Способ получения трансгенных растений подсолнечника

 

Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано для получения подсолнечника, устойчивого к стрессовым факторам, а также с измененным составом жирных кислот и запасных белков. Апикальные меристемы сегментов гипокотиля предварительно индуцируют в модифицированной среде MS, после чего клетки меристем подвергают бомбардировке твердыми микрочастицами. Обработка клеток Agrobacterium, несущей в составе рекомбинантной плазмиды желаемый чужеродный ген, обеспечивает придание им заданных полезных свойств. Регенерация целых растений из клеток позволяет получить подсолнечник, устойчивый к стрессовым факторам либо продуцирующий необходимые белки или жирные кислоты. 2 з. п. ф-лы, 3 табл. , 3 ил.

Изобретение относится к селекции растений и может быть использовано для создания растений подсолнечника, устойчивых к биотическим и абиотическим стрессам, а также с измененным составом жирных кислот или запасных белков.

Подсолнечник принадлежит к четырем главным масличным культурам мира, а для России является главной масличной культурой, обеспечивающей в питании населения до 30% потребляемых энергокалорий в виде растительного масла, маргаринов и жиров, произведенных на основе подсолнечного масла.

Высокоурожайные и высокомасличные сорта и линии подсолнечника в настоящее время могут быть созданы методами традиционной селекции. Однако потери урожая от неблагоприятных климатических факторов, поражения фитопатогенными микроорганизмами и насекомыми все еще очень велики. Поэтому имеется настоятельная необходимость в радикальном улучшении созданных сортов подсолнечника, увеличении их продуктивности в условиях разнообразных биотических и абиотических стрессов.

В отношении многих важных сельскохозяйственных культур задача получения растений, устойчивых к стрессовым факторам или с измененным качеством продукта, успешно решается путем использования генно-инженерных технологий. Например, в настоящее время трансгенные сорта картофеля, хлопка, риса, гибриды кукурузы, устойчивые к насекомым и гербицидам, а также сорта рапса и сои с измененным составом жирных кислот занимают десятки миллионов гектаров в США, Аргентине, Канаде и Китае. Трансгенные сорта кукурузы, устойчивые к насекомым, начинают распространяться в Европе. Хотя самые первые работы по генетической трансформации клеток растений были осуществлены именно на подсолнечнике, развитие генно-инженерных работ с подсолнечником отстает. Так, на сегодняшний день в США и странах Европы зарегистрировано 2870 полевых испытаний трансгенной кукурузы, а подсолнечника - только 29. Для России подсолнечник является наиболее рентабельной и основной масличной культурой, поэтому создание растений подсолнечника, устойчивых к разнообразным неблагоприятным условиям среды, представляется весьма важной экономической задачей.

Ограниченность полевых испытаний, проводимых с подсолнечником, объясняется недостаточными успехами в разработке эффективных методов генетической трансформации этой масличной культуры. Воспроизводимая технология генетической трансформации подсолнечника была получена значительно позже, чем для других важнейших сельскохозяйственных культур, а первые полевые испытания его трансгенных линий были начаты только в 1991 г.

Многочисленные попытки повторить первую методику трансформации подсолнечника, о которой сообщалось Everette с сотр. (Bio/Technology, 5: 1201; 1987), не увенчались успехом.

Впервые воспроизводимый способ получения трансгенного подсолнечника был опубликован в 1990 г. (В. Schrammeijer et al. , Plant Cell Report, 9: 55-60, 1990), в котором использовалась методика агробактериального переноса генов в апикальную меристему проростков. Эффективность трансформации в этом методе составляла всего лишь сотые доли процента.

В дальнейшем методика, основанная на агробактериальной инфекции, была улучшена (D. Bidney et al. , Plant Mol. Biol. , 18: 301-303, 1992) за счет того, что перед сокультивацией с агробактерией эксплант подвергался поранению бомбардированием микроскопическими частицами металла. Эффективность трансформации была доведена до 2-4%.

В 1994 году были опубликованы данные о достижении в отдельном случае, при использовании метода D. Bidney до 7% эффективности трансформации, при невысокой химерности трансформантов (N. Knittel et al, Plant Cell Report, 14: 81-86, 1994). Такой эффективности не удалось повторить никому, даже в лаборатории, в которой была проделана эта работа.

Также в начале девяностых годов R. Peerbolt из "Van der Have Research" была создана методика трансформации подсолнечника и получено несколько десятков трансгенных растений, устойчивых к гербицидам. Однако эта методика не запатентована, ее протокол сохранен авторами в тайне. Именно компаниями Van der Have и Pioneer в настоящее время ведется наиболее успешная работа по созданию трансгенных растений подсолнечника. Полевые испытания трансгенных линий, гибридов и сортов подсолнечника, устойчивых к глифосату и другим гербицидам, в течение нескольких лет проводятся этими компаниями, а в последние два года также компанией "Monsanto", в Аргентине и США. Над разработкой методов генно-инженерного улучшения подсолнечника также работают лаборатории в Страсбурге (Франция), Университете Северной Дакоты, Фарго (США), а также лаборатория клеточной инженерии растений Центра "Биоинженерия" Российской Академии Наук.

Опубликованный в научной печати метод D. Bidney et al. , помимо его невысокой эффективности, имеет еще один существенный недостаток: вследствие многоклеточности апекса семянки, а также недостатков применяемых способов селекции и регенерации трансформантов, часть полученных этим способом трансформантов имеет химерную природу, что означает, что наряду с истинно трансформированными тканями, полученные растения имеют также ткани, не несущие вводимых гетеролочных генов, что существенно затрудняет отбор в потомстве истинных трансформантов.

Как уже упоминалось выше, работа с подсолнечником как объектом культуры клеток связана со значительными трудностями и регенерация растений подсолнечника in vitro была осуществлена впервые в конце восьмидесятых - начале девяностых годов. Один из способов такой регенерации был разработан автором с сотр. в 1990 г. (SU 1720596 А1, МКИ 5 С 12 N 5/04, 1992). Согласно этому способу получение каллуса и регенерацию побегов осуществляют в один этап с использованием модифицированной среды MS (Murashige T. , Skoog F. , Phisiol Plant 15: 473-497, 1962).

В предлагаемом по данному изобретению способе получения трансгенного растения подсолнечника решается задача снижения возможности формирования химерных трансформантов, а также увеличения частоты желаемой трансформации.

Указанная задача решается тем, что в способе получения трансгенных растений подсолнечника, включающем обработку клеток меристематической ткани подсолнечника, способной к регенерации целых растений, бомбардированием их микрочастицами твердого вещества, трансформацию указанных клеток меристематической ткани сокультивированием с агробактерией, которая содержит вектор, несущий полезный или маркерный гены, а также ген устойчивости к антибиотику или гербициду, отбор трансформированных клеток и регенерацию из них целых растений, используют индукцию апикальных меристем, способных к регенерации целого растения, вызванную воздействием модифицированной среды MS (Murashige & Skoog) в культивируемых in vitro гипокотилях подсолнечника тем, что модифицированная среда MS для индуцирования клеток апикальных меристем дополнительно содержит 5 г на 1 л KNO₃ и 500 мг на 1 л гидролизата казеина, а также 0,5-1,0 БАП на 1 л среды в качестве цитокинина.

Указанная задача также решается тем, что бомбардирование клеток индуцированных апикальных меристем осуществляют частицами размером 0,7 - 2,5 мкм, при этом используют линии Agrobacterium, которые содержат вектор, несущий селективный ген, кодирующий устойчивость к антибиотикам - канамицину nptll или к гигромицину hph, или ген bar, определяющий устойчивость к гербициду Basta, а также маркерный ген uidA (GUS) или GFP и какой-либо чужеродный ген, выделенный из растения, бактерии или другого организма, полезный для производства подсолнечника или получаемого из него продукта, например ген Gly 1 - глиоксалазы 1, который повышает устойчивость трансгенных растений к стрессам (Veena et al, 1999, Plant J. . 17, 385- 396 □ □□□□□□□□□ □ □□□□□□□□□ NaCl.

Далее изобретение раскрывается более подробно со ссылками на чертежи.

На фиг. 1а и 1б показана иллюстрация индукции апексов в культивируемых сегментах гипокотиля и регенерации из них побегов; на фиг. 2а и 2б - экспрессия uidA (GUS) гена в тканях и семенах второго поколения трансгенного подсолнечника сорта Передовик улучшенный.

Далее в примерах раскрыт оптимальный вариант изобретения.

Пример 1. Получение асептических растений подсолнечника в культуре in vitro Семена подсолнечника (Helianthus annuus L. )помещают в марлевые мешочки. В нестерильных условиях семена тщательно промывают мыльной водой. Все дальнейшие операции выполняют в условиях ламинарного бокса, обеспечивающего асептические условия. Семена помещают в 70%-ный этанол на 3 мин. Промывают стерильной водой 3-5 мин. После этого семена помещают на 30 мин в 30%-ный раствор NaOCl, который приготовляют разбавлением 30 мл коммерческого отбеливателя 70 мл стерильной дистиллированной воды, добавляя 3-4 капли Twen-80. Далее 3 раза по 5 мин семена промывают стерильной водой. Семена оставляют на 30 мин в стерильной воде. Очищают семена. Очищенные семена стерилизуют в 20%-ном растворе гипохлорита в течение 3-5 мин. Трижды промывают стерильной водой, время промывок 5, 5 и 10 мин. Высаживают простерилизованные семена в пробирки, содержащие 1/2 по концентрации солей среду MS, содержащую 10% сахарозы и 0.8% агар-агара, среда имеет pH 5.7 до автоклавирования. Выращивают при освещении люминесцентными лампами, фотопериод 16/8 час при 27^oC.

Пример 2. Изоляция сегментов гипокотиля для культивирование in vitro После 5-7 дней выращивания проростки, достигшие 4-6 см, используют для получения сегментов гипокотиля. Проростки помещают в чашку Петри и скальпелем отсекают апекс побега с семядолями, нарезая низлежащую область гипокотиля на 2-3 мм сегменты, по 3-4 сегмента от каждого проростка, помещают в чашки Петри, содержащую среду SIM. В каждую чашку помещают по 30-40 сегментов. Чашки помещают под люминесцентные лампы, культивируют при 27^oC при фотопериоде 16/8 ч.

Пример 3. Индукции апикальных меристем.

Апикальные меристемы индуцировали из сегментов гипокотиля на среде SIM (Shoot Induction Media) следующего состава: макросоли, микросоли и витамины среды MS, 3% сахарозы, 0.7% агара, 500 мг/л гидролизата казеина, 6.95 г/л нитрата калия, 0.5-1.0 мг/л БАП (6фурфураминопурин). Перед автоклавированием доводили pH до 5.7 раствором NaOH. Стерилизацию среды осуществляли в автоклаве при 1.11 атмосферы в течение 25 мин. После охлаждения среды добавляли витамины и гормоны, которые стерилизовали фильтрацией через мембранные фильтры с диаметром пор 0.22 мкм. Среду разливали в чашки Петри диаметром 9 см по 25 мл в каждую. Затем в каждую чашку помещали по 36 сегментов гипокотиля и инкубировали при люминесцентном освещении, при фотопериоде 16/8 ч и температуре 26-28^oC в течение 1-3 дней.

В табл. 1 представлены данные частоты индукции апексов у различных генотипов подсолнечника, в зависимости от концентрации ВАП.

Пример 4. Бомбардирование индуцированных апексов вольфрамовыми частицами После 2-4 дней культивирования сегментов гипокотиля, когда визуально можно определить появление развивающихся апексов, последние рассекают на две части и помещают в чашки Петри на агаризированную среду MS. Апексы подвергают двукратному бомбардированию частицами вольфрама размера 0.7-2.5 мкм, используя PIG (Finer et al 1992). Для разгона частиц используются давление 6 атмосфер, вакуум в камере 0.1-0.3 атм, расстояние от источника частиц до поверхности апексов 12 см. Частицы предварительно стерилизуют 5 мин в 96%-ном этиловом спирте, трижды промывают в стерильной воде и ресуспензируют (50 мг на 500 мкл в среде SIM, используемой для индукции апексов).

Пример 5. Сокультивирование эксплантов с Agrobacterium Трансформацию осуществляли методом сокультивирования тканей апекса с ночной культурой штамма агробактерии ЕНА101, несущей вектор V035. Ночную культуру выращивали на среде LB с канамицином (50 мг/л) при 28^oC, осаждали на центрифуге при 5000 об/мин, дважды промывали, рессуспендировали в жидкой безгормональной среде до плотности OD660= 0.8-1.0. На фиг. 3 представлена карта вектора V035.

Пример 6. Селекция на среде с гигромицином Селекцию трансформантов осуществляли в течение 3-4 недель на среде, содержащей 15 мг/л гигромицина В, пересаживая ткани на свежую среду каждые 7-10 дней. После селекции тканей с развивающимися побегами, устойчивых к гигромицину, последние переносили на среду SIM для регенерации проростков.

Пример 7. Укоренение на среде для укоренения или методом прививки на побеги подсолнечника.

У побегов, достигших размера 2-3 см, индуцировали образования корней на среде для укоренения, в состав которой входят макро- и микросоли среды В5 (Gamborg et al. , 1976), индолил масличная кислота (ИМК) в концентрации 2.0 мг/л, сахароза в концентрации 10 г/л. Культивируемые побеги в течение 1-2 недель подвергали холодному шоку, понижая температуру культивирования до 14^oC. Данные, полученные для сорта Передовик представлены в табл. 2.

Второй путь получения взрослых фертильных растений - это метод прививания 3-5 мм побегов на 7-дневные проростки подсолнечника в культуре in vitro. Частота выживания прививок достигает 80%.

Пример 8. Частота трансформации Частота трансформации, полученная при использовании разработанного метода, вычислялась как отношение количества использованных эксплантов к количеству полученных трансгенных побегов, экспрессирующих маркерный ген и для которых показано встраивание гетерологинного гена в геном методами PCR и Southern блотинга. Данные ряда независимых опытов представлены в табл. 3.

Формула изобретения

1. Способ получения трансгенных растений подсолнечника, включающий обработку клеток меристематической ткани подсолнечника, способной к регенерации целых растений, бомбардированием их микрочастицами твердого вещества, трансформацию указанных клеток меристематической ткани сокультивированием с Agrobacterium, которая содержит вектор, несущий полезный или маркерный гены, а также ген устойчивости к антибиотику или гербициду, отбор трансформированных клеток и регенерацию из них целых растений, отличающийся тем, что бомбардировке микрочастицами подвергают клетки апикальных меристем, индуцированных воздействием модифицируемой среды MS в культивируемых in vitro сегментах гипокотиля.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что модифицированная среда MS для индуцирования клеток апикальных меристем дополнительно содержит 5 г/л KNO₃ и 500 мг/л гидролизата казеина, а также 0,5-1,0 мг БАП на 1 л среды в качестве цитокинина.

3. Способ по п. 1 или 2, отличающийся тем, что клетки индуцированных апикальных меристем бомбардируют частицами вольфрама размером 0,7-2,5 мкм, при этом используют линии Agrobacterium, которые содержат вектор, несущий селективный ген, кодирующий устойчивость к антибиотикам канамицину nptII или гигромицину hph, или ген bar, определяющий устойчивость к гербициду Basta, а также маркерный ген uidA (GUS) или GEP или какой-либо чужеродный ген, выделенный из растения, бактерии или другого организма, полезный для производства подсолнечника или получаемого из него продукта.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6