фиг. 12 представляет собой фотографию побега N 8 через месяц культивирования, как описано в примере 2.

Фиг. 13 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи побега N 8, как описано в примере 2.

Фиг. 14 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи нормального продукта, полученного из побегов NN 13-1 и 14-1, как описано в примере 3.

Фиг. 15 представляет собой фотографию нормальных побегов, дифференциальных от крайнего фенотипа побега табака, как описано в примере 3.

Фиг. 16 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи нормального продукта, получаемого из листа, сформировавшегося из побега N 7, как описано в примере 2.

Фиг. 17 представляет собой диаграмму конструкции pNPI128.

Фиг. 18 представляет собой диаграмму конструкции pNPI129 из pNPI128.

Фиг. 19 представляет собой диаграмму конструкции pNPI132 из pNPI101 и pNPI129.

Фиг. 20 представляет собой рестрикционную карту эндонуклеазы участка Т-ДНК в структуру pNPI132.

Фиг. 21 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи нормальных продуктов, полученных из побегов NN 15-21, как описано в примере 5, используя затравки, в которых было выявлено присутствие гена ipt.

Фиг. 22 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи нормальных продуктов, полученных из побегов NN 15-21, как описано в Примере 5, используя затравки, в которых было выявлено устранение участка, удерживаемого парой Rs, включая ген ipt.

Фиг. 23 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи нормальных продуктов, полученных из побегов NN 15-21, как описано в примере 5, в котором было выявлено наличие гена GUS.

Фиг. 24 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи нормальных продуктов, полученных от линии, которая не смогла сформировать крайнего фенотипа побега, как описано в примере 5.

Фиг. 25 представляет собой диаграмму конструкции pNPI702.

Фиг. 26 представляет собой рестрикционную карту эндонуклеазы участка Т-ДНК в структуре pNPI702.

Фиг. 27 представляет собой фотографию нормальных побегов, дифференцированных от крайнего фенотипа побега гибридной осины, как описано в примере 7.

Фиг. 28 представляет собой рестрикционную карту эндонуклеазы участка Т-ДНК в структуре pNPI140.

Фиг. 29 показывает результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи нормального побега, отдифференцированного от крайнего фенотипа побега после разнообразного введения генов, как описано в примере 8.

Лучший вариант осуществления изобретения
В данном описании ген с индукцией морфологической аномальности (MAI) означает ген, индуцирующий в ткани растения морфологически аномальную дифференциацию, такую как карликовость, нарушение доминирования верхушки, изменение пигментов, образование пробелов в кроне, образование волосистых корней, волнистость листьев и т.п. Помимо предпочтительного гена (MAI), могут использоваться гены, выделенные из бактерий рода Agrobacterium, или им подобные, индуцирующие опухоли или тератомы (т.е. образование добавочных побегов и придаточных корней) в различных растениях. Примерами этих различных генов MAI являются гены синтеза цитокина (например, ген ipt (изопентенилтрансфераза) (A.C. Smigocki. L.D. Owens, Procl. Natl. Acad. Sci. U. S. A., т. 85, с. 5131, 1988)), ген iaaM (триптофан монооксигеназа), (H.J. Klee et al. , GENES & DEVELOPMENT, т. 1, с. 86, 1987), ген 5 (H. Korber et al. , EMBO Journal, vol. 10, p. 3983, 1991), ген 6b (P.J.J. Hooykaas et al., Plant Mol. Biol. , т. 11, p. 791, 1988), и гены rol, такие как rolA, rolB, rolC и rolD (F.F. White et al., J. Bacteriol., vol. 164, стр. 33, 1985). Далее такими примерами являются ген iaaL (индолуксусная кислота-лизин синтетаза), такой как Pseudomonas syringae подвид savastanoi (A. Spena et al., vol. , Gen Genet. , vol. 227, p. 205, 1991), гены-гомеобоксы и гены фитохрома в различных растениях. Предпочтительно используются гены синтеза цитокина, такие как ген ipt или по крайней мере один ген, выбранный из генов rol, (более предпочтительно гены rol, содержащие гены rolA, rolB и rolC). Ген ipt присутствует в Т-ДНК Agrobacterium tumefaciens и вызывает нарушение доминирования верхушки. Гены rol, содержащие гены rolA, rolB и rolC, присутствуют в Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes и по крайней мере один из них вызывает образование волосистых корней, карликовость, волнистость листьев и т.п. растения, регенерированного из волосистых корней.

Используя методы настоящего изобретения, можно запрограммировать комбинацию этих селективных генов-маркеров таким образом, что специфическая структура, такая как дополнительный побег, придаточный корень и т.п., трансдифференцируется в отдельном растении, в которые вводятся эти селективные гены-маркеры. В соответствии с настоящим изобретением такая комбинация генов MAI может быть использована в соответствии с условиями получения трансгенного растения, подходящего для введения генов.

Морфологически аномальная ткань, полученная путем внедрения гена MAI в клетку, состоит только из клеток, содержащих этот ген. Поэтому, используя этот ген в качестве селективного гена-маркера, вместе с желаемым геном конструируется вектор. При введении этого вектора в клетку растения и культивировании трансгенной клетки ткань, состоящая только из этой клетки, в которую вводятся селективный ген-маркер и желаемый ген, может быть отделена путем визуального отделения образовавшейся морфологической аномальной ткани от этой клетки.

Подходящие векторы, используемые в соответствии с настоящим изобретением, имеют последовательность ДНК, которая внедряет посторонний ген в клетку-хозяин и которая экспрессирует посторонний ген внутри клетки хозяина.

При введении гена с использованием вектора в соответствии с настоящим изобретением ткань растения, состоящая только из трансформированной клети, может быть визуально отделена путем простого культивирования клетки после операции по введению гена в общую культуральную среду, такую как культуральная среда Мурашиге-Скуг, при обычных условиях культивирования. Поскольку отпадает необходимость использования специальной субстанции для выделения трансформированной ткани, такой как фактор подавления роста клетки растения и т. п. , процедура не только упрощается, но и благодаря такой субстанции активность клетки растения не снижается. Кроме того, ген MAI присущ растению или данный ген спонтанно внедряется в растение через инфекцию с бактериями и т. п. Следовательно, растение, полученное с использованием вектора в соответствии с настоящим изобретением, не отличается от естественных растений, имеющих данную морфологическую аномальность.

Подходящие векторы в соответствии с настоящим изобретением включают вектор, в котором ген MAI расположен так, что он действует вместе с удаляемым ДНК, а желаемый ген размещается таким образом, что он не действует вместе с удаляемым элементом ДНК.

В данном описании удаляемый элемент ДНК представляет собой элемент последовательности ДНК, который может сам выводиться из ДНК, в которой элемент ДНК существует и функционирует. В растениях в качестве такого элемента известен транспозон, присутствующий в хромосоме. Структура, активность и поведение транспозонов были установлены почти полностью. В принципе, для функционирования транспозона необходимы два компонента: (1) фермент, который экспрессируется из присутствующего в нем гена и который катализирует вырезание (эксцизию) и транспозицию самого транспозона (транспозаза), и (2) связывающие последовательности ДНК, которые присутствуют на концевых участках транспозона и на которые действует транспозаза. С помощью этих элементов транспозон эксцизируется из хромосомы, в которой он содержится, а затем обычно переносится на новую позицию в ДНК. Однако при определенном соотношении транспозон также исчезает без переноса. Настоящее изобретение учитывает такую ошибку переноса транспозона.

Существует два вида транспозона: автономный транспозон и неавтономный транспозон. Автономный транспозон поддерживает два элемента: транспозазу и связывающую последовательность ДНК. В автономном транспозоне транспозаза экспрессируется и связывается со связующей последовательностью ДНК для действия, при этом транспозон автономно эксцизируется из хромосомы. Неавтономный транспозон удерживает концевую связывающую последовательность ДНК, с которой связана транспозаза для действия. В неавтономном транспозоне ген подвергается мутации, при которой транспозаза не экспрессируется; таким образом, транспозон не может быть эксцизирован из хромосомы автономно. Однако, если транспозаза поступает в неавтономный транспозон из автономного транспозона или из независимого гена транспозазы, неавтономный транпозон ведет себя подобно автономному транспозону.

Примерами автономных транспозонов могут служить Ac и Smp, выделенные из кукурузы (A. Gierl, H. Saedler, Plant Mol. Biol., vol. 19, p. 39, 1992). Ac может быть получен путем гидролизации генного локуса wx-m7 в хромосоме кукурузы с помощью рестрикционной эндонуклеазы Sau3A (U. Behrens et al., Mol. Gen. Genet. , vol. 194, p. 346, 1984). Этот автономный транспозон является самым изученным среди транспозонов растений. Фактически, уже была определена последовательность ДНК (M. Muller-Neumann et al., Mol. Gen. Genet., vol. 198, p. 19, 1984).

Примерами неавтономных транспозонов могут служить Ds и dSpm, полученные путем делеции внутренних участков Ac и Spm соответственно (H.-P. Doring, P. Starlinger, Ann. Rev. Genet., vol. 20, p. 175, 1986), а также транспозоны, выделенные из многих растений (не кукурузы), таких как львиный зев, ипомея и т.п. (например, Y. Inagaki et al., Plant Cell, vol. 6, p. 375, 1994).

Когда эти транспозоны вводятся в хромосомы экзогенных растений, они также эксцизируются из хромосомы и переносятся, проявляя свою активность (например. B. Baker et. al. , Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p. 4844, 1986).

В соответствии с настоящим изобретением можно использовать как автономные, так и неавтономные транспозоны. Неавтономные транспозоны могут быть использованы путем инсерции и них функционирующего гена транспозазы.

Другим подвижным геном ДНК, который не присутствует в растениях, но который может использоваться в соответствии с настоящим изобретением, является элемент, полученный из сайт-специфичной рекомбинационной системы. Сайт-специфичная рекомбинационная система состоит из двух элементов: (1) рекомбинационный сайт (соответствующий подвижному элементу ДНК в соответствии с настоящим изобретением), имеющий характерную последовательность ДНК, и (2) фермент, который специфично связывает последовательность ДНК и катализирует рекомбинирование между последовательностями ДНК при наличии двух и более последовательностей (рекомбиназа). Когда две последовательности ДНК ориентированы в одном и том же направлении при заданном интервале одной и той же молекулы ДНК, участок, удерживаемый этими последовательностями ДНК, эксцизируется из молекулы ДНК, такой как плазмида, хромосома и т.п. Когда две последовательности ДНК ориентируются в противоположных направлениях одной и той же молекулы ДНК, участок, удерживаемый этими последовательностями ДНК, инвертируется.

Настоящее изобретение предпочтительно использует последовательную эксцизию. Как эксцизия, так и инверсия внутри рекомбинационного сайта происходят в результате гомологического рекомбинирования через сайт-специфичную рекомбинационную систему, которая отличается от механизма, использующего транспозон. Известно, что ген рекомбиназы не обязательно присутствует в той же молекуле ДНК, в которой находится рекомбинационный сайт. Гену рекомбиназы необходимо только присутствовать в той же клетке и экспрессироваться с целью эксцизии или инвертирования участка, удерживаемого двумя последовательностями ДНК (N.L. Craig, Annu. Rev. Genet., vol. 22, p. 77, 1988).

В настоящее время сайт-специфические рекомбинационные системы были идентифицированы в микроорганизмах, таких как фаг, бактерии (например, E. coli), дрожжи и т.п. Их примерами является система Cre/lox, система pSR1, система FLP, система cer и система fim (например, N.L. Craig, Annu. Rev. Genet. , vol. 22, p. 77, 1988). Когда сайт-специфичная рекомбинационная система, отделенная от этих микроорганизмов с использованием системы Cre/lox, полученной из фага 31 (WO 93/01283), вводится в организмы (включая растения), отличные от того организма, из которого была получена эта система, она ведет себя таким же образом, как и в первоначальном организме. Сайт-специфичная рекомбинационная система дрожжей (Zygosaccharomycts rouxii) (система pSR1 (H. Matsuzaki et al., J. Bacteriology, vol. 172, p. 610, 1990)) также может быть использована в соответствии с настоящим изобретением. Эта система pSR1 также (поддерживает) сохраняет присущую ей функцию в высших растениях (H. Onouchi et al., Nucleic Acid Res., vol. 19, p. 6373, 1991).

В соответствии с настоящим изобретением, ген с индукцией морфологической аномальности (MAI) может быть поставлен в такую позицию, в которой этот ген эксцизируется вместе с удаляемым элементом ДНК. Например, когда в качестве удаляемого элемента ДНК используется транспозон, ген MAI может быть поставлен в такую позицию, которая не влияет на эксцизию транспозона и которая находится выше промоторного участка гена транспозазы, но ниже концевого участка, с которым связана транспозаза. При использовании системы pSR1 ген MAI может быть вставлен в любую позицию внутри участка, удерживаемого характерными последовательностями ДНК, ингибирующими экспрессию рекомбиназы.

В соответствии с настоящим изобретением, ген MAI предпочтительно находится внутри удаляемого элемента ДНК. С другой стороны, позиция желаемого гена особенно не ограничена, однако предпочтительно, чтобы желаемый ген находится вне удаляемого элемента ДНК.

Используя вектор такой структуры после введения желаемого гена, ген MAI может быть удален при определенной частоте вместе с удаляемым элементом ДНК из ДНК, в которой он присутствует и функционирует. Желаемый ген, который не действует совместно с селективным геном-маркером, остается в той же ДНК. Данный вектор может быть использован для многократного введения желаемого гена в определенное растение. Кроме того, поскольку утеря функции этого гена MAI может быть определена визуально как морфологическое изменение трансгенной ткани во время культивирования, ткань, состоящая только из клетки, содержащей желаемый ген, но не содержащей селективный ген-маркер, может быть легко отделена без использования специальной процедуры. Следовательно, даже если такая клетка в действительности образуется при низком соотношении, эта клетка может быть успешно выделена с тем, чтобы сделать эту процедуру практически полезной. Далее, с использованием данного вектора можно не только многократно вводить ген, но и повторять эту процедуру до регенерации взрослого растения. Таким образом можно успешно осуществлять многократное введение. С целью получения отдельного трансгенного растения, состоящего только из таких клеток, растение может быть регенерировано из выделенной таким образом ткани, не подвергаясь стадии перекрещивания. Полученное таким образом отдельное трансгенное растение полностью свободно от побочного действия на человеческий организм, вызываемого вышеупомянутым селективным геном-маркером. Более того, использование такого вектора не требует применения фактора подавления роста клетки, который может снизить активность клетки на этапе выделения трансгенной ткани.

Вектор в соответствии с настоящим изобретением может использоваться в любых растениях, в которые указанный ген может быть введен с использованием методов генной инженерии. Желаемым геном в соответствии с настоящим изобретением может быть любой ген, придающий необходимые сельскохозяйственные свойства, и любой ген, позволяющий изучение механизмов экспрессии гена и т. п. , при этом необязательно придающий необходимые сельскохозяйственные свойства.

Для продуцирования белка, такого как фермент, из гена обычно требуется структурная последовательность гена, кодирующая информацию полипептида, и регуляторные последовательности структурального гена, такие как промоторная последовательность (последовательность, инициирующая экспрессию), терминаторная последовательность (последовательность, заканчивающая экспрессию) и т. п. Примерами подходящей промоторной последовательности, функционирующей в растении, является промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты (J.T. Odell et al., Nature (London), vol. 313, p. 810, 1985), промотор синтетазы нопализа (W. H. R. Langridge et al., Plant Cell Rep., vol. 4, p. 355, 1985) и промотор малой субъединицы дифосфаткарбоксилазы/оксигеназы (R. Fluhr et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol. 83, p. 2358, 1986). Примерами подходящей терминаторной последовательности могут служить сигнал полиаденилирования синтетазы нопалина (A. Depicker et al., J. Mol. Appl. Gen., vol. 1, p. 561, 1982) и сигнал полиаденилирования синтетазы октопина (J. Gielen et al., EMBO J. , vol. 3, p. 835, 1984). Соответственно, при необходимости, ген вектора в соответствии с настоящим изобретением включает структурный ген и его регуляторные последовательности, экспрессирующие ген. Данный ген или ген и регуляторные последовательности могут быть получены путем химического синтеза или путем клонирования кДНК или геномной ДНК.

Вектор в соответствии с настоящим изобретением может быть косвенно введен в клетку растения через вирусы или бактерии, которыми заражены растения (I. Potrycus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol., vol. 42, p. 205, 1991). Примерами подходящих вирусов являются мозаичный вирус цветной капусты, геминивирус, мозаичный вирус табака и бромный мозаичный вирус. Примерами подходящих бактерий являются Agrobacterium tumefaciens (в дальнейшем обозначаемый как A. tumefaciens) и Agrobacterium rhizogenes (в дальнейшем обозначаемый как A. rhizogenes). Известно, что двудольные растения обычно заражены бактерией рода Agrobacterium. В последнее время также сообщается о введении генов в однодольные растения путем инфицирования указанных растений указанными бактериями (например, международная выложенная заявка N WO 94/00977).

Вектор соответствии с настоящим изобретением может быть прямо введен в растение с помощью физических и химических методов, таких как микроинъекции, электропорация, полиэтиленгликолевый метод, метод слияния и высокоскоростная баллистическая пенетрация (I. Potrycus, Annu. Rev. Plant Physiol. Plant Mol. Biol. , vol. 42, p. 205, 1991). Поскольку общий метод косвенного введения с использованием рода Agrobacterium не может быть применен ко многим однодольным растениям и двудольным растениям, которые резистентны к инфицированию посредством Agrobacterium, методы вышеупомянутого прямого введения являются эффективными для этих растений.

Вектор, используемый в соответствии с настоящим изобретением, конкретно не ограничивается до тех пор, пока он отвечает требованиям настоящего изобретения. Например, при непрямом введении вектора в клетку растения, вектор может быть Ti-вектором или вирусным вектором. Примерами вектора Ti для использования в соответствии с настоящим изобретением могут служить Bin19 (M. Bevan et al. , Nucleic Acids Res., vol. 12, p. 8711, 1984), pRAL3940 (A. Hoekema et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 85, 1985), pGA492 и pGA482 (G. An, Plant Physiol., vol. 81, p. 86, 1986), pC22 (C. Simoens et al., Nucleic Acids Res., vol. 14, p. 8073, 1986), pAGS111 (P. van den Elzen et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 149, 1985), pEND4K (H.J. Klee et al., Bio/Technology, vol. 3, p. 637, 1985), pGV831 (R. Delaere et al., Nicleic Acids Res., vol. 13, p. 4777, 1985) и pMCN200 (R.T. Fraley et al., Bio/Technology, vol. 3, p. 629, 1985). Примерами вирусного вектора для использования в соответствии с настоящим изобретением, могут служить мозаичный вирусный вектор цветной капусты (N. Brisson et al., Nature (London), vol. 310, p. 511, 1984), вектор геминивируса (R. J. Hayes et al., Nature (London), vol. 334, p. 179, 1988), вектор бромного мозаичного вируса (R. French et al., Science, vol. 231, p. 1294, 1986), вектор мозаичного вируса табака (N. Takamatsu et al., EMBO J., vol. 6, p. 307, 1987) и агроинфекционный вектор (N. Grimsley et al., Nature (London), vol. 325, p. 177, 1987). Однако векторы для использования в соответствии с настоящим изобретением не ограничиваются указанными векторами.

Далее, желаемый ген для использования в соответствии с настоящим изобретением, конкретно не ограничивается. Примерами желаемого гена для использования в соответствии с настоящим изобретением могут служить гены резистентности к заболеваниям (например, ген к эндотоксину Bacillus thuringiensis, WO 92/20802), к гербицидам (например, ген синтазы ацетолактата мутанта, WO 92/08794), к белку хранения зерна (например, ген глютелин, WO 93/18643), к синтезу жирной кислоты (например, ген тиоэкстеразы ацил-ACP, WO 92/20236), к гидролизу стенок клетки (например, ген полигалактуроназы (D. Grierson et al. , Nucleic Acids Res., vol. 14, p. 8595, 1986)), к биосинтезу антоцианина (например, ген синтазы халькон (chalcone) (H.J. Reif et al., Mol. Gen. Genet., vol. 199, p. 208, 1985)), к биосинтезу этилена (например, ген оксидазы ACC (A. Slater et al., Plant Mol. Biol., vol. 5, p. 137, 1985)), к системе активной утилизации кислорода (например, ген редуктазы глютатиона (S. Greer & R.N. Perham, Biochemistry, vol. 25, p. 2736, 1986)) и к биосинтезу лигнина (например, ген аммиачной лиазы фенилаланина, ген дегидрагеназы циннамилового спирта, ген o-метилтрансферазы, ген 4-гидроксилазы циннамата, ген лигазы 4-кумарат-CoA, ген редуктазы циннамоил CoA (A.M. Boudet et al., New Phytol., vol. 129, p. 203, 1995)). Однако желаемые гены для использования в настоящем изобретении не ограничиваются указанными генами.

Более того, растение-хозяин для использования в соответствии с настоящим изобретением конкретно не ограничивается. Примерами травянистых растений, используемых в качестве растения-хозяина, могут служить табак (Tabacum), томат (Lycopersicom), сладкий картофель (Impoea), картофель (Solanum), морковь (Dacus), салат (Lactuca), цветная капуста (Brassica), капуста (Brassica), масличный рапс (Brassica), подсолнечник (Helianthus), сахарная свекла (Bela), аспарагус (Asparagus), банан (Musa), хлопок (Gossypium), арабидопсис (Arabidopsis), люцерна (Medicago), горох (Pisum), соя (Glycine), рис (Oryza), кукуруза (Zea) и рожь (Secale). Примерами древесных растений, используемых в качестве растения-хозяина, могут служить тополь (Populus), эвкалипт (Eucalyptus), акация (Acacia), груша (Pyrus), яблоня (Malus), виноград (Vitis), грецкий орех (Juglans), слива (Prunus), роза (Rosa) и ель (Picea). Однако растения-хозяева для использования в соответствии с настоящим изобретением не ограничиваются указанными растениями.

В соответствии с настоящим изобретением, ген MAI экспрессируется с целью придания внутренней части клетки физиологической аномальности. Физиологические аномальности означают выработку гормона роста растений в клетке растений, при этом пролиферация и дифференциация клетки, содержащей ген
MAI, смешиваются для того, чтобы вызвать различные морфологические аномальности. Например, совокупность беспорядочных побегов с нарушением верхушечного доминирования (экстремальный фенотип побегов), волосистые корни и т. п. могут быть получены из клетки, в которую вводится такой ген MAI. Данный фенотип формируется путем аномальной пролиферации и дифференциации вышеуказанной клетки. Таким образом, такая морфологически аномальная ткань состоит только из клетки, содержащей данный ген. Соответственно, при конструировании вектора с использованием такого гена в качестве селективного гена-маркера вместе с желаемым геном, введении в клетку растения и культивировании клетки ткань, состоящая только из клетки, в которую были введены селективный ген-маркер и желаемый ген, может быть выделена просто путем визуального отбора образовавшей морфологически аномальной ткани от клетки растения. Таким образом, возможно проведение визуального отбора трансгенной ткани без использования специальных процедур, таких как добавление фактора подавления роста клетки растения и т.п. к культуральной среде.

В то время как традиционные селективные гены-маркеры, такие как ген фосфотрансферазы неомицина, не вводятся в растения без генной инженерии, ген MAI в соответствии с настоящим изобретением представляет собой ген, присущий растениям или естественно введенный в растения путем инфицирования бактериями и т. п. По этой причине считается, что безопасность данного генного продукта для человеческого организма достаточно высока.

Далее, в соответствии с настоящим изобретением, ген MAI вставляется в позицию таким образом, что он действует нераздельно с подвижным элементом ДНК. После введения вектора, имеющего такую структуру, в растение ген MAI, использованный в качестве селективного гена-маркера, удаляется из ДНК вместе с удаляемым элементом ДНК с установленной частотой, приводящей к потере его функции. Тем временем желаемый ген, который действует не так, как подвижный элемент ДНК, остается в этой же ДНК и выполняет свою функцию. Таким образом, экспрессия одного и то же селективного гена-маркера может использоваться в качестве индекса для введения желаемого гена снова и снова. Соответственно, данный вектор обеспечивает многократное введение гена в определенное растение путем простого изменения структуры, связанной с желаемым вводимым геном без каких-либо изменений структуры селективного гена-маркера и пр. По этой причине данный вектор может повторно использоваться неограниченное количество раз.

Поскольку утеря функции селективного гена-маркера, т.е. потеря функции гена MAI, может быть определена визуально, ткань, состоящая из клеток, не содержащих селективный ген-маркер и содержащих желаемый ген, может быть получена легко и наверняка. Это значит, что культивация, визуальный отбор и отделение могут быть повторены без необходимости проведения какой-либо специальной процедуры с целью получения такой ткани. Далее, растение, состоящее из вышеуказанных клеток, может быть получено только путем регенерации растения из полученной ткани, не подвергаясь стадии перекрещивания. Более того, несмотря на то, что затруднительно полностью удалить транспозон из ДНК по причине его высокой транспозабильности, данное изобретение может быть успешно применено на практике благодаря высокой эффективности отбора.

Настоящее изобретение иллюстрируется следующими примерами, однако данные примеры не следует рассматривать как ограничивающие изобретение.

В следующих примерах эксперименты проводились в соответствии с инструкциями, изложенными в Molecular Cloning, 2-е издание (Sambrook et al., eds., Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York, 1989) или по усмотрению производителя, если не указано иначе.

Пример 1
1. Конструирование вектора
Ген ipt, присутствующий в Т-ДНК патогенного штамма A. tumefaciens PO22 (H. Wabiko, Chemical Regulation of Plants, т. 24, стр. 35, 1989 (см. фиг. 1)), вырезался с помощью рестрикционной эндонуклеазы PstI, при этом получалась плазмида pIPT1 путем лигирования гена ipt в сайт рестрикционной эндонуклеазы PstI плазмиды pUC7 (Molecular Cloning, 2-е издание, том 1, 4.10). Из этой плазмиды с помощью рестрикционных эндонуклеаз BamHI & PstI вырезается ген ipt, содержащий нативный промотор и нативный сигнал полиаденилирования, при этом получается плазмида pIPT2 путем лигирования гена ipt в сайты рестрикционной эндонуклеазы BamHI-PstI плазмиды pUC119 (полученной от Takaro Shuzo Co., Ltd.). Из этой плазмиды с помощью рестрикционной эндонуклеазы RsaI вырезаются структуральный ген и нативный сигнал полиаденилирования гена ipt, при этом получается плазмида pIPT3 путем лигирования гена ipt в сайт рестрикционной эндонуклеазы SmaI плазмиды pUC119. Далее, ген ipt, вставленный в pIPT3, вырезается с помощью рестрикционных эндонуклеаз BamHI и SacI, при этом получается плазмида pIPT4 путем лигирования фрагмента в сайты рестрикционной эндонуклеазы BamHI-SacI векторной плазмиды pBI121 (полученной от Clontech Co.), которая может быть использована для введения гена в растение. При инфицировании растения A. tumefaciens, имеющей плазмиду pIPT4, участок Т-ДНК между сайтом LB и сайтом RB (здесь участок приблизительно в 5 kb, имеющий ген фосфорансферазы неомицина (NPTII) и ген ipt) интегрируется в хромосому растения.

Эта плазмида pIPT4 была введена в E. coli (Escherichia coli), штамм JM109, в соответствии с Будапештским Договором как E. coli JM109 (pIPT4) под депозитарным N FERM BP-5063.

Процедура конструирования плазмиды pIPT4 схематически показана на фиг. 2-4. Карта рестрикционной эндонуклеазы участка Т-ДНК данной эндонуклеазы показана на фиг. 5. На фиг. 2-4 и 5 обведенные кружочками "P" и "T" означают нативный промотор и нативный сигнал полиаденилирования самого гена ipt соответственно. 35S-P означает промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты, а Nos-P означает промотор гена синтетазы нопалина. T (фиг. 4) или Nos-Т (фиг. 5) означают сигнал полиаденилирования гена синтетазы нопалина.

В этом примере, как показано на фиг. 5, для гена MAI в качестве селективного гена-маркера используется ген ipt, способствующий образованию экстремального фенотипа побегов, вызывая нарушения доминирования верхушки, при этом ген NPTII используется как модель желаемого гена. Ген ipt принадлежит к онкогенам, удерживающим патогенный A. tumefaciens. Клетка растения, в которую вводится ген ipt, вызывает дифференциацию, ведущую к образованию экстремального фенотипа побегов, вызванную избыточной выработкой цитокинина, являющегося гормоном растения.

В этом примере промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты используется для промоторной последовательности гена ipt, а нативный сигнал полиаденилирования самого гена ipt используется для терминаторной последовательности.

II. Введение pIPT4 в Agrobacterium
A. tumefaciens, штамм LBA4404 (полученный от Clonetech Co.), инокулируется в 10 мл жидкой культурной среды YEB (содержащей 5 г/л говяжьего экстракта, 1 г/л пептона, 5 г/л сахарозы и 2-мМ MgSO₄, pH 7,2 при 22^oC (pH при 22^oC используется в дальнейшем, если не указано иначе), и культивируется при 28^oC до тех пор, пока уровень OD₆₃₀ не достигнет 0,4-0,6. Затем культура подвергается центрифугированию при 6900 · g в течение 10 минут при 4^oC с целью сбора клеток. Клетки суспендируются в 20 мл 10-мМ Tris-HCl (pH 8,0), и суспензия вновь подвергается центрифугированию при 6900 · g в течение 10 минут при 4^oC. Далее собранные клетки вновь суспендируются в 200 μл жидкой культурной среды YEB, и эта суспензия используется в качестве клеточного раствора для введения плазмиды.

В 15-мл пробирке (производства Falcon) 200 μл клеточного раствора для введения плазмиды смешиваются с 6 μл плазмиды pIPT4, полученной на вышеописанной стадии I, и смесь охлаждается путем погружения на 5 минут в этанол, охлажденный в жидком азоте в течение 30-40 минут. Охлажденный таким образом раствор вместе с пробиркой выдерживается в водяной бане при 29^oC в течение 25 минут. Затем к нему добавляются 750 μл жидкой культурной среды YEB, и перемешанный раствор культивируется при 29^oC в течение 1 часа при потряхивании. Клеточный раствор распределяется на агарной культурной среде YEB (содержащей 1,2 вес./об.% агара и такие же ингредиенты, как и вышеописанная культурная среда), к которой добавляется 50 мг/л канамицина и культивируется при 28^oC в течение 2 дней. Полученные таким образом клеточные колонии инокулируются в жидкую культурную среду YEB и культивируются далее. Затем плазмида экстрагируется из клеток с помощью щелочного метода и расщепляется с помощью рестрикционных эндонуклеаз BamHI и EcoRI. Полученные таким образом фрагменты плазмиды анализируются с помощью электрофореза на агарозном геле, подтверждая введение плазмиды pIPT4 в штамм LBA4404 A. tumefaciens.

III Введение pIPT4 из Agrobacterium в табак
Сформировавшиеся листья табака (Nicotiana tabacum cv. xanthi, здесь и далее табак означает эту разновидность, если не указано иначе), выращенного в теплице, погружаются в 1 об./об.% водный раствор гипохлорита натрия для стерилизации и 3 раза промываются стерильной водой. Затем главная жилка листа удаляется, образуя пластинки листьев площадью приблизительно 8 мм кв. Полученные таким образом пластинки листа погружаются приблизительно на 1 минуту в клеточную суспензию штамма LBA4404 A. tumefaciens с введением pIPT4, как описано выше на стадии II, и инфицируются им (данная суспензия разбавляется с помощью стерилизованной воды при OD₆₃₀ = 0,25 после культивирования на протяжении ночи в жидкой культурной среде YEB). Инфицированная пластинка листа помещается на стерилизованную фильтровальную бумагу с целью удаления лишней клеточной суспензии. Затем она кладется на агарную культурную среду MS, не содержащую гормонов (T. Murashige и F. Skoog, Physiol, Plant. , vol. 15, p. 473, 1962 (при условии, что к ней добавляется 0,8 вес. /об. % агара)), содержащую 50 мг/л ацетосирингона, обратной стороной листа вверх, и культивируется в течение 3 дней при 25^oC и полном освещении (культивирование экс-растения, ткани растения и растения проводились при таких температурных и световых условиях, если не указано иначе). Культивированная таким образом листовая пластинка затем пересаживается в агарную культурную среду MS, не содержащую гормонов и содержащую только 500 мг/л карбенициллина, и культивирование продолжается. В результате были трансдифференцированы 22 добавочных побега. Эти добавочные побеги были отделены, а затем культивированы в культурной среде, имеющей вышеуказанный состав с целью получения 6 линий экстремальных фенотипов побегов (ЭФП). Эти линии ЭФП каждый месяц пересеиваются в ту же культурную среду, и 3 месяца спустя после инфицирования они пересеивались в агарную культурную среду MS, не содержащую гормонов и карбенициллина. После прекращения пролиферации Agrobacterium проводятся тесты на сопротивление канамицину и анализ полимеразной реакции синтеза цепи.

IV. Анализ табака, в который был введен ген
A. Тест на сопротивление канамицину
6 Линий ЭФП, полученных на вышеописанной стадии III, культивировались как таковые без пересева. Листья, развившиеся из этих линий ЭФП, вырезались с целью образования листовых пластинок, имеющих площадь приблизительно 3 мм кв. Полученные таким образом листовые пластинки кладутся на агарную культурную среду MS (1 мг/л бензил аденина и 0,2 мг/л α -нафталиновой уксусной кислоты добавляются к указанной среде), содержащую 200 мг/л канамицина. После культивирования в этом канамицине, содержащем культурную среду, в течение 1 месяца на листовых пластинках, полученных от ЭФП линий, также наблюдалось образование указанных линий.

B. Анализ полимеразной реакции синтеза цепи
Из всех 6 линий ЭФП, полученных на вышеописанной стадии III, были экстрагированы хромосомные ДНК, и гены, введенные в них, анализировались с помощью метода полимеразной реакции синтеза цепи.

Хромосомные ДНК экстрагировались с использованием следующего модифицированного метода СТАВ.

Сначала приблизительно 1 г листьев, полученных из ЭФП, измельчались в жидком азоте с использованием охлажденных ступки и пестика и суспендировались в 5 мл буферного раствора (содержащего 2 вес./об.% СТАВ (гексадецилтриметиламмоний бромид), 1,4-М NaCl, 0,2 об./об.% β -меркаптоэтанола, 20-мМ ЭДТА и 100-мМ Tris-HCl (pH 8,0), который нагревался до 60^oC. Эта суспензия нагревалась при 60^oC в течение 30-60 минут при осторожном потряхивании, а затем охлаждалась до комнатной температуры. К этой суспензии добавлялась смесь хлороформа и изоамилового спирта (24:1) в равной пропорции, и смесь осторожно перемешивалась. Затем смесь подвергалась центрифугированию при 1600·g в течение 5 минут для получения верхнего слоя. Далее к верхнему слою добавлялось 2/3 объема изопропилового спирта и смесь вновь осторожно перемешивалась. Смесь выдерживалась на льду в течение 10 минут с целью осаждения хромосомной ДНК. Эта хромосомная ДНК собиралась с помощью центрифугирования при 1600 · g в течение 10 минут. Собранная таким образом хромосомная ДНК промывалась 70 об./об. этанола, затем высушивалась в вакууме и растворялась в 300 μл ТЕ (включающего 10-мМ Tris-HCl и 1-мМ ЭДТА).

Тем временем, с целью выявления гена ipt с помощью метода полимерзаной реакции синтеза цепи несколько используемых затравок (олигонуклеотид) синтезировались на синтезаторе ДНК (производства Applied Biosystems Co.). Во время связывания с геном ipt расстояние между двумя затравками стало приблизительно 800 bp. С целью амплификации гена ipt, 1 μг экстрагированный хромосомный ДНК растворялись в 50 μл смешанного раствора, содержащего 0,2 μМ этих затравок, 10-мМ Tris-HCl (pH 8,8 при 25^oC), 50-мМ KCl, 1,5-мМ MgCl₂, 1 вес./об.% Triton X-100, 0,1-мМ dNTP и 1.25 единиц полимеразы Tag (полученной от CETUS Co). После нагревания смеси при 94^oC в течение 1,5 минут цикл нагревания, состоящий из трех частей, а именно: при 94^oC в течение 1 минуты, при 55^oC в течение 2 минут и при 72^oC в течение 3 минут, повторялся в целом 30 раз с целью завершения реакции. Полученная агарозная смесь анализировалась с помощью электрофореза на агарозном геле с целью выявления присутствия гена ipt в хромосомном ДНК путем амплификации гена приблизительно до 800 bp.

Результаты показаны на фиг. 6. Как видно из фиг. 6, амплификация гена приблизительно до 800 bp наблюдалась во всех 6 ЭФП. На фиг. 6 величины, показанные с левой стороны, означают длину оснований, ингредиенты полосы которых были выявлены при электрофорезе маркера размера ДНК.

Сравнительный пример 1
Анализу подвергались 16 побегов, которые были не в состоянии образовать ЭФП и были получены из добавочных побегов, трансдифференцированных от листа, инфицированного A. tumefaciens, как описано на стадии III пример 1. Т.е. одновременно культивировалось 22 добавочных побега, и 6 линий ЭФП отбирались на стадии III примера 1. Морфологически нормальные побеги (в дальнейшем обозначаемые как не-ЭФП) освобождались от A. tumafaciens и подвергались тесту на сопротивляемость канамицину таким же образом, как и на стадиях III и IV примера 1. Далее, 9 линий не-ЭФП подвергались анализу полимеразной реакции синтеза цепи. Однако приблизительно через 3 месяца пластинки листьев этих линий не-ЭФП, положенные на культурную среду, содержащую канамицин, все стали коричневыми и завяли. Далее, в результате анализа полимеразной реакции синтеза цепи амплификация фрагмента ДНК приблизительно до 800 bp, доказывающая присутствие гена ipt, не обнаруживалась ни в одной из 9 анализируемых линий.

Результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи показаны на фиг. 6.

Пример 2
I. Конструкция вектора
Плазмида pHSG398 (полученная от Tаkara Shuzo Co., Ltd.) подвергалась гидролизации с помощью рестрикционной эндонуклеазы BamHI. Когезионные концы, полученные гидролизацией, изменялись на "тупые" концы с помощью полимеразы T4ДНК (большая подъединица), и посредством лигирования этих окончаний была получена плазмида pNPI100. Т.е. pNPI100 - это pHSG398, потерявшая рестрикционный сайт эндонуклеазы BamHI. Тем временем, плазмида pCKR97 (T. Izawa et al. , Mol. Gen. Genet., vol. 227, p. 391, 1991) гидролизовалась с помощью рестрикционной эндонуклеазы PstI. Для получения плазмиды pNPI102, транспозон Ac кукурузы вырезался и вставлялся в сайт рестрикционной эндонуклеазы PstI плазмиды pNPI100.

Затем из плазмиды pIPT4, конструированной в соответствии с примером 1, вырезались промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты и соединенный с ним ген ipt с помощью рестрикционных эндонуклеаз HindIII и SacI. Когезионные концы полученного таким образом фрагмента изменялись на "тупые" концы с помощью полимеразы I T4ДНК, и фрагмент вставлялся в сайт рестрикционной эндонуклеазы HincII плазмиды pUC119 с целью получения плазмиды pNPI101. Из этой плазмиды pNPI101 опять вырезались промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты и ген ipt с помощью рестрикционных эндонуклеаз PstI и EcoRI, и когезионные концы фрагмента менялись на "тупые" концы с помощью полимеразы I T4ДНК. Далее, плазмида pNPI103 получалась путем лигирования фрагмента в "тупой" конец сайта эндонуклеазы BamHI плазмиды pNPI102. Т.е. в плазмиде pNPI103 промотор 35S и связанный с ним ген ipt присутствовали в сайте старой рестрикционной эндонуклеазы BamHI внутри транспозона Ac.

Желаемый вектор получался путем вырезания транспозона Ac, содержащего промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты и ген ipt, из плазмиды pNPI103 с рестрикционной эндонуклеазой PstI и вставления этого траспозона Ac в сайт рестрикционной эндонуклеазы SseI векторной плазмиды pBI121, которая обозначалась как плазмида pNPI106.

Эта плазмида pNPI106 также вводилась в штамм E. coli JM109 и депонировалась в соответствии с Будапештским договором как E. coli JM109 (pNPI106) под депозитным N FERM BP-5064.

Процедура конструирования плазмиды pNPI106 схематически представлена на фиг. 7 - 9. Карта рестрикционной эндонуклеазы участка Т-ДНК данной эндонуклеазы показана на фиг. 10. На фиг. 7 - 9 и 10 концевой участок транспозона Ac показан противоположными черными треугольниками соответственно. На фиг. 10 Ac-P представлен нативный промотор, присутствующий внутри Ac. Другие символы имеют такое же значение, как и символы, показанные на фиг. 2 - 5.

Как видно на фиг. 10, эта плазмида содержит ген ipt в качестве селективного гена-маркера, а ген NPTII и ген GUS (β-галактозидаза) - в качестве модели желаемого гена на участке Т-ДНК, а именно на участке, вводимом в хромосому растения. Далее, ген ipt присутствует при вставлении внутрь транспозона Ac. Поскольку клетка, содержащая ген GUS, метаболизирует специальный субстрат, вырабатывающий голубой пигмент, экспрессия гена может быть выявлена путем обнаружения этого пигмента. Таким образом, ген GUS часто используется для анализа экспрессии гена в растении.

II. Введение pNPI106 в табак и анализ табака, в который был введен ген
A. Введение pNPI106 в табак и тест на экспрессию введенного гена
Таким же образом, как и на стадиях II и III примера 1, pNPI106 вводился в штамм A. tumefaciens LBA4404 и пластинки листьев табака инфицировались A. tumefaciens. Инфицированный таким образом лист табака культивировался в агарной культурной среде MS, не содержащей гормонов и содержащей 50 мг/л ацетосирингона, а затем в агарной культурной среде MS, не содержащей гормонов, к которой добавлялись 500 мг/л карбенициллина. Через два месяца после такого культивирования 63 линии ЭФП отделялись.

Эти линии ЭФП пересаживались в культурную среду, имеющую такой же состав (свободная от гормонов агарная культуральная среда MS, содержащая 500 мг/л карбенициллина). Месяц спустя, из слегка выросших побегов ЭФП визуально отбирались 9 побегов (побеги, выросшие из ЭФП, в дальнейшем называются просто "побеги"), которые выросли приблизительно в два и три раза по сравнению с другими побегами, в которых не наблюдался рост боковых побегов и в которых влияние гена ipt выглядело пониженным. Листья этих побегов подвергались такому же тесту на сопротивляемость канамицину, как описано на стадии IV-A примера 1, и тесту на экспрессию гена GUS (тест на активность GUS), основанному на методе Jefferson et al. Побеги, полученные после обрезания листьев, пересаживаются в агарную культурную среду MS, не содержащую гормонов, и культивировались. Через месяц их форма изучалась с целью выявления способности образования на побегах ЭФП, обнаруживая таким образом экспрессию гена ipt.

Результаты показаны в таблице 1.

Как видно из таблицы 1, хотя лист побега N 8 обладает сопротивляемостью канамицину и активностью GUS, ЭФП не образуется, даже если побег культивируется в течение 1 месяца. Предпочтительно, это происходит потому, что ген ipt, вызывающий образование ЭФП, присутствует во введенной форме внутри транспозона Ac в плазмиде pNPI106. Это означает, что ген ipt, введенный в хромосому табака путем инфицирования с помощью A. tumefaciens, содержащего эту плазмиду в ткани и экспрессированного на начальной стадии культивирования ткани сразу после инфицирования, удаляется вместе с Ac благодаря действию Ac во время последующего культивирования. Тем временем, в том же векторе ген NPTII и ген GUS вводятся в такую позицию, в которой они не действуют так же, как и Ac, таким образом, эти гены все еще остаются в хромосоме растения и экспрессируются.

В таблице 1, несмотря на то, что сопротивляемость канамицину и способность к образованию ЭФП наблюдаются в побегах NN 3, 5 и 6, только активность GUS является отрицательной. Это означает, что в этих побегах только ген GUS из генов, введенных с использованием pNPI106, не экспрессируется. Это, возможно, произошло благодаря ошибочной интеграции, имевшей место при интегрировании этих генов в хромосому растения. Т.е., когда ген вводится через A. tumefaciens, содержащую плазмиду, имеющую структуру pNPI106 или подобную ей, участок Т-ДНК, а именно весь внутренний участок между сайтом RB и сайтом LB, должен нормально интегрироваться в хромосому растения. Однако этот участок иногда интегрирован не полностью, а поврежден, в результате этого вводится неполноценный участок, лишенный части концов LB. На участке Т-ДНК плазмиды pNPI106 ген находится на самой близкой позиции к сайту LB. Соответственно, считается, что благодаря ошибочной интеграции при введении гена, ген GUS интегрируется в хромосому в разорванном на части виде и потеряв свою собственную функцию, или ген GUS вообще не вставляется в нее, таким образом, указанный ген не экспрессируется в данных побегах и его активность не наблюдается.

Фотография побегов N 2 и 8 через 1 месяц культивирования показана на фиг. 11 и 12.

С учетом роста листьев побега N 8 и проведенного теста на сопротивляемость канамицину культивирование после теста продолжалось далее. Из этого листа было получено 5 добавочных побегов, и все эти побеги были не-ЭФП.

B. Анализ полимеразной реакции синтеза цепи
Побеги 1 - 9 в таблице 1 после определения способности формирования ЭФП подвергались анализу полимеразной реакции синтеза цепи таким же образом, как и на стадии IV-B примера 1 с целью дальнейшего исследования присутствия гена ipt в хромосоме, при условии запрограммированного связывания пары затравок с геном NPTII и геном GUS соответственно, помимо затравок, использованных на этапе IV-B примера 1. В случае использования этих затравок при эксцизировании вставленных генов Ac и ipt (комплекс генов Ac-ipt) из участка Т-ДНК pNPI106 фрагмент ДНК, имеющий приблизительно 3 kd, амплифицируется в полимерной реакции синтеза цепи. Соответственно, путем использования такой амплификации в качестве индекса можно определить эксцезию комплекса генов Ac-ipt из ДНК.

Результаты анализа полимеразной реакции синтеза цепи побега N 8 показаны на фиг. 13, где величины, обозначенные слева, имеют такие же значения, как и на фиг. 6. Как следует из результатов, в хромосомной ДНК, экстрагированной из побега N 8, наблюдается амплификация фрагмента ДНК, составляющая приблизительно 3 kb, что доказывает эксцезию комплекса генов Ac-ipt, в то время как амплификация фрагмента ДНК, составляющей приблизительно 800 bp, подтверждающей наличие гена ipt, не наблюдается. Это означает, что ген ipt эксцизируется из хромосомной ДНК этого побега вместе с Ac и исчезает.

С другой стороны, относительно побегов NN 1-7 и 9, амплификация фрагмента ДНК, составляющая приблизительно 3 kb, не обнаруживалась ни в одном из его образцов хромосомной ДНК. Соответственно, считается, что в этих побегах ген ipt все еще присутствует в хромосомной ДНК наряду с Ac.

Сравнительный пример 2
При культивировании листьев, инфицированных A. tumefaciens, на стадии II-A примера 2; 3 не-ЭФП, трансдифференцированные наряду с ЭФП, отделялись и подвергались тесту на сопротивляемость канамицину, тесту на активность GUS, визуальному наблюдению после месячного культивирования и анализу полимеразной реакции синтеза цепи таким же образом, как и в п. II пример 2.

Результаты показаны в таблице 1. Побеги, полученные из этих не-ЭФП, не обладают никакой резистентностью к канамицину, активностью GUS и способностью к образованию ЭФП. Кроме того, в результате анализа полимеразной реакции синтеза цепи амплификация фрагментов ДНК, составляющая приблизительно 800 bp и приблизительно 3 kb, не обнаружилась.

Пример 3
Далее, культивирование 63 линий ЭФП, отделенных в примере 2, продолжалось в агарной культурной среде MS, не содержащей гормонов. Приблизительно через два месяца после отделения, в целом от двух линий ЭФП было получено 7 побегов NN 13-1, 13-2, 13-3 и от 14-1 до 14-4, которые были нормальными и могли быть идентифицированы визуально, т.е. имели верхушечную доминанту. Эти побеги отделялись для пересадки в культурную среду, имеющую вышеуказанный состав, они все имели нормальный рост и корни. Из них побеги 13-1 и 14-1 подвергались анализу полимеразной реакции синтеза цепи, как описано на стадии II-B пример 2. В результате амплификация фрагмента ДНК, составляющая приблизительно 800 bp, не наблюдалась ни в одном из побегов NN 13-1 и 14-1. Между тем, амплификация фрагмента ДНК, составляющая приблизительно 3 kb, наблюдалась в обоих побегах. Таким образом было определено, что ген ipt эксцизировался из хромосомной ДНК этих побегов наряду с Ac и исчез. Результаты показаны на фиг. 14, где величины, обозначенные слева, имеют такое же значение, как и на фиг. 6. Далее, экспрессия гена GUS определялись во всех материалах, полученных от 7 побегов.

Фиг. 15 показывает состояние нормального побега, дифференцированного от ЭФП.

Пример 4.

Лист, полученный от побега, показанного как побег N 7 в таблице 1, среди 9 побегов, отобранных в примере 2, культивировался в агарной культурной среде MS, не содержащей гормонов, в течение приблизительно 1 месяца. Один нормальный побег визуально отбирался и отделялся от 6 добавочных побегов, которые трансдифференцировались от культивированного листа. Этот нормальный побег переносился в культурную среду, имеющую вышеуказанный состав, затем получался побег, имеющий нормальную длину и корни. Далее этот побег подвергался анализу полимеразной реакции синтеза цепи таким же образом, как описано на стадии II-B примера 2, и на основании фрагмента ДНК, имеющего приблизительно 800 bp, и амплификации фрагмента ДНК, составляющей приблизительно 3kb, было установлено, что ген ipt был эксцизирован из хромосомной ДНК наряду с Ac и исчез. Результаты показаны на фиг. 16, где величины, обозначенные слева, имеют такое же значение, как и на фиг. 6. Затем в этих же материалах также обнаруживалась экспрессия гена GUS.

Пример 5
1. Отделение сайт-специфичной рекомбинантной системы (системы pSR1) от дрожжей.

Дрожжи (Zygosaccharomyces rouxii) (полученные из Института ферментации) инокулировались в 5 мл жидкой культурной среды YPAD (содержащей 10 г/л дрожжевого экстракта, 20 г/л полипептона, 0,4 г/л аденина и 20 г/л глюкозы) и культивировались при 30^oC в течение 24 часов. Раствор культуры подвергался центрифугированию при 6900 · g в течение 3 минут при 20^oC с целью сбора клеток (в дальнейшем клетки собирались при таких же условиях). Полученные клетки суспендировались в 2 мл раствора, содержащего 0,2-М Tris-HCl (pH 8,0) и 5 об./об.% меркаптоэтанола. Клеточная суспензия выдерживалась при 25^oC в течение 30 минут при осторожном нечастом помешивании, а затем клетки собирались. Далее собранные клетки суспендировались в 1 мл раствора (pH 6,8), содержащего 2,5 мг/мл Zaimolyeis-20T (полученного от SEIKAGAKU CORPORATION), 10 вес./об.% сорбита и 5 вес./об.% KPO₄. Суспензия выдерживалась при 30^oC в течение 90 минут, вновь подвергалась центрифугированию, для того чтобы опять собрать клетки. Собранные клетки вновь суспендировались в 1 мл раствора, содержащего 0,2-М NaCl, 0,1-М ЭДТА, 5 вес./об.% додецилсульфата натрия, 50-мМ Tris-HCl (pH 8,5), к которому добавлялась протеиназа K до 20 мг/мл. Перемешанный раствор отстаивался при 60^oC в течение 1 часа, затем охлаждался до комнатной температуры и экстрагировался с помощью смеси фенола и хлороформа, а затем очищался хлороформом. К полученному таким образом супернатанту добавлялся равный объем изопропанола с целью осаждения хромосомной ДНК и плазмиды pSR1. Смесь подвергалась центрифугированию при 6900 · g в течение 10 минут при 4^oC для сбора ДНК, собранная ДНК промывалась с помощью 70 об. /об.% этанола, затем высушивалась в вакууме и растворялась в 100 μл TE.

Используя экстрагированную таким образом ДНК (смесь хромосомной ДНК и плазмиды pSR1) в качестве матрицы, с помощью метода полимеразной реакции синтеза цепи была амплифицирована только сайт-специфичная рекомбинационная система, присутствовавшая в плазмиде pSR1 (называемая в дальнейшем "системой pSR1"). Система pSR1 состоит из гена R, который представляет собой ген рекомбиназы и рекомбинационной последовательности Rs, последовательности ДНК которых уже были определены (H. Araki et al., J. Mol. Biol., vol. 182, p. 191, 1985). В соответствии с настоящим изобретением, с целью амплификации гена R были синтезированы затравка, в которой XbaI сайт рестрикционной эндонуклеазы добавлялся к позиции 5' 22 оснований, а именно оснований 5595 - 5617 в последовательности плазмиды pSR1 (5'-CCTCTAGAATGCAATTGACCAAGGARACTG-3') и затравка, в которой сайт рестрикционной эндонуклеазы SacI добавлялся к позиции 5' 22 оснований, а именно оснований 4126 - 4147 в последовательности плазмиды pSR1 (5'-CCGAGCTCTTAATCTTGTCAGGAGGTGTCA-3'). С другой стороны, с целью амплификации Rs были синтезированы две пары затравок, при этом каждая включала 30 оснований (в целом, четыре типа). Т.е. одна пара включала затравку, в которой 3 из оснований 287-316 последовательности плазмиды pSR1 были замещены и был введен сайт рестрикционной эндонуклеазы Ssel (5'-AGGATTGAGCTACTGGACGGGAATCCTGCA-3'), и затравка, в которой 4 из оснований 690 - 719 последовательности плазмиды pSR1 были замещены и были введены сайт рестрикционной эндонуклеазы HindIII и сайт рестрикционной эндонуклеазы XhoI (5'-CAACTCGAGCAATCAAAGCTTCTCGTAGTC-3'). Rs, амплифицируемый этим набором затравок был назван "Rs1". Другая пара включала затравку, в которой 3 из оснований 287 - 316 последовательности плазмиды pSR1 были замещены и были введены сайт рестрикционной эндонуклеазы XhoI и сайт рестрикционной эндонуклеазы EcoRI (5'-AGGATTGAGCTACTCGAGGGGAATTCTGGA-3'), и затравка, в которой 5 из оснований 688 - 717 последовательности плазмиды pSR1 были замещены и был введен сайт рестрикционной эндонуклеазы SseI (5'-ACTGGACCAATCCCTGCAGGTCGTAGTCAA-3'). Rs, амплифицируемый этим набором затравок, был назван "Rs2".

С целью амплификации гена R и Rs, 1 μл экстрагированного раствора ДНК добавлялся к каждой 50 μл смешанного раствора, используемого на стадии IV-B примера 1, содержащего по 0,2 μМ каждого набора затравок соответственно. Цикл нагревания, состоящий из трех частей, а именно: при 95^oC в течение 30 секунд, при 55^oC в течение 30 секунд и при 72^oC в течение 1,5 минуты, повторялся со смесью в целом до 30 раз. Полученная таким образом реакционная смесь анализировалась с помощью электролиза на агарозном геле с целью подтверждения амплификации гена R и Rs.

II. Конструкция вектора
Rs1, амплифицированный с помощью метода полимеразной реакции синтеза цепи гидролизовался посредством рестрикционных эндонуклеаз PstI и XhoI, при этом получалась плазмида pNPI126 путем вставки данного Rs1 в сайты рестрикционной эндонуклеазы PstI-XhoI pSL1180 (полученная от Pharmacia Biotech Co.).

Затем с целью устранения сайта рестрикционной эндонуклеазы EcoRI и сайта рестрикционной эндонуклеазы HindIII pHSG398 последовательно повторялась гидролизация этих рестрикционных эндонуклеаз путем изменения гидролизованных концов 2 в "тупые" концы с помощью T4 полимеразы I (большая подъединица) и лигирования "тупых" концов. Таким образом получалась плазмиды pNPI121 с устраненными сайтами рестрикционных эндонуклеаз. Плазмида pNPI127 получалась путем гидролизации Rs2, амплифицированного с помощью метода полимеразной реакции синтеза цепи посредством рестрикционных эндонуклеаз XhoI и PstI, и включения данного Rs2 в сайты рестрикционной эндонуклеазы SalI-PstI плазмиды pNPI121.

Плазмида pNPI128 получалась путем вырезания Rs1 из pNPI126 с помощью рестрикционных эндонуклеаз SmaI и SpeI и включения данного фрагмента в сайты рестрикционной эндонуклеазы SmaI-XbaI плазмиды pNPI127.

Ген R, амплифицированный с помощью метода полимеразной реакции синтеза цепи гидролизовался посредством рестрикционных эндонуклеаз XbaI и SacI и включался в сайты рестрикционной эндонуклеазы XbaI-SacI плазмиды pHSG398. Полученная таким образом плазмида обозначалась как pNPI124.

Затем pBI221 (полученная от Clontech Co.) гидролизовалась с помощью рестрикционной эндонуклеазы PstI. Гидролизованные концы изменялись на "тупые" концы, а затем лигировались вышеуказанным способом. Таким образом получалась плазмида pNPI111 с устраненными сайтами рестрикционной эндонуклеазы SseI и PstI. Затем ген R, вырезанный из pNPI125 с помощью рестрикционных эндонуклеаз XbaI и SacI, включался в сайты рестрикционной эндонуклеазы XbaI-SacI плазмиды pNPI111, замещая ген GUS с целью получения плазмиды pNPI125. Далее, промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты, ген R, связанный с промотором, и сигнал полиаденилирования синтетазы нопалина вырезались с помощью рестрикционных эндонуклеаз HindIII и EcoRI и включались в сайты рестрикционной эндонуклеазы HindIII-EcoRI плазмиды pNPI128 с целью получения плазмиды pNPI129.

pNPI101 гидролизовалась с помощью рестрикционной эндонуклеазы SmaI, и 5'-фосфолилированный линкер HindIII (полученный от Takara Shuzo Co., Ltd) включался в гидролизационный сайт с целью получения плазмиды pNPI122. Таким образом, данная pNPI122 является единственной, в которой сайт рестрикционной эндонуклеазы SmaI плазмиды pNPI101 замещался сайтом рестрикционной эндонуклеазы HindIII. Далее, pNPI122 гидролизовалась с помощью рестрикционной эндонуклеазы PstI, и гидролизованные концы изменялись на "тупые" концы и лигировались с целью получения плазмиды pNPI123 с устраненными сайтами рестрикционных эндонуклеаз SseI и PstI. Из этой плазмиды вырезались промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты и ген ipt с помощью рестрикционной эндонуклеазы HindIII и включались в сайт рестрикционной эндонуклеазы HindIII плазмиды pNPI129 с целью получения плазмиды pNPI130.

Желаемый вектор получался путем вырезания фрагмента, содержащего ген ipt, и гена R, промотора 35S мозаичного вируса цветной капусты, связанного с ними соответственно, и Rs, присутствующих на обоих терминалах этих генов, с помощью рестрикционной эндонуклеазы PstI и включения этого фрагмента в сайт рестрикционной эндонуклеазы SseI плазмиды pBI121. Полученная таким образом плазмида обозначалась как pNPI132.

Плазмида pNPI132 также вводилась в штамм E.coli JM109 и депонировалась в соответствии с Будапештским договором как E. coli JM109 (pNPI132) под депозитным N FERM BP-5065.

Процедура конструирования плазмиды pNPI132 схематически показана на фиг. 17-19. Карта рестрикционной эндонуклеазы ее участка Т-ДНК показана на фиг. 20. На фиг. 17-19 и 20 заштрихованный треугольник означает рекомбинационную последовательность Rs, полученную из плазмиды pSR1 дрожжей и направление ее последовательности. Другие символы имеют значения, показанные на фиг. 2-5.

Как следует из фиг. 20, плазмида pNPI132 является такой же, как и плазмида pNPI106; она имеет ген ipt в качестве селективного гена-маркера, ген NPTII и ген GUS в качестве моделей желаемого гена на участке Т-ДНК. Однако в данном случае участок между двумя рекомбинационными последовательностями Rs системы pSR1 ведет себя как удаляемый элемент ДНК. Поэтому ген ipt вставляется таким образом, что он удерживается двумя рекомбинационными последовательностями, имеющими одинаковое направление.

III. Введение pNPI132 в табак и анализ табака, в который был введен ген
Таким же способом, как на стадиях II и III примера 1, плазмида pNPI132 вводилась в штамм A. tumefaciens LBA4404, и пластинка листа табака (Nicotiniana tabacum cv. SR1) инфицировалась с помощью данного A. tumefaciens. Затем инфицированные листья культивировались в агарной культурной среде MS, свободной от гормонов и содержащей 50 мг/л ацетосирингона, а затем в агарной культурной среде MS, свободной от гормонов и содержащей 500 мг/л карбенициллина.

Месяц спустя культивированные листья переносились в культурную среду, имеющую такой же состав, и культивирование продолжалось далее в течение 1 месяца. Затем отделялись 48 линий экстремальных фенотипов побегов (ЭФП).

Эти линии ЭФП вновь пересаживались в культурную среду, имеющую такой же состав, и культивирование продолжалось далее. Приблизительно месяц спустя (т.е. приблизительно через 3 месяца после инфицирования с помощью A. tumefaciens) побеги, морфология которых визуально определялась как нормальная, генерировались из семи из 48 линий ЭФП. Эти побеги отделялись и пересаживались в культурную среду, имеющую такой же состав, с целью получения 10 нормальных индивидуумов.

Эти индивидуумы подвергались анализу полимеразной реакции синтеза цепи таким же способом, как и на стадии II-B примера 2, при условии, что пара затравок для определения гена GUS использовалась в дополнение к добавкам, применяемым на стадии II-B примера 2. Проводя полимеразную реакцию синтеза цепи с использованием указанных затравок, фрагмент ДНК, имеющий приблизительно 800 bp, амплифицировался при наличии гена ipt. Фрагмент ДНК, имеющий приблизительно 3 kb, амплифицировался, когда ген ipt эксцизировался на участке Т-ДНК плазмиды pNPI132 путем эксцизирования части, удерживаемой Rs's (данные результаты являются такими же, как и результаты анализа стадии II-B примера 2). Фрагмент ДНК, имеющий приблизительно 1,7 kb, амплифицировался при наличии гена GUS. Результаты показаны на фиг. 21-23 и в таблице 2. На фиг. 21-23, величины, обозначенные слева, имеют такие же значения, как и на фиг. 6.

Как следует из таблицы 2, присутствие гена ipt, который является селективным геном-маркером, не обнаруживалось ни в каких хромосомных индивидуумов, которые отбирались путем простого визуального изучения их морфологии, и напротив, выявлялась амплификация фрагмента ДНК, которая означает эксцизию гена ipt. Вместе с тем, присутствие гена GUS, используемого в качестве желаемого гена, обнаруживалось во всех индивидуумах.

С другой стороны, сопротивляемость канамицину определялась путем использования терминальных почек индивидуумов, которые были получены из не-ЭФП, дифференцирующих почти одновременно с 48 линиями ЭФП и показавших нормальную длину и корни при использовании свободной от гормонов агарной среды MS, содержащей 200 мг/л канамицина. В результате было найдено, что 2 из 16 индивидуумов имеют резистентность к канамицину.

Далее, эти индивидуумы, резистентные к канамицину, исследовались дальше путем анализа полимеразной реакции синтеза цепи вместе с тремя индивидуумами, выбранными среди 14 индивидуумов, сенситивных к канамицину, таким же образом, как и индивидуумы, полученные из ЭФП. Фиг. 24 показывает результаты, где величины, обозначенные слева, имеют такие же значения, как на фиг. 6.

Как ясно видно на фиг. 24, каждый из двух резистентных к канамицину индивидуумов показал амплификацию фрагмента ДНК, что означает эксцизию участка, содержащего ген ipt и удерживаемого с помощью Rs, и присутствие гена GUS. Таким образом было доказано, что гены, возникшие в pNPI132, были интегрированы в эти хромосомы. Напротив, такая амплификация не наблюдалась в трех индивидуумах, сенситивных к канамицину. Далее, любой из этих индивидуумов (а именно, ни индивидуумы, резистивные к канамицину, ни индивидуумы, сенситивные к канамицину) показал амплификацию фрагмента ДНК, что означает присутствие гена ipt.

Предполагается, что эти индивидуумы, резистентные к канамицину, полученные из штамма, неспособного к образованию ЭФП, так же как и индивидуумы, сенситивные к канамицину, возникли в клетках, в хромосомы которых pNPI132 не был введен при инфицировании с помощью A. tumefaciens. Основываясь на этом предположении, невероятно, чтобы гены, возникающие в этом секторе, содержались в хромосомах. Более того, нецелесообразно, чтобы индивидуумы, не содержащие гена ipt, но содержащие ген NPTII (что подтверждается фактом, что эти индивидуумы резистентны к канамицину) и ген GUS каждый в полной форме в хромосомах, появлялись с такой частотой с учетом того, что эти векторы возникают в одном и том же векторе.

В частности, целесообразно сделать вывод о том, что в этих индивидуумах, резистентных к канамицину, pNPI132 была когда-то введена в хромосомы. Другими словами, предполагается, что Т-ДНК участок pNPI132 был когда-то введен в хромосому благодаря инфекции A. tumefaciens, но слишком эффективная функция системы pSR1, используемая для данного вектора, индуцировала эксцизию гена ipt до образования ЭФП вслед за инфекцией A.tumefaciens. В результате ген NPTII и ген GUS эксклюзивно остались в хромосоме. Тот факт, что анализ полимеразной реакции синтеза цепи показал индивидуумы, резистентные к канамицину, эксцизия участка, содержащего ген ipt и удерживаемого Rs, также подтверждает это предположение.

Пример 6
I. Конструкция вектора
Гены rol (S. Kiyokawa, Plant Physiol., vol. 104, p. 801, 1994), содержащие rolA, rolB и rolC и имеющие общий размер, составляющий 7,6 kb, которые были включены в сайт рестрикционной эндонуклеазы EcoRI плазмиды pBluescriptII SK+ (производство Toyobo Co., Ltd), вырезались с помощью рестрикционной эндонуклеазы EcoRI. Это фрагмент включался в сайт рестрикционной эндонуклеазы EcoRI плазмиды pNPI129 с целью производства плазмиды pNPI700.

Из этой плазмиды pNPI700 с помощью рестрикционной эндонуклеазы вырезались промотор 35S мозаичного вируса цветной капусты, ген R, связанный с промотором, и Rs, присутствующие на обоих терминалах этих генов, и включались в сайт рестрикционной эндонуклеазы SseI плазмиды pBI131 с целью получения желаемой плазмиды pNPI702.

Эта плазмида pNPI702 также вводилась в штамм E. coli JM109 и депонировалась в соответствии с Будапештским соглашением как E. coli JM109 (pNPI702) под депозитарным N BP-5066.

Процедура конструирования плазмиды pNPI702 схематически показана на фиг. 25. Карта рестрикционной эндонуклеазы ее участка Т-ДНК показана на фиг. 26. Символы на фиг. 25 и 26 имеют такое же значение, как и символы на фиг. 2 - 5.

Как следует из фиг. 26, плазмида pNPI702 подобна плазмиде pNPI132, за исключением того, что ген ipt селективного маркера заменен на гены rol. Гены rol, используемые в данном векторе, присутствуют в Т-ДНК A. rhisogenes в природе. Известно, что, когда гены rol вводятся в клетки растений, в ткани растения образуются волосяные корни и что растение, регенерированное из этого волосяного корня, имеет морфологические аномальности, такие как карликовость и т.п.

II. Введение pNPI702 в табак и анализ табака, в который был введен данный ген
Таким же способом, как и на стадиях II и III примера 1, плазмида pNPI702 вводилась в штамм LBA4404 A. tumefaciens, и пластинки листьев табака инфицировались с помощью A. tumefaciens.

Инфицированная таким образом пластинка листа табака культивировалась в агарной культурной среде MS, свободной от гормонов и содержащей 50 мг/л ацетосирингона в темном месте в течение 3 дней, а затем в свободной от гормонов агарной культурной среде MS, к которой добавлялось 400 мг/л трикарциллина. Приблизительно через 15 дней после начала культивирования наблюдалась дифференциация волосяных корней. Волосяные корни отделялись один за другим и клались на индукционную культурную среду побега (агарная культурная среда MS, содержащая 0,1 мг/л α-нафталинуксусной кислоты, 2,0 мг/л бензиладенина и 400 мг/л трикарциллина). Затем из трансдифференцированных побегов отбирались 18 побегов, имеющих визуально нормальную морфологию, и подвергались анализу полимеразной реакции синтеза цепи таким же способом, как и на стадии II-B примера 2, используя затравки для определения эксцизионного участка, содержащего ген rol и удерживаемого с помощью Rs's через амплификацию фрагмента ДНК, имеющего размер приблизительно 3 kb (как и такие же затравки, используемые в примерах 2 - 5 и сравнительном примере 2), и затравки для определения генов rol через амплификацию фрагментов ДНК, имеющих размер приблизительно 1,1 kb. В результате было подтверждено, что участок, содержащий гены rol и удерживаемый Rs's, эксцизировался из хромосом 9 побегов.

Пример 7
В гибридную осину (Populus Sieboldii x Populus grandidentata) был введен ген с использованием вектора pNP1106, конструированного выше в примере 2.

Ствол гибридной осины, штамм Y63 (выращенной в экспериментальном лесу Akita Jugo chemicals Co., Ltd.), выращенный в стерилизованной колбе, разрезался на части, свободные от узлов, длиной 5 мм. Затем часть разрезалась вертикально на две половины с целью использования в качестве образца, и образец инфицировался посредством введения pNPI106 - штамма LBA4404 A. tumefaciens таким же образом, как и на стадии примера 1. После инфицирования часть ствола помещалась в свободную от гормонов модифицированную агарную культурную среду MS (содержащую 0,2 вес./об.% сахарозы и 0,8 вес./об.% агара), к которой добавлялось 40 мг/л ацетосирингона, и культивировалась в ней в течение 3 дней. Затем она пересаживалась в такую же среду, но содержащую 500 мг карбенициллина вместо ацетосирингона, и культивировалась в ней далее. Используемая модифицированная культурная среда MS, приготавливается путем изменения концентраций аммония-азота и нитрата-азота обычной культурной среды MS на 10-мМ и 30-мМ соответственно.

Приблизительно через два месяца добавочные почки, растущие на этой части, отделялись и культивировались далее в течение 2 месяцев. Таким образом было получено 6 линий ЭФП. Эти линии вновь пересевались и приблизительно через 4 месяца после этого (т.е. спустя приблизительно 8 месяцев после инфицирования с помощью A. tumefaciens) в первый раз наблюдались морфологически нормальные побеги, растущие из ЭФП. Затем эти побеги пересаживались в разбавленную на 2/3 среду MS (содержащую 2 вес./об.% сахарозы и 0,3 вес./об.% геллановой смолы), к которой добавлялось 0,05 мг/л индоломасляной кислоты, и культивировались в ней. Таким образом, 7 нормальных индивидуумов с растущими корнями были получены в целом от двух линий ЭФП в течение 10 месяцев после инфицирования A.tumefaciens.

Эти индивидуумы затем подвергались анализу полимеразной реакции синтеза цепи таким же образом, как и на стадии III примера 5. В результате, ни в одном из них не был обнаружен ген ipt. С другой стороны, среди них в двух индивидуумах было обнаружено присутствие гена GUS. Таким образом было подтверждено, что вектор в соответствии с настоящим изобретением может эффективно использоваться также и в древесных растениях.

Кстати, в 5 из оставшихся нормальных индивидуумов была обнаружена лишь часть гена GUS. Похоже, что в индивидуумах, где транспозон Ac, введенный с помощью вектора pNPI106, эксцизируется их хромосомы вместе с геном ipt, эксцизии и разрыву подвергается также ген GUS, расположенный в непосредственной близости от него.

Фиг. 27 показывает состояние нормального побега, дифференцированного от ЭФП.

Пример 8
Нормальный индивидуум (полученный через ЭФП), содержащий гены, введенные в него с помощью pNPI132 в соответствии с примером 5, подвергался далее введению генов с использованием вектора в соответствии с настоящим изобретением.

Ген GUS PNPI132 заменялся геном HPT (геном, резистентным к гигромицину). Используя полученный таким образом вектор (pNPI140, фиг. 28), указанные индивидуумы подвергались введению гена таким же образом, как и на стадиях II и III примера 1. Таким образом через 40 дней после инфицирования с помощью A. tumefaciens с введенным в них вектором, были получены 10 линий ЭФП. Эти линии ЭФП отделялись, пересаживались в культурную среду, имеющую такой же состав (свободная от гормонов агарная культурная среда MS, содержащая 500 мг/л карбенициллина), и культивировались в ней далее. В результате, спустя 20 дней после этого в одной их этих линий наблюдалась дифференциация побегов с визуально нормальной морфологией (т.е. приблизительно через два месяца после инфицирования с помощью A. tumefaciens).

Один из таким образом дифференцированных побегов подвергался анализу полимерной реакции синтеза цепи таким же образом, как и на стадиях IV-B примера 1. Результаты показаны на фиг. 29. Следует отметить, что помимо затравок, использованных на стадиях IV-B примера 1, в данном случае использовалась пара затравок, предназначенных для связывания с геном NPTII и с геном HPT, соответственно, с целью определения эксцизии участка, содержащего ген ipt и удерживаемого Rs's, от хромосомной ДНК, а также другая пара затравок для определения присутствия гена HPT (определяемого по амплификации фрагментов ДНК, составляющей приблизительно 4 kb и приблизительно 1 kb соответственно). На фиг. 29 величины, обозначенные слева, имеют такие же значения, как на фиг. 6.

Как ясно видно на фиг. 29, в результате анализа полимерной реакции цепи, хромосомная ДНК, экстрагированная из побега, показала амплификацию фрагмента ДНК, составляющую приблизительно 4 kb, что означает, что ген ipt был эксцизирован через эксцизию участка, удерживаемого Rs's, а также амплификацию фрагмента ДНК, составляющую приблизительно 1 kb, что означает присутствие гена HPT. С другой стороны, амплификация фрагмента ДНК, составляющая приблизительно 800 bp, что означает присутствие гена ipt в этой же ДНК, не обнаружилась. Эти результаты предполагают, что ген ipt, который был когда-то введен в хромосомную ДНК данного побега, эксцизировался из нее через эксцизию участка, удерживаемого Rs's, и таким образом исчез, в то время как ген HPT остался в ДНК. Другими словами, индивидуум, введенный с желаемым геном (т.е. ген NPTII и ген GUS) с помощью pNPI132 вводился далее с новым желаемым геном (т. е. геном HPT), посредством использования вектора, в котором конструкция, относящаяся к желаемому гену, эксклюзивно изменялась (т.е. тот же ген ipt использовался как селективный ген-маркер) при этом культивирование, визуальный отбор и отделение обычно повторялись. Более того, результаты показали возможность введения третьего, четвертого или более желаемых генов с использованием одного и того же селективного гена-маркера.

Как следует из вышеописанных примеров, полученные линии ЭФП всегда содержали внутри своих хромосом ген ipt, как показано на фиг. 6. Далее, ЭФП, показавшие существенную морфологическую аномальность, идентифицируемую визуально, без исключения, проявили резистентность к канамицину путем экспрессирования гена NPRII, котоырй представлял собой желаемый ген в качестве модели и был введен вместе с геном ipt. Это доказывает, что такой ген MAI может полностью служить в качестве селективного гена-маркера для введения гена в растение и что вектор в соответствии с настоящим изобретением, содержащий данный ген MAI в качестве селективного гена-маркера, также может быть использован в качестве вектора для введения гена в растение.

После введения гена в растение с использованием вектора pNPI106, в который был интегрирован ген ipt внутри транспозона Ac, побег или подобная часть, потерявшая свою ЭФП-образующую способность в результате исчезновения гена ipt из хромосомы, при сохранении свойств, обеспечиваемых желаемым геном (геном NPTII и/или геном GUS), были получены из ткани, когда-то образовавшей ЭФП на начальной стадии культивирования, срезу же после операции введения гена, как показано в таблице 1 и фиг. 13, 14 и 16. Кроме того, морфология полученной таким образом ткани (т.е. побега или подобной части, потерявшей свою ЭФП-образующую способность) может быть идентифицирована, как показано на фиг. 15 и 27. Далее, после отбора, отделения и культивирования получается индивидуум, имеющий нормальную длину, корни и нормальную морфологию. Более того, ткани, которые были трасндифференцированы от ткани, полученной из побега, потерявшего свою ЭФП-образующую способность, также показали нормальную морфологию, не имея ЭФП-образующей способности. Это доказывает, что такой побег или подобная часть состояли из равномерных клеток.

Такие же результаты наблюдались при использовании гена, полученного от сайт-специфичной рекомбинационной системы, в качестве подвижного элемента ДНК и при использовании генов rol в качестве гена MAI. Это значит, что при введении гена в растение с использованием вектора, в котором конструкция, относящаяся к транспозону или транспозону и гену ipt векторов, используемых в примерах 1-4 и 7, была заменена на конструкцию, относящуюся к вышеуказанной рекомбинационной системе, и/или гена rol, как описано в примерах 5 и 6, из ткани, показавшей аномальную морфологию сразу же после введения гена, была получена морфологически нормальная ткань и растение, в котором ген MAI исчез из своей хромосомы при сохранении желаемого гена (фиг. 21-23, таблица 2). Далее, также возможно введение желаемых генов в один и тот же индивидуум различными способами, повторяя стадии введении гена, культивирования и визуального отбора путем использования вектора, в котором конструкция, относящаяся к желаемому гену исключительно изменена, в то время как один и тот же морфологический ген, вызывающий аномальность, используется в качестве селективного гена-маркера (пример 8, фиг. 29).

Соответственно, при использовании такого вектора, в котором ген MAI используется в качестве селективного гена-маркера помещаемого в такую позицию, что он действует вместе с подвижным элементом ДНК, ткань, состоящая только из клеток, в которых желаемый ген остается в хромосоме и т.п. и выполняет свою функцию, получается только путем осуществления следующих стадий: (1) культивирования клеток сразу же после операции по введению гена и визуальный отбор морфологически аномальной ткани, которая появляется во время культивирования, (2) дальнейшее культивирование указанной морфологически аномальной ткани и визуальный отбор морфологически нормальной ткани, возникающей во время культивирования. Далее, растение, состоящее только из таких клеток, может быть также получено из морфологически нормальной ткани.

Кроме того, при использовании ткани, полученной из сайт-специфической рекомбинационной системы, в качестве подвижного элемента ДНК, ввиду того, что его эксцизия произошла быстро и при довольно высокой частоте, морфологически нормальная ткань, возникшая из морфологически аномальной ткани, также может быть выявлена быстро. Многие нормальные индивидуумы были получены из нее с хорошей частотой.

Таблица 3 показывает эффективность, при которой нормальный индивидуум был получен из морфологически аномальной ткани, в том случае, когда транспозон или ткань, полученная от сайт-специфичной рекомбинационной системы, использовалась в качестве подвижного элемента ДНК в векторе в соответствии с настоящим изобретением.

В примерах 1-5, в условиях отсутствия гормонов, ткань, содержащая трансгенные клетки, пролиферировала, дифференцировала добавочный побег и регенерировала растение. Это, вероятно, объясняется действием гена ipt, который вводился в хромосому трансгенной клетки в качестве селективного гена-маркера. Т.е. путем экспрессии данного гена внутри клетки происходило перепроизводство гормона растения. Следовательно, гормон растения, выработанный в клетке, содержащей ген ipt, воздействовал не только на саму клетку с целью дифференциации ткани, такой как ЭФП или подобной ткани, но и в некоторой степени на ткань, смежную с клетками, вызывая таким образом такое же действие, как и действие, вызываемое путем искусственного добавления гормона растения к культуре среды.

В векторе в соответствии с настоящим изобретением ген MAI используется в качестве селективного гена-маркера. Поэтому при ведении гена в растение с использованием данного вектора ткань, в которую вводится желаемый ген, может быть отобрана путем культивирования клетки, подвергаемой обработке с целью введения гена, в обычной культурной среде при обычных условиях культивирования, без добавления каких-либо химических веществ для отбора, при этом образующаяся морфологически аномальная ткань может быть идентифицирована визуально. Соответственно, процедура упрощается и активность клетки растения во время отбора не уменьшается.

Далее, такой ген MAI присущ растению или вводится в него путем инфицирования бактериями и т.п. в природе. По этой причине, даже при экспрессии гена MAI внутри клетки растения, в которую был введен ген, его безопасность при попадании в человеческий организм считается достаточно высокой.

Более того, при использовании гена ipt в качестве гена MAI ткань, содержащая трансгенную клетку, пролиферировала и дифференцировала добавочный побег под действием этого гена, устраняя таким образом необходимость добавления к культурной среде гормонов растения, что обычно считается необходимым для пролиферации и дифференциации при культивировании клетки растения.

Кроме того, в данном векторе ген MAI, используемый в качестве селективного гена-маркера, вставляется в такую позицию, в которой он ведет себя так же, как и подвижный элемент ДНК, при этом селективный ген-маркер удаляется из ДНК, где этот ген присутствует и функционирует через эксцизию элемента ДНК при данном соотношении после того, как ген был введен в клетку растения, и теряет свою собственную функцию. Таким образом, только желаемый ген, занимающий такую позицию вектора, что он не ведет себя так же, как и подвижный элемент ДНК, остается в той же ДНК и сохраняет способность выполнять свою функцию. Соответственно, вектор вызывает в этой структуре многократное введение гена в определенное растение, просто изменяя порцию вводимого желаемого гена, не изменяя структуру селективного гена-маркера и пр. Таким образом, многократное введение может осуществляться неограниченное количество раз.

Более того, в данном случае потеря функции гена MAI в качестве селективного гена-маркера может быть определена визуально по морфологическому изменению трансгенной ткани, как и при введении данного гена. Поэтому ткань, состоящая только из клеток, в которой желаемый ген остается в хромосоме и т.п. один и сохраняет свою функцию, может быть отобрана легко и правильно. В результате, многократное введение гена может осуществляться с высокой эффективностью, и трансгенное растение, состоящее только из таких клеток, а именно индивидуум, свободный от воздействия селективного гена-маркера и не представляющий никакой угрозы для здоровья, вызываемой селективным геном-маркером, может быть получен без использования стадии перекрещивания.

Примечания:
Относительно указаний по депонированию микроорганизма, упоминаемого в описании изобретения:
1) FERM BP-5063
2) FERM BP-5064
3) FERM BP-5065
4) FERM BP-5066
Четыре вышеуказанных микроорганизма, имеющие депозитарные номера, одновременно депонировались в следующие депозитарии.

Название депозитария:
National Institute of Bioscience and Human-Technology Agency of Industrial Science and Technology (Osamu Suzuki, Dr., Director General)
Адрес депозитария:
1-3, Higashi 1 chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken 305 Japan
Дата депонирования: 5 апреля 1995 г.

Формула изобретения

1. Вектор для введения желаемого гена в растение, включающий указанный желаемый ген и, по крайней мере, один ген с индукцией морфологической аномальности в качестве селективного гена-маркера, причем указанный индуцирующий морфологическую аномальность ген представляет собой ген синтеза цитокинина.

2. Вектор по п.1, в котором указанный ген синтеза цитокинина представляет собой ген ipt, изопентилтрансферазы, присутствующий в Т-ДНК Agrobacterium timefaciens.

3. Вектор для введения желаемого гена в растение, включающий указанный желаемый ген, по крайней мере, один ген, индуцирующий морфологическую аномальность в качестве селективного гена-маркера и удаляемый элемент ДНК, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, размещается так, что он удаляется вместе с удаляемым элементом ДНК, и в котором указанный желаемый ген размещается так, что он не удаляется вместе с удаляемым элементом ДНК.

4. Вектор по п.3, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, присутствует внутри указанного удаляемого элемента ДНК.

5. Вектор по п.3, в котором указанный удаляемый элемент ДНК представляет собой транспозон.

6. Вектор по п.3, в котором указанный удаляемый элемент происходит из сайт-специфичной рекомбинационной системы.

7. Вектор по п.3, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, получают из микроорганизма рода Agrobacterium.

8. Вектор по п.3, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, представляет собой ген синтеза цитокинина.

9. Вектор по п.8, в котором указанный ген синтеза цитокинин представляет собой ген ipt, изопентилтрансферазы, присутствующий в Т-ДНК Agrobacterium timefaciens.

10. Вектор по п.3, в котором указанный индуцирующий морфологическую аномальность ген представляет собой, по крайней мере, один ген, выбранный из генов rol.

11. Вектор по п.10, в котором указанные гены rol включают rolA, rolB и rolC, присутствующие в Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes.

12. Способ получения трансгенного растения, свободного от воздействия селективного гена-маркера, включающий следующие стадии: (A) введение вектора в клетку растения, в котором указанный вектор включает желаемый ген, по крайней мере, один ген, индуцирующий морфологическую аномальность, в качестве селективного гена-маркера и удаляемый элемент ДНК, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, размещается так, что он удаляется вместе с удаляемым элементом ДНК, в котором указанный желаемый ген размещается так, что он не удаляется вместе с удаляемым элементом ДНК, (B) культивирование клетки растения, полученной в (A), выявление морфологически аномальной ткани растения, которая появляется во время культивирования, и отбор указанной морфологически аномальной ткани, и (C) культивирование указанной морфологически аномальной ткани, отобранной в (B), выявление морфологически нормальной ткани, возникающей во время культивирования, и отбор указанной морфологически нормальной ткани.

13. Способ по п.12, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, присутствует внутри указанного удаляемого элемента ДНК.

14. Способ по п.12, в котором указанный удаляемый элемент ДНК представляет собой транспозон.

15. Способ по п.12, в котором указанный удаляемый элемент ДНК происходит из сайт-специфичной рекомбинационной системы.

16. Способ по п.12, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, получают из микроорганизма рода Agrobacterium.

17. Способ по п.12, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, представляет собой ген синтеза цитокинина.

18. Способ по п.17, в котором указанный ген синтеза цитокинина представляет собой ген ipt, изопентилтрансферазы, присутствующий в Т-ДНК Agrobacterium timefaciens.

19. Способ по п.12, в котором указанный ген, индицирующий морфологическую аномальность, представляет собой, по крайней мере, один ген, выбранный из генов rol.

20. Способ по п.19, в котором указанные гены rol представляют собой гены rol, включающие rolA, rolB и rolC, присутствующие в Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes.

21. Способ введения, по крайней мере, двух желаемых генов в растение, включающий, по крайней мере, двукратное проведение следующих операций: (A) введение вектора в клетку растения, в котором указанный вектор включает желаемый ген, по крайней мере, один ген, индуцирующий морфологическую аномальность, в качестве селективного гена-маркера и удаляемый элемент ДНК, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, размещается так, что он удаляется вместе с удаляемым элементом ДНК, и в котором указанный желаемый ген размещается так, что он не удаляется вместе с удаляемым элементом ДНК, (B) культивирование клетки растения, полученной в (A), выявление морфологически аномальной ткани растения, возникающей во время культивирования, и отбор указанной морфологически аномальной ткани, и (C) культивирование указанной морфологически аномальной ткани, отобранной в (B), выявление морфологически нормальной ткани, возникающей во время культивирования, и отбор указанной морфологически нормальной ткани.

22. Способ по п.21, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, присутствует внутри указанного удаляемого элемента ДНК.

23. Способ по п.21, в котором указанный удаляемый элемент ДНК представляет собой транспозон.

24. Способ по п.21, в котором указанный удаляемый элемент ДНК происходит из сайт-специфичной рекомбинационной системы.

25. Способ по п.21, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, получают из микроорганизма рода Agrobacterium.

26. Способ по п.21, в котором указанный ген, индуцирующий морфологическую аномальность, представляет собой ген синтеза цитокинина.

27. Способ по п.26, в котором указанный ген синтеза цитокинина представляет собой ген ipt, изопентилтрансферазы, присутствующий в Т-ДНК Agrobacterium timefaciens.

28. Способ по п.21, в котором указанный ген, индицирующий морфологическую аномальность, представляет собой, по крайней мере, один ген, выбранный из генов rol.

29. Способ по п.28, в котором указанные гены rol представляют собой гены rol, включающие rolA, rolB и rolC, присутствующие в Т-ДНК Agrobacterium rhizogenes.

Приоритет по пунктам:
09.11.1994, по пп.1 - 3, 5 7 - 9, 12, 14, 16 - 18;
31.05.1995 по пп.6, 10 - 11, 15, 19 - 21, 23 - 29;
04.10.1995 по пп.4, 13 и 22.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32