Белок, обладающий способностью ингибировать стимулированную коллагеном агрегацию тромбоцитов и предотвращать взаимодействие между коллагеном и vwf, способ его получения, фармкомпозиция на его основе

 

Изобретение относится к биотехнологии и медицине и может быть использовано для получения белка, способного ингибировать стимулированную коллагеном агрегацию тромбоцитов. Белок (Брандинин) имеет молекулярную массу около 15 кДа, связывается с коллагеном. Белок ингибирует связывание коллагена с тромбоцитами и их последующую активацию, которая ведет к агрегированию тромбоцитов и образованию тромбов. Белок предотвращает связывание фактора фон Виллебранда с коллагеном. Белок выделяют из неочищенных экстрактов пиявки Hirudo medicinalis путем электрофореза в полиакриламидном геле. Белок пригоден для профилактики и лечения тромболитических заболеваний. 3 с. и 1 з.п. ф-лы, 2 табл., 6 ил.

Изобретение относится к новому белку, действующему в качестве сильного ингибитора стимулированной коллагеном активации и агрегации тромбоцитов и, прежде всего, обладающего способностью предотвращать взаимодействие между коллагеном и фактором фон Виллебранда.

Нормальный гемостаз в организме людей регулируется сложным рядом взаимосвязанных механизмов, включающих как клеточные, так и гуморальные биохимические компоненты. Биохимический путь включает механизмы повреждения интактных эндотелиальных клеток, стимулирования тромбоцитов и активации коагуляции. При повреждении стенок сосудов одним из первых результатов этого является воздействие эндотелиальных клеток на кровь. Считается, что субэндотелиальный коллаген является одним из первых стимулов, которые ведут к адгезии тромбоцитов, за которой следует изменение формы, агрегации и образование тромба.

Поэтому терапевтическое воздействие на стадии адгезии тромбоцитов и/или агрегации тромбоцитов пригодно для предотвращения или лечения большинства тромботических нарушений.

Известно, что слюна пиявок содержит несколько агентов, способных ингибировать агрегацию тромбоцитов.

Так, гирудин является хорошо известным соединением (Merck index 1983, N 4613; FEBS Lett, 165, 180 (1984)). Гирудин предотвращает индуцированную тромбином агрегацию тромбоцитов связыванием с тромбином с образованием стехиометрического комплекса (1: 1). Это, в свою очередь, ингибирует катализируемое тромбином превращение фибриногена в фибрин.

В EP-A-0348208 описан низкомолекулярный антагонист фактора медиированной рецептором активации тромбоцитов, полученный из слюны Hirudinidae, обладающей способностью ингибировать агрегацию тромбоцитов, индуцированную агентами агрегации, например ФАТ-acether (ФАТ обозначает фактор активации тромбоцитов).

Коллагеназа, которая специфически разрушает коллаген посредством гидролитического разрыва пептидных связей в спиральных областях молекулы коллагена, описана в WO 87/00860.

Медицинские пиявки (Hirudino medicinalis) для предотвращения образования тромба в месте укуса используют не только гирудин. Очень ярко выраженной характеристикой укуса этой пиявки является пролонгированное кровотечение в течение от более чем 10 часов до 24 часов, тогда как гирудин, по-видимому, вымывается из раны в течение 15-30 минут. Следовательно, за этот эффект должны быть ответственны другие компоненты помимо гирудина.

Известен (WO 92/07005) белок, выделенный из Hirudo medicinalis, имеющий мол. массу 64 кДа, названный "калином" и способный предотвратить стимулированную коллагеном агрегацию тромбоцитов.

Другой низкомолекулярный (16 кДа) ингибитор индуцированной коллагеном агрегации тромбоцитов, обозначенный как LAPP, найден в Haementeria officinalis (EP-A-0480651).

Однако ни один из этих белков не воздействует на главную особенность адгезии тромбоцитов, медиированной фактором фон Виллебранда (vWF).

Этот фактор является комплексным мультимерным гликопротеином, который играет существенную роль в функции тромбоцитов. Он требуется для нормальной адгезии тромбоцитов, когда они подвергаются воздействию субэндотелия, и для нормального образования тромбоцитной закупоривающей массы в местах сосудистого повреждения. Функция vWF, в частности, важна в сосудах с небольшим диаметром, где преобладают условия высокого коэффициента стеночного сдвига. Теперь признано, что механизмы, лежащие в основе функции vWF, предусматривают взаимодействие с компонентами субэндотелия, а также со специфическими рецепторами на тромбоцитной мембране (Ruggeri et al., 1992, Meth. Enz., 215, 263-275).

Следовательно, вмешательство соответствующего белка в действие vWF должно обеспечить дополнительное преимущество при терапевтическом применении.

Таким образом задачей настоящего изобретения является создание нового белка, который является сильным ингибитором стимулированной коллагеном агрегации и адгезии тромбоцитов и который предотвращает взаимодействие между коллагеном и vWF. Задачей настоящего изобретения является также разработка способа получения чистого белка с указанными выше свойствами и разработка новой фармацевтической композиции на основе этого белка, а также разработка имплантируемого или экстракорпорального медицинского устройства, применяемого в контакте с жидкостью тела, и поверхности которого придана тромборезистентность путем покрытия ее иммобилизованным белком.

Поставленная задача достигается новым белком MM = 15 кДа, который выделяют из слюны медицинских пиявок Hirudo medicinalis.

Новый белок в соответствии с настоящим изобретением имеет молекулярную массу 14 - 15,5 кДа, предпочтительно 14 - 15,0 (в зависимости от применяемых методов) и предотвращает взаимодействие между коллагеном и vWF. В противоположность этим результатам известный LAPP имеет молекулярную массу 16 кДа и выделен из Haementeria officinalis. Влияние LAPP на vWF не доказано до сих пор. Кроме того, аминокислотные последовательности LAPP и белка настоящего изобретения (брандинин) разные.

Белок настоящего изобретения включает варианты описанного очищенного белка, которые сохраняют активность выделенного белка, включая фрагменты, субъединицы, существующие в природе мутации и случайно генерированные искусственные мутанты. Включены также гибридные белки, например слитые белки, полученные из описанного белка.

Белок выделяют и очищают, при необходимости одностадийной очисткой препаративным электрофорезом, из слюны медицинских пиявок Hirudo medicinalis. Типичный способ согласно настоящему изобретению включает реконструкцию лиофилизованной исходной слюны Hirudo medicinalis в обычной буферной системе при pH 7,5-8,5 и очистку, по меньшей мере, одной обычной хроматографической стадией, предпочтительно гельпроникающей хроматографией.

Новый белок согласно настоящему изобретению может использоваться в фармацевтических препаратах и медицинских устройствах.

Фармацевтические препараты в соответствии с изобретением могут содержать в качестве активного компонента данный белок, а также дополнительные активные компоненты, подобные антикоагулянтам, например гирудин или гепарин, или тромболитические средства, например активатор плазминогена или гементин.

Новый белок и фармацевтические препараты настоящего изобретения соответственно можно применять для лечения различных тромбоэмболических нарушений, включая венозный тромбоз, периферический артериальный тромбоз, цереброваскулярный тромбоз и инфаркт миокарда, а также для лечения пациентов с артериовенозным анастомозом или пациентов, которым наложили коронарный обходной анастомоз. Препараты можно также применять для лечения аутоиммунного заболевания, включая красную волчанку, ревматический артрит и узелковый периартериит. Препараты настоящего изобретения пригодны также для стимулирования феномена пролонгированного кровотечения, которое бывает после укуса пиявок, ими можно, следовательно, заменять, полностью или частично, пиявки в тех случаях, когда есть показания для лечения пиявками.

Новый белок в соответствии с изобретением может образовать фармацевтически пригодные соли с любой нетоксичной органической или неорганической кислотой. Неорганическими кислотами являются, например, соляная, бромистоводородная, серная или фосфорная кислота и кислые соли металлов, например вторичный кислый ортофосфат натрия и кислый сульфат калия. Примерами органических кислот являются моно-, ди- и трикарбоновые кислоты, например уксусная, гликолевая, молочная, пировиноградная, малоновая, янтарная, глутаровая, фумаровая, яблочная, винная, лимонная, аскорбиновая, малеиновая, гидроксималеиновая, бензойная, гидроксибензойная, фенилуксусная, коричная, салициловая, и сульфокислоты, например метансульфокислота. Соли имеющей концевую карбоксигруппу аминокислотной части включают нетоксичные соли карбоновых кислот, образованные с любыми подходящими неорганическими или органическими основаниями. Эти соли включают, например, соли щелочных металлов, таких как натрий или калий, щелочноземельных металлов, таких как кальций и магний, легких металлов группы IIIA, включая алюминий, и органических первичных, вторичных и третичных аминов, таких как триалкиламины, включая триэтиламин, прокаин, дибензиламин, 1-этенамин, N,N'-дибензилэтилендиамин, дигидроабиетиламин и N-алкилпиперидин.

Препараты в соответствии с изобретением можно вводить в виде унифицированных доз, содержащих обычные нетоксичные фармацевтически пригодные носители, разбавители, вспомогательные средства и наполнители, которые типичны для парентерального введения. Термин "парентеральный" включает методики подкожной, внутривенной, внутрисуставной и внутритрахеальной инъекции и инфузии. Унифицированные дозы в соответствии с изобретением могут содержать суточно необходимые количества белка настоящего изобретения или могут быть разделены на несколько частей, которые вместе образуют требуемую дозу. Оптимальная терапевтически пригодная доза для данного пациента (млекопитающих, включая людей) зависит от различных факторов, например активности применяемого специфически активного материала, возраста, массы тела, пола, питания, времени и способа введения, скорости выведения активного материала из организма и т. д. Следовательно, необходимая концентрация в крови, которая ингибирует стимулирование агрегации тромбоцитов коллагеном, предпочтительно, находится в пределах 0,1 мг/л - 50 мг/л.

Указанный выше термин "фармацевтически пригодный носитель" обозначает инертный, нетоксичный твердый или жидкий наполнитель, разбавитель или капсулирующий материал, не взаимодействующий с активным соединением или веществами организма пациента. Пригодны, предпочтительно, жидкие носители, хорошо известные в фармации, например стерильная вода, физиологический раствор, водная декстроза, растворы сахаров, этанол, гликоли и масла, включая масла нефтяного, животного, растительного или синтетического происхождения, например арахисовое масло, соевое масло и вазелиновое масло. В качестве носителей в соответствии с изобретением применяют также фармацевтически пригодные гели или кремы, пригодные для нанесения, до применения, на медицинские устройства, которые обычно изготовляют из пластмассы и синтетических волокон.

Объектом настоящего изобретения является также разработка имплантируемого или экстракорпорального медицинского устройства, которое применяют в контакте с жидкостью тела и поверхности которого придана тромборезистентность, покрытием ее иммобилизованным белком, указанным выше. Белок согласно изобретению иммобилизуют на медицинском устройстве таким образом, чтобы придать поверхности биосовместимость и тромборезистентность. Такие устройства иногда имеют смачиваемую поверхность, которая обычно идуцирует агрегирование тромбоцитов, что неблагоприятно для применяемых имплантируемых и экстракорпоральных устройств, при применении находящихся в контакте с кровью или другими жидкостями тела. Примерами таких устройств являются протезы, искусственные органы, шовный материал, искусственные сегменты сосудов, катетеры, диализаторы, трубки и сосуды, несущие кровь.

Образование покрытий на медицинских устройствах и иммобилизацию белков проводят стандартными методами (например, US 4885207).

Настоящее изобретение относится также к применению белка, указанного выше для получения лекарственного средства, предназначенного для предотвращения стимулированной коллагеном агрегации тромбоцитов и связывания vWF с коллагеном in vitro, in vivo и для экстракорпоральной обработки.

Краткое описание чертежей Фиг. 1. Очистка брандинина из слюны пиявок гельпроникающей хроматографией. Подробности приведены в примере 2. Темные заштрихованные участки указывают активные фракции. Числа (3-14) под кривой обозначают номера фракций.

Фиг. 2. Очистка брандинина электрофорезом в геле в присутствии додецилсульфоната натрия. Подробности указаны в примере 4. Отмечены номера фракций (8-12) и маркеры (М). Фракции 10 и 11 дают положительный результат при испытании по примеру 1.

Фиг. 3. Стандартная кривая коллагенолитической активности, измеренной азоколлом^R. Подробности указаны в примере 4. Вертикальная ось: оптическая плотность (OD) у 560 нм, горизонтальная ось: активность коллагеназы (мЕ/образец).

Фиг. 4a. Зависимое от дозы ингибирование стимулированной коллагеном агрегации тромбоцитов. Детали указаны в примере 5. Вертикальная ось: % агрегации, горизонтальная ось: концентрация брандинина (нМ).

Фиг. 4b. Коллагеновая специфичность ингибирования агрегирования тромбоцитов. Детали приведены в примере 5. Вертикальная ось: % агрегирования, горизонтальная ось: 1 = контрольный опыт, 2 = коллаген, 3 = АДФ.

Фиг. 5. Зависимое от дозы ингибирование связывания vWF с коллагеном. Детали приведены в примере 6. Вертикальная ось: оптическая плотность (OD) у 405 нм, горизонтальная ось: концентрация очищенного белка (нМ) очищенный белок; ....·.... контрольный w/o белок.

Следующие примеры описывают настоящее изобретение более детально.

Пример 1.

Активность белка из Hirudo medicinalis in vitro в качестве ингибитора стимулированной коллагеном агрегации тромбоцитов.

В исходной (сырой) слюне Hirudo medicinalis можно обнаружить активность, которая ингибирует зависимым от дозы образом агрегацию тромбоцитов в обогащенной тромбоцитами плазме (PRP), вызванную присутствием коллагена.

Кровь отбирают у добровольцев, конечная концентрация цитрата натрия 0,38%. Обогащенную и бедную тромбоцитами плазму получают дифференциальным центрифугированием.

Агрегацию тромбоцитов проводят в агрометре PAP-4 (Biodata) добавлением различных концентраций фирменного коллагена horm^R (Hormonchemie). В качестве параметра используют максимальную экстинкцию после добавления коллагена. Антитромбитики повышают величины.

Анализ, описанный выше, применяют на всем протяжении следующей очистки белка и для получения характеристики очищенного белка изобретения.

Пример 2.

Выделение и хроматографическая очистка белка.

Белок согласно изобретению можно выделить из исходной (сырой) слюны Hirudo medicinalis. Лиофилизованную слюну обрабатывают 20 мМ Трис-HCl, 10 мМ CaCl₂ с pH 8,0 (TC-буфер) при концентрации 20 мг/мл. Слюну вводят в колонку СМ-фрактогель^R (E. Merck, Darmstadt, FRG) и элюируют NaCl-градиентом в том же буфере. Элюированные фракции, активные в анализе на ингибирование тромбоцитов, описанном в примере 1, не обладают активностью гирудина. Конечную очистку проводят гельпроникающей хроматографией на колонке с модифицированным диолом в диоксиде кремния в 20 мМ Трис-HCl, 10 мМ CaCl₂, 200 нМ NaCl с pH 8,0 (TCN-буфере). Типичный пример этой стадии очистки представлен на фиг. 1. Выход очищенного белка относительно количества белка в исходной слюне составляет 5%. В других экспериментах выход составляет между 2 и 7%.

Пример 3.

Одностадийная очистка белка препаративным электрофорезом.

Согласно другому варианту белок можно удачно выделить в одну стадию препаративным электрофорезом. В устройстве "Prep-cell"^R (Biorad, Munich, FRG) цилиндрический полиакриламидный гель обычно с 10% акриламида полимеризуют по инструкциям изготовителя. Пробу вводят в буфер для электрофореза. В процессе электрофореза буфер двигается перпендикулярно направлению электрофореза, обеспечивая перенос элюированных белков в коллектор фракций. Фракции анализируют аналитическим электрофорезом на полиакриламиде в присутствии додецилсульфоната натрия и объединяют в соответствии с молекулярной массой 15,0 кДа. В другом измененном эксперименте определенная молекулярная масса составляет 14,5 кДа.

Пример 4.

Характеристика белка.

Очищенный белок, обладающий активностью в соответствии с примером 1, имеет молекулярную массу приблизительно 15000 D, определенную электрофорезом в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфоната натрия в условиях восстановления. На фиг. 2 показаны активные фракции, полученные типичной гельпроникающей хроматографией, описанной в примере 2. Белковые полосы на геле визуализируют серебряным окрашиванием.

Какая-либо протеолитическая активность очищенного белка с использованием предпочтительного метода определения, описанного ниже, не установлена. Казеин, ковалентно модифицированный резоруфином^R (Boehringer, Mannheim, FRG), используют в качестве субстрата с протеиназой K в качестве положительного контроля. В 50 мкл раствора 0,4% казеина добавляют меченный резоруфином 50 мкл 200 мМ Трис, 20 мМ CaCl₂ с pH 7,8 и 100 мкл раствора пробы. После инкубирования в течение до 24 часов при 37^oC реакцию прерывают добавлением 450 мкл 5% раствора трихлоруксусной кислоты. Реакционную смесь центрифугируют и 400 мкл супернатанта переносят в кювету, содержащую 600 мкл 500 мМ Трис с pH 8,8. Сразу же измеряют поглощение у 574 нм. Инкубирование в течение 24 часов показывает значительную протеолитическую активность в исходной слюне, тогда как в случае очищенного белка наблюдают величины поглощения незначительно ниже фонового уровня (таблица 1).

Кроме протеолитической активности, описанной выше, исходная слюна обладает также коллагенолитической активностью. Предпочтительный метод измерения такой активности предусматривает использование азоколла, неспецифического хромогенного субстрата коллагеназы, следующим образом. Азоколл^R (Calbiochem) суспензируют в 50 мМ Трис, 200 мМ NaCl, 0,1 Brij 35,0,01% NaN₃ с pH 8,0 (буфер A) с концентрацией 20 мг/мл и промывают дважды с центрифугированием, аспирацией и ресуспензированием. 100 мкл пробы или контрольного буфера переносят пипеткой в лунки микротитрационного планшета с 96 лунками в виде серий разбавления в буфере A, затем добавляют 100 мкл суспензии азоколла. Эту смесь инкубируют при 37^oC обычно в течение 18 часов. Для прекращения реакции непрореагировавший субстрат осаждают центрифугированием при 1000 хг в течение 10 минут. Супернатанты переносят в новый микротитрационный планшет и измеряют поглощение у 560 нм. Для получения стандартных кривых (фиг. 3) используют коллагеназу из Clostridium histolyticum (Sigma).

В таблице 2 приведены результаты типичных измерений с применением этой методики. В противоположность исходной слюне и другому белку hirulo, названному калином (WO 92/07005), которые обнаруживают активность в анализе с азоколлом, неожиданно было показано, что очищенный белок настоящего изобретения не имеет значительной коллагенолитической активности выше фоновых значений.

Пример 5.

Зависимое от дозы ингибирование агрегации тромбоцитов очищенным белком.

Обогащенную тромбоцитами плазму инкубируют 2 минуты при 37^oC с тестируемым соединением и агрегируют добавлением коллагена до конечной концентрации 1,25 мкг/мл. Белок настоящего изобретения (брандинин) имел IC₅₀ около 15 нМ. В других экспериментах получают результаты между 0,5 и 100 нМ. Неочищенный экстракт слюны проявляет способность ингибировать стимулированную коллагеном, а также стимулированную АДФ агрегацию тромбоцитов. Напротив, брандинин неэффективен при самых возможных высоких концентрациях. Детали можно увидеть на фиг. 4a и 4b.

Пример 6.

Ингибирование связывания vWF с коллагеном in vitro очищенным белком.

Кроме ингибирования непосредственного взаимодействия тромбоцитов с коллагеном очищенный белок настоящего изобретения обладает неожиданной дополнительной способностью препятствовать связывание vWF.

Это показано покрытием микротитрационного планшета с 96 лунками 5 мкг коллагена типа 1 из конского сухожилия на каждую лунку. Коллаген растворяют в 0,1 М уксусной кислоте и диализуют в течение 18 часов с применением фосфатного буфера с pH 7,2. После инкубирования 1 час при 37^oC лунки блокируют 250 мкл альбумина бычьей сыворотки в физиологическом растворе с фосфатным буфером и промывают три раза физиологическим раствором с фосфатным буфером, но без альбумина. Добавляют 25 мкл пробы, содержащей белок согласно изобретению, и затем 75 мкл плазмы человека, разбавленной в соотношении 1:80 физиологическим раствором с фосфатным буфером, содержащим 5 мМ этилендиаминтетрауксусной кислоты, 0,1% альбумина бычьей сыворотки, 0,001% твина 80 и имеющим pH 7,4, и инкубируют 2 часа при 37^oC. После еще одного промывания связанный vWF определяют при помощи 110 мкл разбавленной 1/4000 поликлональной кроличьей анти-vWF антисывороткой, конъюгированной с пероксидазой хрена обыкновенного (Dako, Copenhagen, Denmark). Антисыворотку инкубируют 1 час при 37^oC. Проявление цвета проводят ABTS в течение 30 минут при 37^oC, измеряют у 405 нм. В некоторых экспериментах, проведенных с очищенным фактором vWF (Serbio, Remagen, FRG) вместо плазмы человека, получают подобные результаты, сравнимые с экспериментом с плазмой.

Связывание vWF из плазмы и в очищенной форме можно предотвратить брандинином, очищенным белком согласно настоящему изобретению, зависимым от дозы образом. 50%-ное ингибирование в стандартных условиях достигается приблизительно 40 нМ (в пределах 0,5 нМ - 100 нМ) (фиг. 5).

Связывание брандинина с коллагеном достигается не только ингибирование взаимодействия тромбоцитов с коллагеном, но и связывание фактора фон Виллебранда с этим субэндотелиальным матричным компонентом.

Формула изобретения

1. Существенно чистый белок, обладающий способностью ингибировать стимулированную коллагеном агрегацию тромбоцитов и предотвращать взаимодействие между коллагеном и фактором фон Виллебранда (vWF), полученный из слюны медицинских пиявок Hirudo medicinalis и имеющий молекулярную массу 14 - 15,5 кДа.

2. Способ получения белка, обладающего способностью ингибировать стимулированную коллагеном агрегацию тромбоцитов и предотвращать взаимодействие между коллагеном и фактором фон Вилленбранда, отличающийся тем, что белок выделяют из слюны медицинской пиявки Hirudo medicianalis, очистку проводят в одну стадию путем препаративного электрофореза в полиакриламидном геле и белковые фракции, имеющие молекулярную массу 14 - 15,5 кДа, объединяют.

3. Фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента белок по п.1, в сочетании с одним или более фармацевтически приемлемыми носителями, наполнителями или разбавителями.

4. Фармацевтическая композиция по п.3, отличающаяся тем, что указанный носитель содержит гелевую основу или мазь, пригодную для покрытия медицинского устройства перед применением.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8