Способ получения биомассы возбудителя малярии plasmodium falciparum

 

Изобретение относится к медицинской паразитологии, к способам культивирования малярийного паразита. При культивировании Plasmodium falciparum в питательную среду RPMI - 1640, дополнительно содержащую Hepes, сыворотку, карбонат натрия, добавляют антиоксидантные ферменты - супероксиддисмутазу (СОД) и каталазу. Данные ферменты выделяют из эритроцитов крови человека. Ферменты вводят в количестве, исключающем гемолиз эритроцитов. Способ увеличивает выход паразитов, и накопление биомассы происходит за более короткий срок. 1 табл.

Изобретение относится к медицинской паразитологии, к способам культивирования малярийного паразита и может быть использовано для приготовления малярийного антигена.

Известен способ получения биомассы возбудителя малярии P.falciparum (авторское свидетельство СССР N 1563700 A1, A 61 K 39/02, C 12 N 5/00, 1988). Способ основан на методе частых пересевов со свежими отмытыми и пропущенными через капиллярную колонку эритроцитами. Оценку результатов проводят в тонких мазках, подсчитывают паразитов на 1000 эритроцитов и выражают в процентах.

Однако этот способ сопровождается гемолизом эритроцитов, задержкой роста и размножения паразитов.

Для коррекции этих неблагоприятных изменений обычно используют способ частых пересевов, однако положительный эффект, т.е. стимуляция роста и размножения паразитов, наблюдается примерно в 50% случаев. Эритроциты, находящиеся в предгомолитическом состоянии и не пригодные для развития в них паразитов, препятствуют эффективному культивированию.

Цель изобретения - повышение выхода биомассы возбудителя малярии Р.falciparum за счет улучшения состояния эритроцитов в культуре.

Поставленная цель достигается тем, что при ежедневных пересевах в полную питательную среду RPMI - 1640 добавляют ингибиторы окислительных процессов - комплекс антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазы (СОД) и каталазы (патент N 2033169 от 20.04.95 г., МКИ A 61 K 35/1811, C 12 N 9/00 на изобретение "Способ получения комплекса супероксиддисмутазы и каталазы из эритроцитов крови человека").

Согласно предлагаемому способу готовят среду для культивирования из полной среды RPMI - 1640, Hepes (25 ммоль/л) + 10% сыворотка + 5% NaCO₃, pH 7,2 + антиоксидантные ферменты СОД + каталаза).

Количество ферментов, необходимое для оптимального роста и размножения паразитов, определяли путем добавления в полную питательную среду различных весовых количеств комплекса.

Ежедневно культуральные клетки переносят в центрифужную пробирку и центрифугируют в течение 3-4 мин со скоростью 1000 об/мин. Надосадочную жидкость отбирают, к осажденным эритроцитам добавляют равный объем приготовленной питательной среды и получают 50%-ную суспензию клеток. После тщательного перемешивания в стерильных условиях к суспензии эритроцитов из культуры добавляют 50%-ную суспензию свежих отмытых эритроцитов, чтобы количество паразитов составляло 0,3-0,5%, затем прибавляют приготовленную полную питательную среду с комплексом ферментов. Суспензию тщательно перемешивают пастеровской пипеткой, разливают в культуральные чашки по 1,5 мл в каждую и продолжают культивировать.

Пример. Из четырех культуральных чашек сливают содержимое в стерильную пробирку и перемешивают. Заливают полной питательной средой, в которую на 100 мл среды добавляют 5 мг комплекса ферментов (СОД + каталаза), центрифугируют, осадок разливают в 4-6 культуральных чашек, добавляют полную питательную среду с комплексом ферментов и продолжают культивировать (А) (таблица). При пересеве этих клеток со свежими эритроцитами подсчитывают количество паразитов в мазке, окрашенном по Романовскому-Гимза. Добавляют в среду 7 мг комплекса ферментов на 100 мл полной питательной среды. Процентное количество паразитов 5-10 достигается за 48 часов (Б). Добавляют в питательную среду 10 мг комплекса ферментов на 100 мл (В), 7-12%-ное содержание паразитов в эритроцитах достигается за 24-48 часов.

Добавляют комплекс ферментов 10 мг на 100 мл среды, что приводит к лизису зараженных эритроцитов (Г).

Результаты исследования представлены в таблице.

Таким образом предлагаемый способ сокращает сроки размножения паразитов малярии в культуре и повышает выход биомассы, что достигается при добавлении в полную питательную среду ингибиторов окислительных процессов (СОД + каталаза) в количестве 5-10 мг на 100 мл среды. Дальнейшее добавление комплекса в среду нецелесообразно, так как это приводит к разрушению эритроцитов, содержащих возбудители.

Выход биомассы (т.е. количество паразитов на 1000 эритроцитов) значительно выше (в 2-4 раза) и происходит быстрее уже за 24 часа при включении предлагаемого способа в процесс культивирования.

Формула изобретения

Способ получения биомассы возбудителям малярии, Plasmodium falciparum, включающий получение зараженных эритроцитов, культивирование возбудителей в питательной среде RPM1-1640, дополнительно содержащей Hepes, сыворотку, карбонат натрия, путем пересевов с добавлением свежих эритроцитов, отличающийся тем, что в питательную среду добавляют комплекс антиоксидантных ферментов - супероксиддисмутазу и каталазу эритроцитов крови человека в количестве, исключающем гемолиз эритроцитов.

РИСУНКИ

Рисунок 1