Способы регулирования моторики желудочно-кишечного тракта

 

Изобретение относится к медицине, в частности к гастроэнтерологии, и касается снижения моторики желудочно-кишечного тракта или замедления опорожнения желудка. Для этого предлагают использовать амилин или агонист амилина. Способ позволяет эффективно лечить заболевания и состояния, при которых необходимо подавление моторной активности желудка и других отделов пищеварительного тракта. 5 с. и 11 з.п. ф-лы, 2 табл., 17 ил.

Эта заявка является частичным продолжением патентной заявки США N 08/118 381, поданной 7 сентября 1993, которая включена в настоящий документ в качестве ссылки.

Область изобретения Настоящее изобретение относится к способам регулирования моторики желудочно-кишечного тракта. В частности, изобретение относится к применению амилина и агонистов амилина для лечения нарушений, на которые могут оказать благоприятное воздействие агенты, способные замедлять или/и задерживать опорожнение желудка. Изобретение относится также к применению антагонистов амилина для ускорения опорожнения желудка, например, при лечении гипокинезии желудка и связанных с ней нарушений.

Амилин Амилин является белковым гормоном, состоящим из 37 аминокислот. Он был выделен, очищен и охарактеризован химически как главный компонент отложений амилоида в островках Лангерганса поджелудочной железы людей, страдавших диабетом типа 2 (Cooper и др., Proc. Natl. Acad. Sci., USA 84:8626-8632 (1987)). Молекула амилина имеет две важные посттрансляционные модификации: C-конец амидирован, а цистеины в положениях 2 и 7 поперечно сшиты, образуя H-концевую петлю. Последовательность открытой рамки считывания гена человеческого амилина обнаруживает присутствие сигнала протеолитического расщепления из двуосновных аминокислот Лиз-Арг перед H-концевым кодоном для Лиз и Гли перед Лиз-Арг протеолитическим сигналом в CLAIMS-концевом положении, типичную последовательность для амидирования ферментом амидирования белков (ФАБ) (Cooper и др., Biochem, Biophys. Acta, 1014:247-258 (1989)). Амилин представляет сущность патентной заявки Соединенного Королевства серийный N 8709871, поданной 27 апреля 1987, и заявок-аналогов США, поданных 27 апреля 1988, 23 ноября 1988 и 2 мая 1989.

Показано, что при диабете типа 1 имеется дефицит амилина, и в качестве предпочтительного лечения была предложена комбинированная заместительная терапия вместо терапии одним только инсулином, например, для сокращения количества гипогликемических эпизодов. Применение амилина для лечения сахарного диабета является сущностью патентной заявки Соединенного Королевства серийный N 8720115, поданной 26 августа 1987 G.J.S. Cooper и зарегистрированной в качестве патентной заявки серийный N 236 985 августа 1988 в Соединенных Штатах. Фармацевтические композиции, содержащие амилин и амилин плюс инсулин, описаны в патенте США N 5 124 314, выданном 23 июня 1992.

Действие избыточного количества амилина имитирует основные черты диабета типа 2, а блокада амилина была предложена в качестве новой стратегии лечения. В одновременно рассматриваемой общественной (Commonly-owned патентной заявке США серийный N 275 475, поданной 23 ноября 1988 Cooper, G.J.S. и др., включенной в настоящий документ в качестве ссылки, раскрывается, что амилин вызывает снижение как базальной, так и стимулированной инсулином инкорпорации меченой глюкозы в гликоген стелектной мускулатуры. Раскрывается, что последний эффект связан также с ПРГК (смотри также Leighton, B. и Cooper, G.J. S., Nature 335:632-635 (1988)). Амилин и ПРГК обладали приблизительно равной силой, демонстрируя выраженную активность в концентрациях от 1 до 10 нМ. Сообщалось также, что амилин снижает стимулированное инсулином поглощение глюкозы скелетными мышцами и снижает содержание гликогена (Joung и др., Amer. J. Physiol., 259:457-461 (1990)). Раскрывается лечение диабета типа 2 и резистентности к инсулину с помощью антагонистов амилина.

Как химическое строение, так и генная последовательность имилина свидетельствуют в пользу определения, что он является биологически активной молекулой или молекулой-"посредником". Его химическое строение почти на 50% идентично пептидам, родственным гену кальцитонина (ПРГК), также состоящим из 37 аминокислот белкам, которые широко распространены как нейромедиаторы, обладающие многими видами биологической активности, включая вазодилатацию. И амилин, и ПРГК обладают дисульфидным мостиком ²Цис-⁷Цис и C-концевым амидом, которые необходимы для проявления полной биологической активности (Cooper и др., Proc. Natl. Acag. Sci, 85:7763-7766 (1988)).

Амилин может являться членом семейства родственных пептидов, которое включает в себя ПРГК, инсулин, инсулиноподобные факторы роста и релаксины, которые имеют общие генетические наследуемые признаки (Cooper, G.J.S., и др. , Prog. Growth Factor Research 1:99-105 (1989)). Эти два пептида, кальцитонин и ПРГК-1, имеют общее происхождение из гена кальцитонина, но разный процессинг первичной транскрипции мРНК приводит к образованию двух различных пептидов, имеющих только ограниченную гомологичность последовательности (около 30%) (Amara, S.G. и др., Science, 229:1094-1097 (1985)). Генная последовательность амилина типична для секретируемого белка-посредника, при которой мРНК кодирует препропептид с участками процессинга для выработки секретируемого белка в комплексе Гольджи или секреторных гранулах. Амилин, в основном, расположен вместе с инсулином в гранулах бета-клеток и может иметь общие с инсулином ферменты процессинга, которые превращают проинсулин в инсулин.

Амилин первоначально синтезируется в панкреатических бета-клетках и секретируется в ответ на пищевые стимуляторы, такие как глюкоза и аргинин. Исследования с клонированными линиями опухолевых бета-клеток (Moore и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 179(1), (1991)), изолированными островками Лангерганса (Kanatsuka и др. FEBS Lett., 259 (1): 199-201 (1989)) и перфузируемые крысиными поджелудочными железами (Ogawa и др. J. Clin. Invest., 85: 973-976 (1990)) показали, что короткие воздействия, от 10 до 20 минут, пищевых веществ, стимулирующих секрецию, таких как глюкоза и аргинин, стимулируют высвобождение амилина, а также инсулина. Молярное соотношение амилин : инсулин секретируемых белков в различных препаратах варьирует приблизительно от 0,01 до 0,4, однако не изменяется существенно при воздействии разных стимулов на один и тот же препарат. Однако при длительной стимуляции повышенной концентрацией глюкозы соотношение амилин : инсулин может прогрессивно возрастать (Gedulin и др. Biochem. Biophys. Res. Commun. 180(1)1782-789 (1991)). Таким образом, возможно, вследствие того, что экспрессия гена и скорость трансляции амилина и инсулина контролируются независимо друг от друга, они не всегда секретируются в постоянном соотношении.

Амилиноподобная иммунологическая реактивность была измерена в циркулирующей крови грызунов и людей посредством целого ряда радиоиммуноанализов, в которых использовалась кроличья антиамилиновая сыворотка и в большинстве из которых применялись процедуры экстракции и концентрации для повышения чувствительности анализа. Сообщалось об уровнях амилина натощак от 1 до 10 пМ и уровнях после кормления или введения глюкозы от 5 до 20 пМ у здоровых людей (например, Hartter и др., Diabetologia, 34:52-54 (1991)), Sanke. и др. Diabetologia 35:129-132 (1991)), Koda и др., The Lancet 339:1179-1180 (1992)). У инсулинрезистентных лиц с ожирением уровни амилина после приема пищи могут подниматься еще выше, достигая приблизительно 50 пМ. Для сравнения, у здоровых людей уровни инсулина натощак и после приема пищи составляют 20-50 пМ и 100-300 пМ соответственно, что в 3-4 раза выше, чем у инсулинрезистентных людей. У людей с диабетом типа 1, когда бета-клетки разрушены, уровни инсулина находятся на уровне или ниже определимого уровня и не повышаются в ответ на глюкозу (Koda и др. The Lancet. 339:1179-1180 (1992)). Сообщается, что у здоровых мышей и крыс базальные уровни амилина составляют от 30 до 100 пМ, в то время как у некоторых инсулинрезистентных диабетических линий грызунов эти величины составляют до 600 пМ (например, Huang и др., Hypertension, 19: 1-101-1-109 (1992); Gill и др., Life Science, 48:703-710 (1991)).

Было установлено, что некоторые эффекты амилина подобны известным неметаболическим эффектам ПРГК и кальцитонина; однако метаболические эффекты амилина, установленные во время изучения этого впервые выделенного белка, скорее всего отражают его главную биологическую роль. По меньшей мере некоторые из этих метаболических эффектов имитируются ПРГК, хотя и в дозах, которые являются выраженно вазодилатирующими (смотри, например, Leighton и др. Nature, 335:632-635 (1988); Molina и др., Diabetes, 39:260-265 (1990)).

Первым установленным эффектом амилина было снижение инсулинстимулированной инкорпорации глюкозы в гликоген скелетных мышц крысы (Leighton и др., Nature, 335:632-635 (1988)); мышцы становились "инсулинрезистентными". Последующая работа с камбаловидной мышцей крысы ex-vivo и in vitro показала, что амилин снижает активность гликоген-синтазы, ускоряет переход гликоген-фосфорилазы из неактивной в-формы в активную а-форму, ускоряет чистую потерю гликогена (в присутствии или отсутствии инсулина), повышает уровни глюкозо-6-фосфата и может повышать выход лактата (смотри, например, Deems и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 181(1):116-120 (1991)); Joung и др., FEBS Letts, 281(1,2):149-151 (1991). Препятствует ли амилин самому транспорту глюкозы, остается неясным (смотри, например, Joung и др., Am. J. Physiol., 259-E457-E461 (1990), Zierath и др., Diabetologia, 35:26-31 (1992)). Изучение дозозависимых отношений между амилином и инсулином показало, что амилин действует как неконкурентный или функциональный антагонист инсулина в скелетной мышце (Joug и др., Am. J. Physiol., 263:(2): E274-E281 (1992)). Не было найдено доказательств, что амилин препятствует связыванию инсулина с его рецепторами или последующей активации рецептора инсулина тирозинкиназы (Follett и др., Clinical Research 39(1): 39A (1991); Koopmans и др., Diabetologa, 34, 218-224 (1991)). Действие амилина на скелетную мышцу напоминает действие адреналина (эпинефрина). Однако, в то время как предполагают, что действие адреналина опосредуется цАМФ, некоторые исследователи приходят к выводу, что действие анилина не опосредуется цАМФ (смотри Deems и др. Biochem. Biophys. Res. Commun., 181(1):116-120 (1990)), а другие - что амилин все же активирует аденилатциклазу и повышает содержание цАМФ в скелетной мышце (Moore u Rink, Diabetes 42:5, 821 июнь (1993)), что согласуется с его воздействием на метаболизм глюкозы через посредство цАМФ-зависимого фосфорилирования синтазы и фосфорилазы протеинкиназой.

Полагают, что амилин действует через посредство рецепторов, присутствующих на плазматических мембранах. Сообщается, что амилин работает в скелетной мышце через посредство рецепторопосредованного механизма, который ускоряет гликогенолиз путем активации фермента, лимитирующего скорость распада гликогена, фосфорилазы (Young и др., FEBS Letts., 281:149-151 (1991)). Изучение амилина и ПРГК, а также эффекта антагониста ^8-37ПРГК предполагает, что амилин действует через собственный рецептор (Wang и др., FEBS Letts., 219: 195:198 (1991)), в противоположность заключениям других исследователей, что амилин может действовать прежде всего на рецепторы ПРГК (например, Chantry и др. , Biochem. J., 277:139-143 (1991); Galeazza и др. Peptides, 12: 585-591 (1991); Znu и др., Biochem. Biophys. Res. Commun., 177 (2)-771-776 (1991)). Недавно в международной заявке N PCT/US 92/02125, опубликованной 1 октября 1992 и озаглавленной "Методы скрининга агонистов и антагонистов амилина с помощью рецепторов", были описаны рецепторы амилина и их применение в различных методах скрининга и изучения агонистов и антагонистов амилина.

В то же время как амилин оказывает выраженное действие на энергетический метаболизм печени in vivo, среди исследователей нет согласия в вопросе о том, какие эффекты амилина наблюдаются на изолированных гепатоцитах или перфузируемой печени. Доступные данные не поддерживают идею о том, что амилин ускоряет гликогенолиз в печени, т. е., он не действует подобно глюкагону (например, Stephens и др. Diabetes, 40:395-400 (1991)); Gomez-Foix и др. Biochem. J., 276:607-610 (1991)). Предполагают, что амилин может действовать на печень, ускоряя превращение лактата в гликоген и увеличивая количество глюкозы, способной высвобождаться под действием глюкагона (смотри Roden и др. , Diabetologia 35:116-120 (1992)). Таким образом, амилин может действовать как анаболический партнер инсулина в печени, в противоположность его катаболическому действию в мышцах.

Недавно сообщалось о воздействии амилина на региональную гемодинамику, включая почечный кровоток, у крыс (Gardiner и др., Diabetes,, 40:948-951 (1991)). Авторы отмечают, что инфузия крысиного амилина вызывала более выраженную ренальную вазодилатацию и менее выраженную мезентеральную вазоконстрикцию, чем это наблюдается при инфузии α-ПРГК человека. Они делают вывод о том, что стимулируя ренальную гиперемию в большей степени, чем это делает α-ПРГК, крысиный амилин вызывает менее выраженную стимуляцию регин-ангиотензиновой системы и, следовательно, менее выраженную вторичную ангиотензин П-опосредованную вазоконстрикцию. Однако также отмечается, что во время совместной инфузии α-8-37 ПГРК человека и крысиного амилина ренальтная и мезентериальная вазоконстрикцию демаскируются, возможно, благодаря не встречающим противодействия вазоконстрикторным эффектам ангиотензина 11, и что это обстоятельство сходно с тем, что наблюдается во время совместно инфузии А-ПРГК и α-^8-38ПРГК человека (там же, на стр. 951).

У ожиревших крыс, в противоположность своему адреналиноподобному действию на скелетные мышцы, амилин не оказывал измеримого эффекта на инсулинстимулированное поглощение глюкозы, инкорпорацию глюкозы в триглицерид, образование CO₂ (Cooper и др. Proc. Natl. Acad. Sci., 85:7763-7766 (1988)), эпинефринстимулированный липолиз или ингибирование липолиза инсулином (Lupien, J.R. u Young, A.A. "Diabetes nutrition and Metabolism-Clinical and Experimental", том 6(1), стр. 13 - 18 (февраль 1993)). Амилин, таким образом, вызывает тканевоспецифичные эффекты с прямым действием на скелетные мышцы выраженным непрямым (через снабжение субстратом) и, возможно, прямым действием на печень, в то время как адипоциты представляются нечувствительными к присутствию или отсутствию амилина. О прямых эффектах амилина на почечную ткань не сообщается.

Сообщается также, что амилин оказывает выраженное воздействие на секрецию инсулина. На изолированных островках Лангерганса (Ohsawa и др., Biochem. Biophys. Rec. Commun. , 160(2): 962-967 (1989)), на перфузируемых поджелудочных железах (Silvestre и др. Reg. Pept., 31-23-31 (1990)) и на интактных крысах (Young и др. Mol.Cell. Endocrinol., 84:P1-P5 (1992)) некоторые эксперименты показали, что амидин регулирует секрецию инсулина в сторону снижения. Эксперименты на перфузируемой поджелудочной железе указывают на селективное подавление секреторного ответа на глюкозу со сниженным ответом на аргинин. Другие исследователи, однако, не смогли уловить эффекты амилина на изолированные β-клетки, на изолированные островки или на живое животное (смотри Broderick и др., Biochem. Biophys. Rec. Comm., том 177: 932-938 (1991) и ссылки в этой работе).

Наиболее ярким эффектом амилина in vivo является стимуляция резкого подъема лактата в плазме, вслед за которым наблюдается подъем плазменной глюкозы (Young и др. FEBS Letts., 281 (1,2):149-151 (1991)). Факты указывают на то, что увеличенное количество лактата обеспечивает субстрат для образования глюкозы и что эффекты амилина могут наблюдаться независимо от изменений количества инсулина или глюкагона. В экспериментах по "фиксации глюкозы" инфузии амилина вызывали "резистентность к инсулину" как путем снижения периферического размещения глюкозы, так и путем ограничения инсулин-опосредованной супрессии выброса глюкозы печенью (например, Frontoni и др. Diabets, 40:568-573 (1991); Koopmans и др., Diabetologia, 34, 218-224 (1991)).

У слегка анестезированных крыс, голодавший в течение 18 часов для истощения запасов печеночного гликогена, инъекции амилина стимулировали повышение плазменного лактата приблизительно от 0,5 до 1,5 мМ, вслед за чем происходило длительное повышение уровней плазменной глюкозы приблизительно от 6 до 11 мМ. Эти эффекты наблюдались как при внутривенных, так и при подкожных инъекциях (Young и др. FEBS Letts. 281(1,2):149-151 (1991)). Эффекты амилина у сытых животных количественно отличались от его эффектов у голодных животных. У накормленных крыс, имевших, предположительно, нормальные запасы печеночного гликогена, амилин вызывает более выраженный и продолжительный подъем плазменного лактата; однако, имеется лишь умеренное повышение плазменной глюкозы. Предполагают, что амилин ускоряет "возвратную ветвь" цикла Кори, т. е. мышечный гликоген посредством распада до лактата обеспечивает субстрат для глюконеогенеза в печени и выработки гликогена и, возможно, синтеза триглицеридов. Инсулин управляет прямой ветвью, т.е., поглощением глюкозы мышей и синтезом мышечного гликогена. Инсулин и амилин, таким образом, представляются партнерами в регуляции "непрямого" пути накопления печенью гликогена после приема пищи. "Резистентность к инсулину" в мышцах и печени может управляться нормальной, физиологической региляцией амилином.

Неметаболические эффекты амилина включают сосудорасширяющие эффекты, которые могут опосредоваться взаимодействием с рецепторами ПРГК сосудов. Сообщается об испытаниях in vivo, которые предполагают, что амилин по меньшей мере приблизительно от 100 до 1000 раз менее сильный вазодилататор, чем ПРГК (Brain и др. Eur. J. Pharmacol., 183:2221 (1990); Wang и др. FEBS Letts. 291: 195: 198 (1991)). Сообщается, что амилин, введенный в мозг, подавляет прием пищи (например, Chance и др., Brain Res., 539, 352-354 (1991)) совместно с ПРГК и кальцитонином. Эффективные концентрации в клетках, которые опосредуют этот эффект, не известны. Сообщается также, что амилин оказывает воздействие на изолированные остеокласты, у которых он вызывает состояние покоя, а также in vivo, где он понижает содержание кальция в плазме на 20% у крыс, кроликов и людей с болезнью Педжета (смотри, например, Gilbey и др. J. Bone Mineral Res., 293 (1991)). Судя по имеющимся данным, амилин в 10-30 раз слабее кальцитонина человека в этих эффектах. Представляет интерес сообщение о том, что амилин повышает выработку цАМФ остеокластами, но не повышает цитозольный Ca²⁺, в то время как кальцитонин делает и то, и другое (Alam и др., Biochem. Biophs. Res. Commun, 179 (1):134-139 (1991). Была предложена, но не подтверждена, гипотеза о том, что кальцитонин может действовать через посредство рецепторов двух типов и что амилин может взаимодействовать с одним из них.

Инфузии антагонистов рецепторов амилина может использоваться для изменения регуляции обмена глюкозы. Показано, что ^8-37-ПРГК является блокатором амилина in vitro и in vivo (Wang и др. Biochem Biophs. Res. Commun., 181(3): 1288-1293 (1991)), а также изменяет обмен глюкозы после инфузии аргинина сытым крыса (Young и др., Mol. Cell. Endocrinol., 84:P1-P5 (1992)). Начальное повышение концентрации глюкозы относят на счет аргининстимулированной секреции глюкагона альфа-клетками островков Лангерганса; последующее восстановление исходного уровня глюкозы относят на счет действия инсулина совместно с изменениями других гормонов, участвующих в регуляции обмена глюкозы. Когда действие амилина блокируется предварительной инфузией ^8-37ПРГК, начальное повышение глюкозы значимо не отличается, однако затем наблюдается падение концентрации глюкозы значительно ниже исходного уровня, который восстанавливается столько спустя приблизительно 80 минут. Таким образом, регуляция обмена глюкозы после стимуляции веществами, вызывающими секрецию островков Лангерганса, изменялась посредством инфузии антагониста рецепторов амилина. Кроме того, измеряли концентрации инсулина с получасовыми интервалами и обнаружили, что концентрация инсулина спустя 30 минут после инфузии аргинина была почти в два раза выше у животных, которым вводили антагонист рецепторов амилина, чем у нормальных контрольных животных. ^8-37ПРГК также является эффективным антагонистом ПРГК. Однако весьма сходные результаты наблюдали с другим антагонистом амилина, AC66, который является селективным в отношении рецепторов амилина по сравнению с рецепторами ПРГК (Young и др., Mol.Cell. Endocrinol, 84: P1-P5 (1992)). Эти результаты поддерживают вывод о том, что блокада действия амилина может оказывать важное благоприятное действие при лечении диабета типа 2.

Сообщается, что пациенты с диабетом типа 1, помимо недостатка инсулина, имеют также выраженный дефицит амилина. Как отмечалось выше, данные свидетельствуют о том, что при диабете типа 1 экспрессия и секреция амилина панкреатическими бета-клетками отсутствуют или значительно ниже нормальных. У животных со смоделированным диабетом типа 1 секреции амилина и экспрессия его гена подавления (Cooper и др., Diabets 497-500 (1991); Ogawa и др., J. Clin. Invest., 85: 973-976 (1990)). Определение амилина в плазме у пациентов с диабетом типа 1 показало, что у них имеется дефицит амилина после ночного воздержания от пищи и что нагрузка глюкозой не вызывает какого-либо повышения уровней амилина (Koda и др., The Lancet 339:1179-1180 (1992)).

Было также обнаружено, что удивительно с точки зрения описанных ранее почечного вазодилатирующего и других эффектов, что амилин значительно повышает активность плазменного ренина у крыс при подкожном введении таким способом, который позволяет избежать каких-либо изменений кровяного давления. Это важно, поскольку сниженное кровяное давление является мощным стимулом высвобождения ренина. Антагонисты амилина, такие как антагонисты рецепторов амилина, включая селективные для амилиновых рецепторов по сравнению с рецепторами ПРГК и/или кальцитонина, могут применяться для блокирования вызванного амилином повышения активности плазменного ренина. Эти неожиданные находки говорят в пользу предположения о том, что антагонисты амилина будут снижать активность плазменного ренина с последующим терапевтически благоприятным действием на гипертензию и сердечную недостаточность, а также другие расстройства, связанные с повышенной, неадекватной или нежелательной активностью ренина. Более того, дополнительная способность антагонистов амилина благоприятным образом модулировать инсулиновую резистентность и другие распространенные метаболические нарушения, зачастую связанные с гипертензией и сердечной недостаточностью, обеспечивает особенно желательный способ лечения.

Гипокинезия желудка Гипокинезия желудка с задержкой опорожнения его от жидкого и/или твердого содержимого является составляющей частью множества желудочно-кишечных нарушений. Смотри общую дискуссию Goodman u Gilman's b The Pharmacological Basis of Therapeutics, глава 38 (Pergamon Press, восьмое издание, 1990). Симптомы таких нарушений могут включать тошноту, рвоту, изжогу, дискомфорт после приема пищи и несварение. Часто встречается желудочно-пищеводный рефлюкс, который может вызывать образование язв пищевода; могут наблюдаться также респираторные симптомы или интенсивная загрудная боль, которые можно принять за астму или инфаркт миокарда соответственно. Хотя у большинства пациентов этиологическая причина известна, стаз содержимого желудка или гипокинезия часто являются следствием диабетической невропатии; это состояние также часто наблюдается у пациентов с неврогенной анорексией, или ахлоргидрией, или после хирургических вмешательств на желудке. Там же, на стр. 928.

Медицинская помощь пациентам с гипокинезий желудка обычно включает назначение прокинетического агента. Хотя противорвотные фенотиазины или бетанхол могут принести некоторое облегчение, эти лекарственные средства не ускоряют опорожнения желудка у подавляющего большинства пациентов и часто вызывают неприемлемые побочные эффекты. В настоящее время доступные прокинетические агенты включают метоклопрамид и цизаприд, в то время как другие (например, домперидон) изучаются. Там же.

Метоклопрамид понижает рецептивную релаксацию верхней части желудка и усиливает антральное сокращение. Пилорический отдел и двенадцатиперстная кишка расслабляются, в то время как тонус нижнего пищеводного сфинктера усиливается. Эти эффекты объединяются для ускорения эвакуации желудочного содержимого и снижения рефлюкса из двенадцатиперстной кишки и желудка в пищевод. Помимо этого, время прохождения материала из двенадцатиперстной кишки до илеоцекального клапана сокращается в результате усиления перистальтики тощей кишки. Метоклопрамид практически не оказывает действия на желудочную секрецию и моторику толстого кишечника. Там же на стр. 928.

В целом, дофаминергические агонисты производят противоположное действие, которое опосредуют Д₂-рецепторы, расположенные по меньшей мере частично в желудочно-кишечном тракте. Там же.

Механизм действия метоклопрамида не совсем ясен, несмотря на то, что он является ярко выраженным дофаминергическим антагонистом и может блокировать гастроинтенстинальные эффекты, вызванные местным или системным введением дофаминергических агонистов. Несмотря на то, что ваготомия не устраняет эффекты метоклопрамида, ее прокинетические эффекты могут быть блокированы атропином иди другими мускариновыми антагонистами. Более того, не все дофаминергические антагонисты ускоряют опорожнение желудка. Полагают, что это лекарственное средство стимулирует высвобождение ацетилхолина из нейронов мышечной оболочки кишечника, однако прямые доказательства этого действия отсутствуют. Поскольку бетанхол может усиливать эффекты метоклопрамида, повышенная чувствительность к ацетилхолину также может играть определенную роль. Там же, на стр. 928-929.

Домперидон является производным бензимидазола и обладает прокинетическими и противорвотными свойствами. Он является дофаминергическим антагонистом и вызывает выраженную гиперпролактинемию; его действие на моторику желудочно-кишечного тракта также весьма напоминает действие метоклопрамида. Однако в противоположность метоклопрамиду, эти эффекты не устраняются атропином; объяснения этому различию пока нет. Домперидон проходит через гематоэнцефалический барьер в очень ограниченном количестве и весьма редко вызывает экстрапирамидные побочные эффекты. В результате он не препятствует лечению болезни Паркинсона и может быть полезен для противодействия желудочно-кишечным расстройствам, вызванным леводопой и бромкриптином. Поэтому это лекарственное средство так же полезно для лечения пациентов с гипокинезией желудка, как и метоклопрамид. Однако он обладает меньшей противорвотной активностью. Там же на стр. 929. Домперидон быстро всасывается после перорального приема, но его биодоступность составляет только около 15%, большая часть этого лекарства и его метаболитов выводится с калом. Период полувыведения его из плазмы составляет около 7 - 8 часов. Там. же. Домперидон не является общедоступным в Соединенных Штатах; он доступен в других странах как мотилиум (MOTILIUM). Оптимальные дозировки не установлены, однако для лечения гипокинезии желудка применяют дневные пероральных дозы от 40 до 120 мг. Там же, на стр. 929.

Цизаприд является бензамидом и его эффекты на моторику желудка и тонкого кишечника весьма напоминают эффекты метоклопрамида и домперидона; однако, в противоположность этим лекарственным средствам, он также повышает моторику толстого кишечника и может вызвать диарею. Механизм его действия на желудочно-кишечный тракт мало изучен. Подобно метоклопрамиду эти эффекты блокируются атропином и могут вовлекать высвобождение ацетилхолина мышечной оболочки кишечника. Цизаприд, как представляется, лишен блокирующей дофаминергичекой активности и не влияет на концентрацию пролактина в плазме и не вызывает экстрапирамидных симптомов. Это лекарственное средство связывает и блокирует 5-HT₂ триптаминергические рецепторы в подвздошной кишке крысы, однако отношение этого эффекта к его эффектам на организм человека не установлено. Там же. Таким образом, эффективность этого лекарственного средства при лечении нарушений, наблюдаемых при гипокинезии желудка, представляется равной эффективности метоклопрамида и домперидона без побочных эффектов, вызываемых дофаминергической блокадой. Кроме того, цизаприд может быть полезным при лечении пациентов с хроническим идиопатическим запором или с гипокинезией толстого кишечника, вызванной повреждением спинного мозга. Там же на стр. 929.

В противоположность вышесказанному, в медицине также нашли применение агенты, которые служат задержке опорожнения желудка, в частности, в качестве вспомогательных средств при диагностических радиологических исследованиях желудочно-кишечного тракта. Например, глюкагон является полипептидным гормоном, который вырабатывается альфа-клетками панкреатических островков Лангерганса. Он является гипергликемическим агентом, который мобилизует глюкозу путем активации гликогенолиза в печени. В меньшей степени он способен стимулировать секрецию панкреатического инсулина. Глюкагон назначается в виде глюкагона гидрохлорида; дозы обычно обозначаются как глюкагон.

Глюкагон используют при лечении инсулининдуцированной гипогликемии, когда введение глюкозы в вену невозможно. Его вводят путем подкожной, внутримышечной или внутривенной инъекции в дозе 0,5-1 мг (единицы), повторяемой, если необходимо, через 20 минут, однако, поскольку глюкагон понижает моторику желудочно-кишечного тракта, он применяется в диагностических целях при радиологических исследованиях желудочно-кишечного тракта. Способ введения зависит от диагностической процедуры. Доза в 1-2 мг (единицы) при внутримышечном введении начинает действовать через 4-14 минут, а продолжительность эффекта составляет 10 - 40 минут; 0,2-2 мг (единицы) при внутривенном введении оказывают эффект в течение одной минуты, который продолжается 9 - 25 минут.

Глюкагон применялся в некоторых исследованиях для лечения различных болезненных желудочно-кишечных нарушений, связанных со спазмом. Daniel и др. Br. Med. J., 1974, 3, 720, сообщают о более быстром симптоматическом облегчении при остром дивертикулите у пациентов, леченных глюкагоном, по сравнению с пациентами, леченными анальгетиками или спазмолитиками. В обзоре, сделанном Glauser и др., (J. Am. Coll. Emergency Physns. 1979, 8, 228), описывается облегчение при острой пищеводной пищевой обструкции после терапии глюкагоном. В другом исследовании глюкагон значительно облегчал боль и болезненность при пальпации у 21 пациента с заболеваниями желчевыводящих путей по сравнению с 22 пациентами, получавшими плацебо (M.J. Stower и др., Br.J. Surg. 1982, 69, 591-2). Franken и др., однако (Radicology 1983, 146, 687), не смогли показать преимущество глюкагона перед плацебо в гидростатической редукции подвздошно-толстокишечной инвагинации в исследованиях 30 детей, A Webb и др. (Med. J. Aust., 1986, 144, 124) заключают, что глюкагон был неэффективным при лечении мочеточниковой колики в отделении экстренной помощи.

Неожиданно, с точки зрения ранее описанных гипергликемических свойств амилина, мы обнаружили, что амилин и агонисты амилина, включая описанные в настоящем документе, например аналог-агонист амилина, ^25,28,29,про-ч-амилин (также упоминаемый, как "АС-0137"), могут снижать моторику желудка и замедлять опорожнение желудка, что следует из способности этих соединений снижать уровни плазменной глюкозы после приема пищи.

Настоящее изобретение направлено на новые способы снижения моторики желудка и замедления опорожнения желудка, которые включают в себя введение амилина или агониста амилина, например агонистического аналога амилина АС-0137. Эти способы будут полезны для лечения, например, пищевой гипергликемии, осложнения, связанного с сахарным диабетом типа 2 (инсулиннезависимым).

Термин "амилин" включает соединения, определенные Young и Cooper в патенте США N 5 234 906, выданном 10 августа 1993, на гипергликемические композиции, содержание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки. Например, он включает пептидный гормон человека и его видовые разновидности, упоминаемые как амилин и секретируемые бета-клетками поджелудочной железы. "Агонисты амилина" также является известным термином и относится к соединениям, которые имитируют эффекты амилина. Таким образом, сам амилин и агонистические аналоги амилина также могут упоминаться как агонисты амилина. Термин "агонистический аналог амилина" относится к производным амилина, которые действуют как агонисты амилина посредством, как полагают в настоящее время, в норме связывания или другого прямого или непрямого взаимодействия с рецепторами амилина или другими рецепторами, с которыми сам амилин может взаимодействовать, вызывая биологическое действие, описанное выше. В добавление к описанным в настоящем документе другие полезные агонистические аналоги амилина идентифицированы в международной патентной заявке WPI Acc. N 93-182488/22, озаглавленной "Новые пептиды-агонисты амилина, используемые для лечения и профилактики гипогликемии и сахарного диабета", содержание которой также включено в настоящий документ в качестве ссылки.

В одном аспекте, настоящее изобретение описывает способ благоприятного регулирования моторики желудочно-кишечного тракта пациента путем введения названному пациенту терапевтически эффективного количества амилина или агониста амилина, предпочтительно агонистического аналога амилина. В одном варианте осуществления способы настоящего изобретения направлены на снижение моторики желудка. В другом варианте осуществления настоящее изобретение направлено на способы задержки опорожнения желудка.

Эти способы можно применять у пациента, проходящего диагностическое исследование желудочно-кишечного тракта, например радиологическое исследование или магнитно-резонансную томографию. Иначе, эти способы можно применять для снижения моторики желудка у пациента, страдающего нарушением функции желудочно-кишечного тракта, например спазмом (который может быть связан с острым дивертикулитом, патологией желчевыводящих путей или сфинктера Одди).

В другом аспекте, настоящее изобретение направлено на способ лечения демпинг-синдрома после приема пищи у пациента путем введения названному пациенту терапевтически эффективного количества агониста амилина.

В еще одном аспекте, настоящее изобретение направлено на способ лечения гипергликемии, связанной с приемом пищи, путем введения пациенту терапевтически эффективного количества агониста амилина. В предпочтительном варианте осуществления гипергликемия, связанная с приемом пищи, является следствием сахарного диабета типа 2.

Предпочтительные агонисты амилина включают ^25,28,29Про-ч-амилин. Предпочтительные агонистические аналоги амилина также включают ^25,28,29Про-ч-амилин.

В другом аспекте, настоящее изобретение направлено на способ лечения гипокинезии желудка у пациента путем введения этому пациенту терапевтически эффективного количества антагониста амилина. В предпочтительном варианте осуществления эти способы можно применять, когда гипокинезия является следствием диабетической невропатии и невротической анорексии. Гипокинезия наблюдается также как следствие ахлоргидрии или как следствие хирургического вмешательства на желудке.

В другом аспекте, настоящее изобретение направлено на способ ускорения опорожнения желудка у пациента путем введения этому пациенту терапевтически эффективного количества антагониста амилина. Под антагонистом амилина подразумевается соединение, которое препятствует эффектам амилина, например соединение, которое само по себе не обладает значительной фармакологической активностью, но вызывает эффекты путем ингибирования действия специфического агониста, например, конкурируя за участки связывания агониста. Предпочтительно, антагонистом амилина, применяемым в этих способах, является антагонист рецепторов амилина. Предпочтительным антагонистом является ацетил-^11,18Асг, ³⁰Асн, ³²Тир_9-23кальциттонин (сальмон).

В другом аспекте, настоящее изобретение направлено на способ лечения отравлений путем введения количества амилина или агониста амилина, эффективного для предотвращения или уменьшения прохождения желудочного содержимого в кишечник, и аспирации желудочного содержимого.

Фиг. 1 показывает влияние амилина на уровни плазменной глюкозы у собак после пероральной нагрузки глюкозой по сравнению с контролем.

Фиг. 2 показывает уровни глюкозы после приема пищи у людей-добровольцев, которым вводили плацебо или 30 мкг AC-0137 внутривенно болюсно.

Фиг. 3 показывает уровни глюкозы после приема пищи у людей-добровольцев, которым вводили плацебо или 100 мкг АС-0137 внутривенно болюсно.

Фиг. 4 показывает уровни глюкозы после приема пищи у людей-добровольцев, которым вводили плацебо или 300 мкг АС-0137 внутривенно болюсно.

Фиг. 5 показывает уровни глюкозы после приема пищи у людей-добровольцев, которым вводили плацебо или производили 2-часовую внутривенную инфузию АС-0137 со скоростью 15 мкг в час.

Фиг. 6 показывает уровни глюкозы после приема пищи у людей-добровольцев, которым вводили плацебо или производили 2-часовую внутривенную инфузию АС-0137 со скоростью 50 мкг в час.

Фиг. 7 показывает уровни глюкозы после приема пищи у людей-добровольцев, которым вводили плацебо или производили 2-часовую внутривенную инфузию АС-0137 со скоростью 150 мкг в час.

Фиг. 8a-11b показывают уровни глюкозы после приема питания Sustacal® в исходный (день 1), на 7 день и 14 день испытаний на толерантность к питанию Sustacal® у людей-добровольцев, которым вводили 30 мкг трипро-амилина (АС- 0137) три раза в день перед едой в течение 14 дней.

Рисунки 9a-9b показывают уровни плазменной глюкозы (мг/дл), плазменного трипро-амилина (пМ) и плазменного свободного инсулина (мкЕд/мл), начиная от времени 60 минут до начала внутривенной инфузии 25 мкг/час трипро-амилина. Питание Sustacal® давали через 60 минут после начала инфузии трипро-амилина.

Фиг. 10a-10c показывают уровни плазменной глюкозы (мг/дл), плазменного трипро-амилина (пМ) и плазменного свободного инсулина (Ед/мл), начиная от времени 60 минут до начала внутривенной инфузии 50 г/час трипро-амилина. Питание Sustacal® давали через 60 минут после начала инфузии трипро-амилина.

Фиг. 11a-11c показывают уровни плазменной глюкозы (мг/дл), плазменного трипро-амилина (пМ) и плазменного свободного инсулина (мкЕд/мл), начиная от времени 60 минут до начала внутривенной инфузии 50 мкг/час трипро-амилина. Внутривенную нагрузку глюкозой (300 мг/кг) производили спустя 60 минут после начала инфузии трипро-амилина.

Фиг. 12a-12b показывают уровни глюкозы и трипро-амилина после приема питания Sustacal® в исходный (день 1), на 7 день и 14 день испытаний на толерантность к питанию Sustacal® у людей-добровольцев, которым вводили 100 мкг трипро-амилина (АС-0137) три раза в день перед едой в течение 14 дней.

Фиг. 13a-13b показывают уровни глюкозы и трипро-амилина после приема питания Sustacal® в исходный (день 1), на 7 день и на 14 день испытаний на толерантность к питанию Sustacal® у людей-добровольцев, которым вводили 300 мкг трипро-амилина (АС-0137) три раза в день перед едой в течение 14 дней.

Фиг. 14 показывает дозозависимые эффекты предварительной подкожной инъекции крысиного амилина на задержку содержимого желудка спустя 20 минут после кормления через зонд нормальных и диабетических BB крыс (n=3-9 животных на каждый пункт). Числа обозначают средние величины ±COC, а кривые определяют наиболее подходящие логистические функции. Ноль обозначает фракцию желудочного содержимого, которая задерживалась у нормальных и диабетических крыс, не подвергавшихся лечению амилином (разница при P < 0,001).

Фиг. 15 показывает концентрацию плазменного амилина, измеренную после подкожной инъекции 1 мкг или 10 мкг синтетического крысиного амилина (n = 3 животных на группу). Числа обозначают средние величины ±COC.

Фиг. 16 отражает тритий глюкозы в плазме (количество импульсов в минуту/10 мкл) после введения через зонд физиологического раствора или АС-0187. Звездочкой обозначается статистическая значимость. Самые малые метки (пунктирной линией обозначен фон) улавливали у 4 анестезированных крыс с введенным зондом после лапаротомии и перевязки пилорического отдела. Это обстоятельство указывает на то, что непосредственно через стенки желудка всасывается малое количество трития и что поглощение трития отражает прохождение глюкозы в кровяное русло через тонкий кишечник.

Фиг. 17 отражает уровень плазменной глюкозы (мг/дл) после введения через зонд физиологического раствора или АС-0187.

Номенклатура различных соединений - агонистических аналогов амилина, применяемых в настоящем изобретении, может использоваться для обозначения пептида, чья последовательность является основной, и модификаций, сделанных на основе любой основной пептидной последовательности амилина, таких как амилин человека. Аминокислота, перед которой сверху приведено число, означает, что названная аминокислота замещает аминокислоту, в норме присутствующую на аминокислотной позиции, обозначенной верхним числом, в основной аминокислотной последовательности. Например, "¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин" относится к пептиду, основанному на последовательности "ч-амилина" или "человеческого амилина", который имеет следующие замещения: Арг замещает Гис в остатке 18, Про замещает Ала в остатке 25 и Про замещает Сер в остатке 28. Обозначение "отс-¹Лиз-ч-амилин" относится к пептиду, основанному на последовательности человеческого амилина, в котором первая, или N-концевая, аминокислота отсутствует.

Агонистические аналоги амилина настоящего изобретения полезны с точки зрения их фармакологических свойств. Активность агонистов амилина может определяться по активности в исследовании связывания рецепторов и в исследовании на камбаловидной мышце, описанных ниже. Активность соединений как агонистов амилина также может оцениваться по их способности индуцировать гиперкальцемию и/или гипергликемию у млекопитающих или снижать уровни плазменной глюкозы после приема пищи, как описано в настоящем документе.

Предпочтительные агонистические аналоги амилина отс-¹Лиз-ч-амилин, ²⁸Про-ч-амилин, ^25,28,29Про-ч-амилин, ¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин и отс-¹Лиз¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин продемонстрировали амилиновую активность in vivo на экспериментальных животных, вызвав выраженную гиперлактемию, за которой последовала гипергликемия. В добавление к амилиновой активности некоторые предпочтительные соединения имеют также более предпочтительную растворимость и характеристики стабильности по сравнению с человеческим амилином. Эти предпочтительные соединения включают ²⁵Про²⁶Вал^28,29Про-ч-амилин, ^25,28,29Про-ч-амилин (также упоминаемый в настоящем документе как "АС-0137") и ¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин.

Способ настоящего изобретения может применять агонист амилина, включая сам амилин или агонистический аналог амилина, например агористические аналоги, действующие на рецепторы амилина, такие как ¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин, отс-¹Лиз¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин, ¹⁸Арг^25-28,29Про-ч-амилии, отс-¹Лиз¹⁸Арг^25,28,29Про-ч-амилин, ^25,28,29Про-ч-амилин, отс-¹Лиз^25,28,29Про-ч-амилин и ²⁵Про²⁶Вал^25,28Про-ч-амилин. Примеры других подходящих агонистических аналогов амилина включают: ²³Лей²⁵Про²⁶Вал^28,29Про-ч-амилин; ²³Лей²⁵Про²⁶Вал²⁸Про-ч-амилин; отс-¹Лиз²³Лей²⁵Про²⁶Вал²⁸- Про-ч-амилин; ¹⁸Арг²³Лей²⁵Про²⁶Вал²⁸- Про-ч-амилин; ¹⁸Арг²³Лей^25,28,29Про-ч-амилин; ¹⁸Арг²³Лей^25,28Про-ч-амилин;
¹⁷Иле²³Лей^25,28,29Про-ч-амилин;
¹⁷Иле^25,28,29Про-ч-амилин;
отс-¹Лиз¹⁷Иле²³Лей^25,28,29Про-4-амилин;
¹⁷Иле¹⁸Арг²³Лей-ч-амилин;
¹⁷Иле¹⁸Арг²³Лей²⁶Вал²⁹- Про-ч-амилин;
¹⁷Иле¹⁸Арг²³Лей²⁵Про²⁶- Вал^28,29Про-ч-амилин;
¹³Тре²¹Гис²³Лей²⁶Ала²⁸- Лей²⁹Про³¹Асп-ч-амилин;
¹³Тре²¹Гис²³Лей²⁶Ала²⁹- Про³¹Асп-ч-амилин;
отс-¹Лиз¹³Тре²¹Гис²³Лей²⁶- Ала²⁸Про³¹Асп-ч-амилин;
¹³Тре¹⁸Арг²¹Гис²³Лей²⁶- Ала²⁹Про³¹Асп-ч-амилин;
¹³Тре¹⁸Арг²¹Гис²³Лей^28,29- Про³¹Асп-ч-амилин и
¹³Тре¹⁸Арг²¹Гис²³Лей²⁵- Про²⁶Ала^28,29Про³¹Асп-ч-амилин.

Некоторые другие агонисты амилина, включая агонистические аналоги амилина, раскрыты в WPI Acc. N 93-182488/22, "Новые пептиды - агонисты амилина, применяемые для лечения и профилактики гипогликемии и сахарного диабета", описание которого включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Активность агонистов амилина можно оценивать, используя определенные биологические исследования, описанные в настоящем документе. Исследование связывания рецепторов может идентифицировать вещества-кандидаты в агонисты амилина и антагонисты амилина и может применяться для оценки связывания, в то время как исследование на камбаловидной мышце способствует различению агонистов и антагонистов амилина. Эффекты амилинов и агонистов амилина на моторику желудка могут быть идентифицированы, оценены или отобраны для использования способов, описанных ниже в примерах, или других известных или эквивалентных способов определения моторики желудка.

Один такой способ для использования в идентификации или оценке способности соединения замедлять моторику желудка включает:
(a) объединение тестируемого образца и тестовой системы, названный тестируемый образец включает один или более тестируемых соединений, а названная тестовая система включает систему для оценки моторики желудка, которая характеризуется тем, что демонстрирует, например, повышение плазменной глюкозы в ответ на введение в названную систему глюкозы или пищи;
(b) определение присутствия или величины подъема плазменной глюкозы в названной системе. Могут также использоваться положительные и/или отрицательные контроли. При желании к тестовой системе можно добавить предварительно определенное количество антагониста амилина (например, ^8-23сальмон кальцитонин).

Предпочтительно, агонистические соединения демонстрируют активность в исследовании связывания рецепторов в концентрациях менее чем приблизительно 1 - 5 нМ, предпочтительно менее 1 нМ и более предпочтительно менее приблизительно 50 пМ. В исследовании на камбаловидной мышце эти соединения предпочтительно демонстрируют величины ЭК₅₀ порядка менее чем приблизительно 1 - 10 микромолярных.

Исследование связывания рецепторов описано в патентной заявке США серийный N 670 231, поданной 15 марта 1991 и опубликованной 1 октября 1992 в качестве международной заявки N PCT/US 92/02125, описание которой включено в настоящий документ в качестве ссылки. Исследование связывания рецепторов является конкурентным исследованием, которое измеряет способность соединения специфически связываться с прикрепленными к мембранам рецепторами амилина. Предпочтительным источником мембранных препаратов, применяемых в этом исследовании, является базальный передний мозг, который включает в себя мембраны из nucleus accumbens и прилегающих областей. Соединения, подвергаемые исследованию, конкурируют за связывание с этими рецепторными препаратами с ¹²⁵1 крысиным амилином Bolton Hunter. Кривые конкуренции, которые строятся связанным количествам (В) как функции логарифмов концентраций лиганда, анализируются на компьютере с использованием нелинейного регрессионного анализа с 4-параметрически логистическим уравнением (Inplot program; Graph PAD Software., Сан Диего, Калифорния) или программы ALLFIT Delean и др. (ALLFIT версия 2.7 (NIH, Bethesda MD 20892)).

Munson, P. u Rodbard, D., Anal. Biochem., 107:220-239 (1980).

Исследования биологической активности агонистов амилина, включая агонистические аналоги амилина, на камбаловидной мышце выполнены с помощью ранее описанных методов (Leighton, B. u Cooper, G. J.S., Nature, 355:632-635 (1988); Cooper, G. J. S. , и др. Proc. Natl. Acad. Sci USA 85:7763-7766 (1988)). Активность агонистов амилина оценивалась посредством измерения ингибирования инсулинстимулированного синтеза гликогена в камбаловидавной мышце. Активность антагонистов амилина оценивалась посредством измерения возобновления инсулинстимулированного синтеза гликогена в присутствии 100 нМ крысиного амилина и антагониста амилина. Концентрации пептида, растворенного в буферных растворах, не содержавших носителей, определяли путем количественного аминокислотного анализа, как описано в настоящем документе. Способность соединений действовать в качестве агонистов в этом исследовании определяли путем измерения величин ЭК₅₀. Стандартные ошибки определяли путем обработки сигмоидальных кривых ответа на дозы с использованием 4-параметрического логического уравнения (De Lean, A., Munson, P.J. Guarda basso, V. u Radbard, D., (1988), ALLFIT версия 2.7, Национальный институт здоровья детей и развития человека, N.I.H. Bethesda, MD, 1 дискета). С помощью этих биологических исследований был охарактеризован целый ряд агонистов амилина. Было обнаружено, что соединения ¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин, отс-¹Лиз¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин, ¹⁸Арг^25,28,29Про-ч-амилин, отс-¹Лиз ¹⁸Арг^25,28,29Про-ч-амили, ^25,28,29Про-ч-амилин, отс-¹Лиз^25,28,29Про-ч-амилин и ²⁵Про²⁶Вал^25,28Про-ч-амилин конкурируют с амилином в исследовании связывания рецепторов. Эти соединения обладали ничтожно малой антагонистической активностью по результатам исследования на камбаловидной мышце и действовали как агонисты амилина. Сходные результаты были получены с другими агонистическими соединениями, перечисленными выше.

Соединения с активностью антагонистов амилина, применяемые в способах лечения гипокинезии желудка, включают соединения, описанные в патентной заявке США серийный N 07/794 288, зарегистрированной 19 ноября 1991, описание которой в полном объеме включено в настоящий документ в качестве ссылки.

Соединения, такие как описанные выше, приготавливаются с помощью стандартной методики твердофазного пептидного синтеза предпочтительно на автоматизированном или полуавтоматизированном пептидном синтезе. В типичном случае аминокислота, защищенная α -N-карбамоилом, и аминокислота, связанная с растущей пептидной цепью, на смоле соединяются при комнатной температуре в инертном растворителе, таком как диметилформамид, N-метилпирролидинон или метиленхлорид, в
в присутствии сопрягающих агентов, таких как дициклогексилкарбодиимид и 1-гидроксибензотриазол, в присутствии основания, такого как диизопропилэтиламин. Защищающая группа α-N-карбамоил удаляется из полученного соединения пептида и смолы с помощью реагента, такого как трифторуксусная кислота или пиперидин, и реакция сопряжения повторяется со следующей N-защищенной кислотой, которую нужно добавить к пептидной цепи. Подходящие N-защищающие группы хорошо известны специалистам; в настоящем изобретении предпочтительными являются т-бутилоксикарбонил (тБок) и фторенилметоксикарбонил (Фмок).

Растворители, производные аминокислот и 4-метилбензгидриламиновая смола, использованные в пептидном синтезаторе, приобретали у фирмы Applied Biosystems Inc. (Фостер Сити, Калифорния), если не указывается иной источник. Аминокислоты с защищенными боковыми цепями, приобретенные у фирмы Applied Biosystems Inc. , включали следующие: Бок-Арг (MtS)^*, Фмок-Арг(Pmc), Бок- Tpe(BZl), Фмок-Тре (t-Bu), Бок-Сер (BZl), Фмок-Сер (t-Bu), Бок-Тир(BrZ), Фмок-Тир(t-Bu), Бок-Лиз (Cl-Z), Фмок-Лиз (Boc), Бок-Глу(BZl), Фмок-Глу(t-Bu), Фмок-Гис(Trt), Фмок-Асн(Trt) и Фмок-Глн(Trt). Бок-Гис(BOM) приобретали у фирмы Applied Biosystems Inc. (Торранс, Калифорния), Анизол, метилсульфид, фенол, этандитиол и тиоанизол приобретали у фирмы Aldrich Chemical Company (Милуоки, Висконсин). Air Products and Chemicals (Аллентаун, Пенсильвания) поставили HF. Этиловый эфир, уксусную кислоту и метанол приобретали у фирмы Fisher Scientific (Питтсбург, Пенсильвания).

Твердофазный пептидный синтез выполняли на автоматическом пептидном синтезаторе (модель 430A, Applied Biosystems Inc., Фостер Сити, Калифорния), используя системы NMP/HOBt (Option 1) и реагенты тБок или Фмок (смотри Applied Biosystems User's Manual for the AB1 430A Peptide Synthesizer, версия 1.3B, 1 июля 1988, раздел 6, стр. 49-70), Applied Biosystems Inc., Фостер Сити, Калифорния) с кэппированием.

Соединения Бок-пептид-смола расщепляли с помощью HF (-5^oC - 0^oC, в течение 1 часа). Пептид экстрагировали из смолы попеременно водой и уксусной кислотой, а фильтраты лиофилизировали. Соединения Фмок-пептид-смола расщепляли с помощью стандартных методик (Introduction to Cleavage Techniquer, Applied Biosystems, Inc., 1990, стр. 6-12). Некоторые пептиды получали также с помощью синтезатора Advanced Chem. Tech. (модель MPS 350, Луисвилл, Кентукки). Пептиды очищали с помощью ЖХВР с обращенной фазой (препаративной и аналитической), используя систему Waters Delta Prep 3000. Для изоляции пептидов использовали C4, C8 или C18 препаративные колонки (10 μ , 2,2 x 25 см, Vydac, Гесперия, Калифорния), а чистоту определяли с помощью C4, C8 или C18 аналитических колонок (5 μ , 0,46 x 25 см, Vydac. Растворители (A= 0,1%, ТФУ/вода и B=0,1% ТФУ/CH₃CN) поступали в аналитическую колонку со скоростью 1,0 мл/мин и в препаративную колонку - со скоростью 15 мл/мин. Аминокислотный анализ выполняли на системе Waters Pico Tag и обрабатывали с помощью программы Maxima. Пептиды гидролизовали с помощью кислотного гидролиза паровой фазы (115^oC, 20-24 часа). Гидролизаты дериватизировали и анализировали стандартными методами (Cohen, S.A.Meys, M. u Tarrin, T.L. (1989), The Pico Tag Method: A Manual of Advanced Techniquer for Amino Acid Analisis, стр. 11-52, Millpore Corporation, Милфорд, Миннесота). Анализ бомбардировки быстрыми атомами был выполнен M-Scan, Incorporated (Вест Честер, Пенсильвания). Точное измерение массы было выполнено с помощью цезия иодида или цезия иодида/глицерола. Анализ плазменной десорбционной ионизации с использованием времени обнаружения полета был выполнен на масс-спектрометре Bio-Ion 20, Applied Biosystems.

Пептидые соединения, пригодные для настоящего изобретения, также можно приготовить с помощью методики рекомбинантной ДНК, известной специалистам. Смотри, например, Sambrook и др. Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2-издание Cold Spring Harbor (1989).

Соединения, упомянутые выше, образуют соли с различными неорганическими и органическими кислотами и основаниями. Такие соли включают соли, приготовленные с органическими и неорганическими кислотами, например HCl, HBr, H₂SO₄, H₃PO₄, трифторуксусной кислотой, уксусной кислотой, муравьиной кислотой, метансульфокислотой, толуолсульфокислотой, малеиновой кислотой, фумаровой кислотой и камфарсульфокислотой. Соли, приготовленные с основаниями, включают соли аммония, соли щелочных металлов, например натриевые и калиевые соли, и соли щелочноземельных металлов, например кальциевые и магниевые соли. Предпочтительны ацетаты, гидрохлориды и трифторацетаты. Эти соли можно приготовить с помощью стандартных методик, например реакцией свободной кислоты или основания, образующей продукт с одним или более эквивалентов соответствующего основания или кислоты, в растворителе или среде, в которой эта соль не растворяется, или в растворителе, таком как вода, которую затем удаляют в вакууме или вымораживанием, или обменом ионов существующей соли на другие ионы в подходящей ионообменной смоле.

Соединения, описанные выше, полезны с точки зрения их фармакологических свойств. В частности, соединения настоящего изобретения обладают активностью как агенты, замедляющие опорожнение желудка, о чем свидетельствует их способность снижать уровни глюкозы после приема пищи у млекопитающих.

Как описано в примере 1, оценивались эффекты амилина на тесты толерантности к глюкозе, введенной перорально, на собаках. Неожиданно было обнаружено, что амилин, который ранее был описан как гипергликемический агент (т.е., вызывающий повышение уровней глюкозы), снижал уровни глюкозы после приема пищи у этих экспериментальных животных. Амилин во всех испытанных дозах снижал скорость подъема плазменной глюкозы, а также пик плазменной глюкозы в тесте толерантности к глюкозе, введенной перорально.

Пример 2 описывает эффекты агониста амилина, АС-0137, на уровни глюкозы в плазме после приема пищи в клинических испытаниях на людях. Как при болюсном введении, так и при продолжительной внутривенной инфузии АС-0137, у пациентов с ювенильным сахарным диабетом наблюдалось дозозависимое снижение гипергликемии после приема пищи. Пример 3 описывает эффект продолжительной инфузии АС-0137 (трипроамилина) на уровни плазменной глюкозы после приема питания Sustacal® и после внутривенной нагрузки глюкозой. При внутривенной нагрузке глюкозой уровни плазменной глюкозы у пациентов, леченных 50 мкг/час АС-0137, не имели значимой разницы с таковыми пациентов, получавших плацебо. Однако у пациентов, которым давали питание Sustacal®, леченных 25 мкг/час или 50 мкг/час внутривенной инфузией АС-0137, уровни плазменной глюкозы у пациентов, леченных АС-0137, были ниже по сравнению с плацебо. АС-0137 снижал концентрации плазменной глюкозы после приема пищи у пациентов с инсулинзависимым диабетом после приема питательных веществ, но не оказывал измеримого эффекта на концентрации плазменной глюкозы после назначения внутривенной нагрузки глюкозой.

Как описано в примере 4, в 14-дневном двойном слепом клиническом исследовании с контролем плацебо пациенты с ювенильным диабетом, продолжавшие обычную терапию инсулином и самостоятельно вводимым трипро-амилином (АС- 0137) три раза в день, имели более низкие средние уровни глюкозы в крови после экспериментального приема пищи, чем пациенты, получавшие инсулин и плацебо. После 14 дней статистически значимый (P=0,02) глюкозосглаживающий эффект (измеренный как площадь под кривой глюкозы) наблюдался на 30 микрограммах, пики плазменных концентраций трипро-амилина находились в пределах таковых, найденных в крови недиабетиков. Индуцированные трипро-амилином снижения в ППК сопровождались средними снижениями 45-60 мг/дл пиков концентраций глюкозы в крови пациентов.

Как описано в примере 5, опорожнение желудка измеряли у нормальных и леченных инсулином спонтанно диабетических крыс ВВ, используя задержку окрашенного геля метилцеллюлозы, содержавшего Феноловый красный и вводившегося через желудочный зонд. Окрашенное содержимое из желудков, удаленных после умерщвления животных 20 минут спустя, определяли спектроскопическим методом и сравнивали с содержимом желудков крыс, умерщвленных немедленно после введения геля через желудочный зонд, для оценки опорожнения. Диабетические крысы демонстрировали значительно большее опорожнение желудка (90,3 ± 1,7% прохождения) по сравнению с нормальными крысами (Harlan Sprague Dawley 49,1 ± 4,7% прохождения, P < 0,001) и по сравнению с недиабетическими крысами ВВ (61,1 ± 9,2% прохождения; P < 0,001). Панкреатический β-клеточный пептид, амилин, являющийся дефицитным при ИЗСД, дозозависимым образом ингибировал опорожнение желудка у нормальных и у диабетических крыс. ЭД₅₀ реакции как у нормальных, так и у диабетических крыс составляла приблизительно 1 мкг, доза, которая вызывала пиковую концентрацию амилина 76 пМ спустя 20 минут после инъекции. Эти концентрации находятся в пределах, наблюдаемых in vivo. Эти результаты свидетельствуют в пользу предположения о том, что амилин участвует в физиологической регуляции прохождения пищи в двенадцатиперстную кишку.

Как описано в примере 6, поглощение пероральной нагрузкой меченой глюкозой измеряли натощак у крыс LA/N с ожирением. Предварительная инъекция антагониста амилиновых рецепторов, АС-0187, ускоряла появление в плазме трития из глюкозы. Помимо этого, предварительная инъекция антагониста амилина вызывала более высокий подъем плазменной глюкозы 15 минут впустя после введения через зонд и более раннее падение уровней плазменной глюкозы. Эти данные согласуются с тем, что антагонист амилина АС-0187 нейтрализует эффект эндогенно секретируемого амилина, ускоряя, таким образом, опорожнение желудка.

В дополнительных исследованиях на анестезированных крысах было показано, что амилин не влияет на всасывание глюкозы в кровь из тонкого кишечника. В этих экспериментах анестезированным крысам производили длительную инфузию крысиного амилина (0,35 нм/кг/мин) или физиологического раствора в случае контрольных животных в течение 3 часов. После одного часа инфузии амилина, через трубку, введенную через пищевод, животным болюсно вводили глюкозу (1 г/кг) в желудок или в двенадцатиперстную кишку. Поскольку исследования производились на анестезированных крысах, а не крысах, находящихся в обычном состоянии, их не использовали для изучения моторики желудка, например скорости опорожнения желудочного содержимого в двенадцатиперстную кишку. Тем не менее, эти исследования показали, что всасывание глюкозы из двенадцатиперстной кишки в кровь не задерживалось амилином. Для более точного определения того, воздействует ли амилин на транзит глюкозы из просвета тонкого кишечника в кровь, использовали различные препараты. У анестезированных крыс сегмент тонкого кишечника, соединяющийся с организмом животного посредством системы кровообращения, выводили наружу и помещали в него канюлю таким образом, чтобы тонкий кишечник можно было перфузировать растворами глюкозы известного состава. Животным также вставляли канюлю в артерию (для отбора образцов крови) и в вену (для инфузии амилина, инсулина и глюкозы). Просвет перфузировали раствором глюкозы, меченной тритием. Прохождение глюкозы из просвета кишечника в кровь измеряли по появлению тритиевой метки в плазме. Предположение о том, что такое появление трития в плазме действительно отражает поглощение глюкозы из кишки, было проверено введением блокатора транспорта глюкозы, флоридзина. Флоридзин в большой степени предотвращал транзит метки из просвета кишечника в плазму. Для гарантии того, что градиент глюкозы между просветом кишки и плазмой будет оставаться постоянным во время инфузии амилина, плазменную глюкозу "фиксировали" путем инфузии глюкозы, которая изменялась в ответ на изменения плазменной глюкозы. На этом препарате внутривенные инфузии амилина не влияли на скорость, с которой меченая глюкоза присутствовала в тонком кишечнике, проникала в плазму. Эти результаты показывают, что пониженное содержание глюкозы в крови, наблюдаемое у пациентов, леченных амилином, в исследованиях, описанных выше, вероятно не вызывалось понижением всасывания из тонкого кишечника, а скорее вызывалось пониженной скоростью прохождения желудочного содержимого в двенадцатиперстную кишку, т.е. задержкой опорожнения желудка.

Композиции, применяемые в настоящем изобретении, могут приготавливаться в формах, удобных для парентерального (включая внутривенное, внутримышечное и подкожное), или назального, или перорального введения. В некоторых случаях будет удобно помещать агонист амилина и другой агент, задерживающий опорожнение желудка, такой как глюкагон, в одну композицию или раствор для совместного введения. В других случаях может иметь преимущество введение другого агента, задерживающего опорожнение желудка, раздельно с названным амилином или агонистическим аналогом амилина. Подходящий формат введения наилучшим образом определит практикующий врач индивидуально для каждого пациента. Подходящие фармацевтически приемлемые носители и их состав описаны в стандартных руководствах, например в Remington's Pharmaceutical Sciences, E.W. Martin. Смотри также Wang, G.J. u Hanson, M.A. "Parenteral Formulations of Proteins and Peptides: Stability and Stabilizers", Journal of Parenteral Science and Technology. Технический доклад N 10, приложение 42:2 (1988). Подходящие рецептуры, включая гипогликемические агенты, такие как сульфонилмочевины, известны специалистам.

Соединения, применяемые в настоящем изобретении, могут приготавливаться в форме парентеральных композиций для инъекций или инфузий. Они могут, например, суспендироваться в инертном масле, особенно в растительном, таком как кунжутное, арахисовое, оливковое или в других приемлемых носителях. Предпочтительно, они суспендируются в водном носителе, например в изотоническом буферном растворе с pH около 5,6-7,4. Эти композиции можно стерилизовать с помощью стандартных способов стерилизации или с помощью фильтрования. Эти композиции могут содержать фармацевтически приемлемые вспомогательные вещества, требующиеся для лучшего соответствия физиологическим условиям, например pH буферные агенты. Подходящие буферы включают, например, буферы ацетат натрия/уксусная кислота. Форма дюрантного или "депо"-препарата с медленным высвобождением может применяться таким образом, чтобы терапевтически эффективные количества препарата доставлялись в кровяное русло в течение многих часов или дней после чрескожной инъекции или доставки.

Желаемой изотоничности можно достичь, используя хлорид натрия или другие фармацевтически приемлемые агенты, такие как декстроза, борная кислота, тартрат натрия, пропиленгликоль, многоатомные спирты (такие как маннитол или сорбитол) или другие неорганические или органические растворенные вещества. Хлорид натрия особенно предпочтителен для буферов, содержащих ионы натрия.

Если это желательно, растворы вышеупомянутых композиций можно загустить с помощью загустителя, такого как метилцеллюлоза. Они могут изготавливаться в форме эмульсии типа вода в масле или масло в воде. Можно применять любой из обширного ряда фармацевтически приемлемых эмульгирующих агентов, включая, например, порошок акации, неионные поверхностно-активные вещества (такие как Твин) или ионные поверхностно-активные вещества (такие как щелочные полиэфирные сульфаты спиртов или сульфонаты, например Тритон).

Композиции, применяемые в настоящем изобретении, приготавливают смешиванием ингредиентов согласно общепринятым методикам. Например, выбранные компоненты могут просто смешиваться в смесителе или в другом стандартном устройстве для приготовления концентрированной смеси, которую затем можно разводить до требуемой концентрации и вязкости добавлением воды или загустителя и, возможно, буфера для контроля pH или добавочного растворенного вещества для контроля осмотического давления.

Для применения врачом композиции будут создаваться в форме дозированных единиц, содержащих определенное количество амилина или агониста амилина, например агонистического аналога амилина с другим задерживающим опорожнение желудка агентом или без него, которое будет эффективным в одной или множественных дозах в отношении контроля сахара в крови на выбранном уровне. Терапевтически эффективные количества амилина или агониста амилина, такого как агонистический аналог амилина, для применения для контроля опорожнения желудка и при условиях, в которых опорожнение желудка благоприятным образом замедляется или регулируется, составляют такие количества, которые понижают уровни глюкозы в крови после приема пищи предпочтительно не более чем до 8-9 мМ, или такие количества, которые снижают уровни глюкозы в крови до желаемых. У диабетиков или других лиц с непереносимостью глюкозы уровни плазменной глюкозы выше, чем у здоровых людей. У таких пациентов можно получить благоприятное снижение или "сглаживание" уровней глюкозы в крови после приема пищи. Специалистам в данной области известно, что эффективное количество терапевтического агента варьирует в зависимости от многих факторов, включая возраст и вес пациента, его физическое состояние, уровень сахара в крови или снижение действия амилина, которое нужно получить, и других факторов.

Такие фармацевтические композиции полезны для применения с целью вызвать гипокинезию желудка у пациента и могут применяться также при других патологиях, когда необходимо снизить моторику желудка.

Эффективная дневная препятствующая опорожнению желудка доза соединений, включающих ¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин, отс-¹Лиз¹⁸Арг^25,28Про-ч-амилин, ¹⁸Арг^25,28,29Про-ч-амилин, отс-¹Лиз¹⁸Арг^25,28,29Про-ч-амилин, ^25,28,29Про-ч-амилин, отс-¹Лиз^25,28,29Про-ч-амилин и ²⁵Про²⁶Вал^25,28Про-ч-амилин, в типичном случае будет находиться в пределах 0,01 или 0,03 до приблизительно 5 мг/день, предпочтительно приблизительно от 0,01 или 0,5 до 2 мг/день и более предпочтительно приблизительно от 0,01 или 0,1 до 1 мг/день, для пациента весом 70 кг, при введении единичной или разделенными дозами. Точную дозу, которая должна вводиться, определяет лечащий врач; она зависит от того, находится ли конкретное соединение в процитированном перечне, а также от возраста, веса и состояния пациента. Введение должно начинаться при первом проявлении симптомов или вскоре после постановки диагноза сахарного диабета. Введение может осуществляться путем инъекции, предпочтительно подкожной или внутримышечной. Активные при пероральном приеме соединения могут приниматься внутрь, однако дозы должны быть увеличены в 5-10 раз.

В целом, при лечении или профилактике повышенных, неадекватных или нежелательных уровней глюкозы в крови после приема пищи соединения настоящего изобретения могут вводиться пациентам, нуждающимся в таком лечении, в дозах, подобных тем, которые приведены выше, однако, соединения вводятся более часто, например один, два или три раза в день.

Антагонисты амилина, применяемые для лечения гипокинезии желудка, могут вводиться в дозах от 0,1 до 30 мг/день, предпочтительно от 0,3 до 10 мг/день и более предпочтительно от 0,1 до 3 мг/день. Введение может быть, например, подкожным или внутримышечным. Активные при пероральном приеме соединения могут приниматься внутрь, однако дозы должны быть увеличены в 5-10 раз.

Чтобы помочь лучшему пониманию настоящего изобретения, в описание включены следующие примеры, которые описывают результаты серий экспериментов. Эксперименты, относящиеся к настоящему изобретению, не должны, разумеется, истолковываться как ограничивающие изобретение; а такие варианты, известные в настоящее время или разработанные позже, которые находятся в компетенции специалиста, попадают в объем настоящего изобретения, как описано в настоящем документе и заявлено ниже.

Пример 1
Предыдущие исследования продемонстрировали, что внутривенные инъекции амилина голодным и накормленным крысам в условиях теста на толерантность к глюкозе могут снижать падение плазменной глюкозы и повышать плазменный лактат дозозависимым образом. Реакции на инсулин также существенно снижались инфузиями амилина у голодных животных.

Однако следующие исследования и эксперименты показали, что инфузия амилина снижает уровни плазменной глюкозы у собак, возникшие в ответ на пероральную нагрузку глюкозой. Целями этих исследований были:
(1) оценить изменения плазменной глюкозы, лактата и инсулина, возникшие в ответ на пероральную нагрузку глюкозой;
(2) оценить эффекты внутривенного введения амилина на эти показатели;
(3) оценить эффективность антагониста амилина, АС-0253 (ацетил-^11,18Арг, ³⁰Арг, ³²Тир-^9-32кальцитонина (сальмона)) в реверсировании амилининдуцированных изменений глюкозы плазмы крови.

Для этого исследования использовали нечистокровных собак (9 самцов весом 12-17 кг). Животных не кормили перед каждым исследованием в течение ночи. Каждое животное служило собственным контролем во всех опытах. Животных уравновешивали в течение 30-60 минут перед началом каждого опыта.

Начинали вводить носитель или амилин ±АС-0253 в t = -30. Скорость введения доз амилина составляла 50, 100 и 300 пмоль/кг/мин. Скорости введения АС-0253 составляли 500 и 1500 пмоль/кг/мин. 25% глюкозу (1 г/кг) вводили через рот в t = 0 минут. Введение амилина ±АС-0253 прекращали в t = 120 минут. Образцы для определения инсулина, глюкозы и лактата получали через 15-минутные интервалы от t = -45 до t = 180 минут. Образцы для определения крысиного амилина и АС-0253 брали в t = 60 и 120 минут.

У здоровых собак пик плазменной глюкозы наблюдался между 30 и 45 минутами после пероральной нагрузки глюкозой. Несмотря на то, что наблюдалась значительная вариабельность при сравнении животных друг с другом, характер ответа у каждого животного воспроизводился. Амилин при всех испытанных скоростях введения снижал как скорость подъема плазменной глюкозы, так и ее пик. Во время инфузии амилина плазменная глюкоза достигала плато при более низких значениях, чем в контрольных экспериментах, на 30-45 минуте, и начинала вновь возрастать после прекращения инфузии амилина. Между скоростями введения доз амилина 50, 100 и 300 пмоль/кг/мин не наблюдалось различий в изменениях плазменной глюкозы. Фиг. 5 демонстрирует действие амилина (50 пмоль/кг/мин) на уровне плазменной глюкозы после перорального введения глюкозы.

Скорость введения доз амилина 50 пмоль/кг/мин била выбрана для проведения экспериментов, оценивающих эффективность АС-0253 в отношении реверсирования амилининдуцированных изменений плазменной глюкозы. АС-0253 до 1500 пмоль/мин не реверсировал полностью эффекты амилина (50 пмоль/кг/мин). АС-0253 в отдельности не оказывал влияния на изменения плазменной глюкозы. Влияние амилина и АС-0253 на плазменный лактат было незначительным.

Пример 2
В клинических испытаниях агониста амилина АС-0137 участвовали 24 пациента мужского пола с инсулинзависимым сахарным диабетом. Каждый пациент слепым способом был отнесен к одной из четырех групп, получавших плацебо, 30, 100 или 300 мкг АС-0137. Пациенты в каждой группе проходили два периода попеременно для изучения внутривенного болюсного введения лекарства по сравнению с внутривенной инфузией. Каждый период состоял из трехдневного пребывания в единице наблюдения. В каждом случае начальный день исследования посвящался акклиматизации к условиям эксперимента. Второй и третий день посвящались перекрестным исследованиям плацебо и активного лечения. Например, пациенты, отобранные для получения внутривенного болюса, далее получали внутривенно болюсно АС-0137 в один день и внутривенно болюсно плацебо - в другой день (или в обратном порядке - сначала болюсно плацебо, а потом - болюсно АС-0137). Спустя две недели пациенты получали ту же дозу АС-0137 посредством другого способа введения, т. е. внутривенной инфузии. Перекрестный способ введения лекарства и плацебо на 2 и 3 дни выполнялся так же, как в первом случае. Шесть пациентов, отнесенных в группу плацебо, получали плацебо во все дни исследования.

В дни исследования пациентам ставили внутривенные катетеры по меньшей мере за 30 минут до начала исследования. За 15 минут до введения дозы пациенты принимали свою обычную дозу инсулина посредством подкожной инъекции. Во время 0 пациенты получали внутривенно болюсно назначенную дозу АС-0137 или плацебо в течение двух минут или продолжительную инфузию АС-0137 или плацебо, которая продолжалась два часа. Скорость инфузии подбиралась таким образом, чтобы ввести назначенную дозу лекарства в течение двух часов. Тридцатью минутами позже пациенты съедали свой обычный завтрак. Образцы крови брали между -30 и 300 минутами для измерения уровней АС-0137 в плазме и уровней глюкозы в плазме.

Как следует из фиг. 2-4, уровни лекарства в плазме показывали ожидавшийся пик вскоре после болюсного введения, а затем исчезало из фракции плазмы с очевидной кинетикой первого порядка. Напротив, продолжительная инфузия приводила к появлению приблизительно стабильных уровней в течение 30 минут, а затем - к поддерживанию этих уровней в течение всего периода инфузии. После прекращения инфузии уровни в плазме исчезали сходным с внутривенным болюсным введением образом.

Профили плазменной глюкозы обнаруживали некоторые неожиданные и интересные результаты. По оценке у пациентов, получавших плацебо в каждом случае, уровни плазменной глюкозы поднимались выше исходных за 60-90 минут, и оставались повышенными по меньшей мере до 240 минут. Внутривенное болюсное введение АС-0137 в дозе 30 мкг не вызывало очевидных изменений уровней глюкозы. При дозе болюса 100 мкг подъем глюкозы после приема пищи отчетливо задерживался и был менее выражен. При дозе болюса 300 мкг подъем уровней глюкозы после приема пищи был существенно снижен.

При продолжительной внутривенной инфузии наблюдалось дозозависимое снижение гипергликемии, вызванной приемом пищи. Данные при инфузии 10 мкг/час вызывали весьма сомнительный эффект, а после увеличения скорости инфузии до 50-150 г/час наблюдалось разительное снижение подъема уровней глюкозы, вызванного приемом пищи. Сходные тенденции были очевидны в исследованиях, в которых применялось болюсное введение лекарства.

Пример 3
Одинарное слепое в контрольном плацебо двухэтапное перекрестное исследование с минимум 15-часовым периодом для смыва между обработками было предпринято для дополнительной демонстрации эффекта трипро-амилина (АС-0137) на снижение гипергликемии, вызванной приемом пищи, и для подтверждения того факта, что снижение гипергликемии, вызванной приемом пищи, является прежде всего гастроинтестинальным эффектом. 27 пациентов с инсулинзависимым сахарным диабетом были распределены в две группы с разным уровнем доз, в которых применялись два типа тестов на толерантность. Пациенты получали лечение с помощью продолжительного микроинфузионного нагнетания А-0137 и плацебо в соответствии с перекрестным способом проведения эксперимента. Пациентов разделили на три группы по 9 человек каждая следующим образом: Группа А получали питание Sustacal® и АС-0137 в дозе 25 мкг/час. Группа В получала питание Sustacal® и АС-0137 в дозе 50 мкг/час. Группа С получала внутривенную нагрузку глюкозой и АС-0137 в дозе 50 мкг/час.

Пациенты оставались в клинике в течение трех дней. В первый день эксперимента пациенты акклиматизировались в клинике. На 2 и 3 дня пациенты проходили двухэтапное перекрестное исследование с применением АС-0137 и плацебо. Помимо этого, пациенты получали питание Sustacal® или внутривенный тест на толерантность к глюкозе в зависимости от типа группы.

В течение первого дня проводили стабилизацию обычной дозы инсулина и приема калорий у каждого пациента, который затем придерживался этих доз инсулина и диеты в течение всего времени пребывания в клинике.

Приблизительно в 0700 час (Т=0) начинали продолжительную инфузию испытуемого лекарственного средства. В Т=30 минут пациенты получали свою обычную утреннюю дозу инсулина. В T=60 минут пациенты получали стандартизированное питание Sustacal®, содержавшее 355 калорий, или внутривенную нагрузку глюкозой 300 мг/кг в виде внутривенной инфузии D₅₀W течение пяти минут с помощью инфузионного насоса. Тип теста на толерантность определялся в соответствии со схемой рандомизации. Образцы крови отбирали через регулярные интервалы времени для измерения уровней глюкозы, лактата и инсулина, а также для определения плазменных концентраций АС-0137. Введение испытуемого лекарства прекращали в t = 300 минут.

Утром третьего дня снова были поставлены внутривенные системы, как во 2 день. Пациенты получали свою обычную дозу инсулина перед завтраком, как во 2 день. Пациенты получали плацебо или лекарственное средство перекрестно с использованием того же внутривенного способа введения и схемы, что и в предыдущий день (т.е., пациенты, которые получали инфузию АС-0137 во второй день, в третий день получали инфузию плацебо). Вновь применяли, как во второй день, идентичное стандартизированное питание Sustacal® или внутривенную нагрузку глюкозой. По окончании периода отбора образцов крови внутривенные системы удаляли.

Как показано на фиг. 10, при внутривенной нагрузке глюкозой уровни плазменной глюкозы у пациентов, леченных 50 мкг/час АС-0137, не отличались значимо от таковых у пациентов, получавших плацебо. Эти различия в постинъекционных концентрациях глюкозы были статистически значимыми, когда сравнивали площади под кривыми глюкозы, скорректированными для исходных величин (P= 0,0015). Таким образом, наблюдавшаяся сниженная гипергликемия, вызванная приемом пищи, во время введения АС-0137 была подтверждена при использовании стандартизированного питания в присутствии значительно более низких плазменных концентраций АС-0137, чем те, что применялись ранее.

Однако, как можно видеть из фиг. 9 и 10, у пациентов, получавших питание Sustacal® и 25 мкг/час или 50 мкг/час АС-0137 внутривенной инфузией, уровни плазменной глюкозы были снижены у леченных АС-0137 пациентов по сравнению с плацебо.

АС-0137 в переносимых фармакологических дозах снижал концентрации плазменной глюкозы после приема пероральных нутриентов у пациентов с инсулинзависимым диабетом, однако не оказывал измеримого влияния на концентрации плазменной глюкозы после введения внутривенной нагрузки глюкозой. Эти результаты согласуются с идеей о том, что АС-0137 модулирует поглощение принятых per os нутриентов из кишечника, и показывают, что изменение скорости опорожнения желудка ответственно по крайней мере частично за этот эффект.

Пример 4
Рандомизированная двойным слепым методом параллельная группа с контролем плацебо была создана для определения эффекта трипро-амилина (АС-0137) на уровни плазменной глюкозы после перорального приема стандартизированного питания Sustacal® (Mead - Johnson). В 14-дневном клиническом испытании участвовало 72 пациента с инсулинзависимым сахарным диабетом. Каждый пациент случайным способом отбирался в одну из четырех экспериментальных групп, получавших плацебо, 30, 100 или 300 мкг трипро-амилина посредством подкожной инъекции три раза в день в течение 14 дней. Во время всего периода испытания пациенты применяли свою обычную схему введения инсулина. В день 1 (исходный), 7 и 14 выполнялись тесты на толерантность к стандартизированному питанию.

Для тестов на толерантность к стандартизированному питанию пациентам давали жидкое питание Sustacal® (360 мл, содержащие 360 калорий) в 0800 часов. Пациенты воздерживались от приема пищи или жидкости (кроме воды) с 22⁰⁰ часов вечера предыдущего дня. Пациенты не вводили себе свою обычную утреннюю дозу инсулина вплоть до 30 минут до приема питания Sustacal®. Для исходного теста, в 1 день, трипроамилин (или плацебо) не вводился до завершения теста. В 7 и 14 дни трипро-амилин (или плацебо) вводили отдельной инъекцией в то же время, что и обычную утреннюю дозу инсулина. Образцы крови для определения уровней сывороточной глюкозы отбирали на - 30, 0, 30, 60, 120 и 180 минутах относительно начала испытания. Время 0 является временем, в которое пациент начинал принимать питание Sustacal®.

Как показано в таблице 1 ниже и на фиг. 8, 12 и 13, спустя 14 дней наблюдался статистически значимый (P=0,02) сглаживающий уровни глюкозы эффект (измеренный как площадь под кривой) при уровнях доз 30 мкг и 100 мкг. Тpипpo-амилин (АС-0137)-индуцированные сокращения площади под кривой (ППК) сопровождали средние снижения до 45 мг/дл - 60 мг/дл пиков концентраций глюкозы в крови пациентов.

(а) ППК представляет площадь под кривой концентрации глюкозы относительно значения глюкозы перед приемом пищи, от начала экспериментального приема пищи и до 3 часов после него. Изменение ППК представляет величину, равную значению перед введение дозы минус значение на 14 день, для каждого пациента, проходившего испытания оба дня.

(b) значения P, полученные из непараметрического теста Вилкоксона.

Пример 5
Выло предпринято следующее исследование для изучения эффектов агонистов амилина на опорожнение желудка на грызунах со спонтанным аутоиммунным диабетом, леченных инсулином крысах ВВ.

В экспериментах использовали самцов крыс Harlan Sprague Dawley (HSD) (161-244 г) и Biobreeding (BB) (181-405 г), полученных из питомника Mllegard, Дания, в 1989 году. Диагноз диабета крысам BB был подтвержден по результатам глюкозурии в течение по меньшей мере 2 дней, после чего их ежедневно лечили подкожными инъекциями рекомбинантного инсулина человека длительного действия (Humulin - U, Eli Lilly, Индианаполис). Инсулиновая терапия имела целью поддерживать глюкозу, но сводить к минимуму кетоновые тела в моче, чтобы избежать гибели животных от гипогликемии. Фактически глюкозурия обнаруживалась в 88% измерений, а кетонурия - в 52%. Средняя продолжительность диабета составляла 53 ± 5 дней, а дневная потребность в инсулине составляла 4,7 ± 0,3 единицы. Животных содержали при 22,7 ± 0,8^oC и 12:12 часовом цикле смены света и темноты (эксперименты выполнялись при световом цикле), и кормили, и снабжали водой ad libitum (рацион LM-485, Tehlad, Мэдисон, Висконсин).

Определение опорожнения желудка способом, описанным ниже, обычно проводилось после приблизительно 20-часового голодания животных, чтобы гарантировать отсутствие в желудке химуса, который мог помещать спектрофотометрическим измерениям поглощения. Однако крысам с диабетом, леченным инсулином длительного действия (Ultralente), нельзя было голодать 20 часов. Периоды голодания свыше 6 часов приводили к гипогликемии. Такие животные поэтому воздерживались от пищи только 6 часов перед измерением опорожнения желудка. Нормальные крысы лишались пищи на сроки 6 или 20 часов перед экспериментом. Мы заметили, что даже нормальные крысы BB имели повышенные концентрации гликозилированного гемоглобина, что возможно свидетельствовало о субклиническом недостатке инсулина. Таким образом, для сравнения с диабетическими крысами использовали здоровых крыс Harlan Sprague Dawley и BB. Так, имелось 5 экспериментальных групп:
(1) Здоровые (без диабета) крысы Harlan Sprague Dawley, голодавшие 6 часов, n = 8.

(2) Здоровые (без диабета) крысы BB, голодавшие 6 часов, n = 6.

(3) Крысы BB с диабетом, голодавшие 6 часов, = 10.

(4) Здоровые (без диабета) крысы Harlan Sprague Dawley, голодавшие 20 часов, n = 20.

(5) Здоровые (без диабета) крысы BB, голодавшие 20 часов, n = 7.

Крысы (в сознании) получали через желудочный зонд 1,5 мл не содержавшего калорий геля с 1,5% метилцеллюлозы (М-0262, Со., Сент Луис, Миссури) и 0,05% фенолового красного в качестве индикатора. Спустя двадцать минут после зондирования крыс анестезировали 5% галотаном, обнажали желудок и пережимали пилорический и нижний пищеводный сфинктеры с помощью артериальных зажимов, удаляли и опоржняли в щелочной раствор фиксированного объема. О содержимом желудке судили по интенсивности фенолового красного в щелочном растворе, которую измеряли поглощением на длине волн 560 нм. В большинстве экспериментов желудок был свободен. В других экспериментах содержавшее частицы содержимое желудка центрифугировали, чтобы просветлить раствор для измерения поглощения. Там, где разведенное желудочное содержимое оставалось мутным, спектроскопическое поглощение фенолового красного вычисляли как разницу между таковым, присутствующим в щелочном разбавителе и в подкисленном разбавителе. В отдельных экспериментах на 7 крысах рассекали и желудок, и тонкий кишечник и опорожняли их в щелочной раствор. Количество фенолового красного, которое могло быть выделено из верхней части желудочно-кишечного тракта за 20 минут зондирования, составляло 89 ± 4%. Для подсчета максимального выделения краски, составлявшего менее 100%, содержимое, оставшееся в желудке после 20 минут, выражали как долю от выделенного желудочного содержимого у контрольных крыс, умерщвленных немедленно после зондирования в том же эксперименте.

В исходных исследованиях (где амилин не вводился) опорожнение желудка после 20 минут определяли в пяти экспериментальных группах, как описано выше. В исследованиях зависимости ответа от дозы крысиный амилин (Bachem, Торранс, Калифорния), растворенный в 0,15 М солевом растворе, вводили в виде 0,1 мл подкожного болюса в дозах 0, 0,01, 0,1, 1, 10 или 100 мкг за 5 минут до кормления через зонд 46 крысам Harlan Sprague Dawley (без диабета), голодавшим 20 часов (n = 17, 2, 8, 8, 6, 5, соответственно) и 29 крысам BB(с диабетом), голодавшим 6 часов (n = 10, -, 3, 3, 3, 10 соответственно).

В отдельном эксперименте для оценки изменений в концентрациях плазменного амилина, которые вызывала эффективная доза амилина под кожу, отбирали образцы крови из хвостов 6 анестезированных галотаном крыс после подкожной инъекции 1 мкг (n = 3) или 10 мкг (n = 3) крысиного амилина. В другом эксперименте концентрации плазменного амилина сравнивали у не голодавших крыс Harlan Sprague Dawley (n = 8) и не голодавших диабетических крыс BB (n = 5). Плазму из 250 мкл образцов, взятых через 10-минутные интервалы, отделяли и замораживали при -20^oC для двухсайтового иммуноэнзимометрического анализа, разработанного в нашей стране.

Для выполнения иммунологического анализа черные микротитрационные планшеты (Dynatech, Чантилли, Виргиния) покрывали антителами F024-4.4 (Phelps, J. L., Blase, E., Koda, J.E., не опубликовано) посредством инкубации в течение ночи при 4^oC с раствором, содержавшим 20 EDr антител на мл в 50 мМ карбонате, pH 9,6. Планшеты отмывали с помощью 0,05 М Трис/0,15 хлорид натрия /0,02% азид натрия/ 0,1% Твин 20 (TBS/Твин) и блокировали 1% порошком сухого нежирного молока в том же карбонатном буфере в течение одного часа при комнатной температуре. Образцы оттаивали во льду и разводили 4% БСА под слоем 200 мг/дл бычьего холестерина (Miler Pentex reagents, Miles Laboratoties, Канкаки, Иллинойс) по необходимости. Образцы или стандарты помещали на покрытые и блокированные планшеты и инкубировали в течение одного часа при комнатной температуре. После отмывания добавляли F025-27 выявляющие антитела, конъюгированные с щелочной фосфатазой. Сопряжение антитела с ферментом выполняли с помощью набора для конъюгации щелочной фосфатазы имидом малеиновой кислоты фирмы Pierce Immunochemical Co. (Рокфорд, Иллинойс). Конъюгат инкубировали в течение трех часов при комнатной температуре, после чего планшеты тщательно отмывали физиологическим раствором с Трис-буфером. Связанный фермент выявляли инкубацией планшетов с флюоресцентным субстратом 4-метиллюмбеллиферилфосфатом в концентрации 50 ЕДг/мл в 1 М диэтаноламине/0,5 мМ MgCl, pH 9,8, в течение 40 минут при комнатной температуре. Флюоресцентный сигнал измеряли с помощью планшет-ридера Dynatech Mircofluor, а результаты анализировали с помощью программы Multicalc Software (Wallac, Гейзерсбург, Мериленд). Концентрации амилина в образцах плазмы определяли путем сравнения со стандартной кривой, полученной в том же исследовании. При этой методике анализ имел минимум улавливаемой концентрации 2 пМ.

Кривые зависимости ответа от дозы для опорожнения желудка сводили к 4-параметрической логистической модели, применяли для выведения ЭД₅₀ повторяющуюся методику наименьших квадратов (ALL FlT, в 2.7, NlH, Мэриленд). Поскольку ЭД₅₀ распределяется логарифмически, ее выражают ± стандартная ошибка логарифма. Сравнения пар выполняли с помощью одностороннего анализа вариантов и теста множественных сравнений Стьюдента-Ньюмена-Келса (Instat в 2.0, Graph Pad Software, Сан-Диего), используя уровень значимости P < 0,05.

У 8 неголодавших крыс Harlan Sprague Dawley концентрации циркулирующего амилина составили 11,7 ± 1,4 пМ (95% Cl 8.4-14,9 пМ). Для сравнения, концентрации амилина у 5 не голодавших крыс BB со спонтанным диабетом не выявлялись.

Фракции краски, остававшиеся 20 минут спустя после введения через желудочный зонд фенолового красного, вместе с соответствующими статистическими сравнениями приведены в таблице 2. Как у крыс Harlan Sprague Dawley, так и у крыс BB (без диабета), опорожнение краски спустя 20 минут было одинаковым, независимо от того, голодали животные 6 часов или 20 часов. Это означает, что продолжительность голодания (в пределах 6-20 часов) не оказывала значимого влияния на опорожнение желудка, определявшееся указанным способом.

Содержимое желудка выражено как часть от того, которое могло выделиться немедленно после кормления через зонд у 2-3 крыс по отдельности, участвовавших в том же исследовании.

a = не отличается от крыс, голодавших 20 часов
b = отличается от крыс HSD, голодавших 6 часов (P < 0,001)
c = отличается от крыс BB (без диабета), голодавших 6 часов (P < 0,001)
Заслуживает внимание тот факт, что опорожнение желудка у крыс BB с диабетом было значимо быстрее (P < 0,01-0,001), чем в любой из 4 остальных экспериментальных групп (т. е. , у животных без диабета). Наблюдение, что крысы BB с диабетом имели более высокую скорость опорожнения желудка, чем крысы BB без диабета, наводит на мысль о том, что это обстоятельство связано с наличием диабета, а не просто связано с особенностями линии BB.

Принимая во внимание методологические трудности, упомянутые выше, эффекты амилина изучали на крысах Harlan Sprague Dawley без диабета, голодавших 20 часов, и на крысах BB с диабетом, голодавших 6 часов. В случае, когда инъекции амилина (подкожно) делали за 5 минут до кормления через желудочный зонд с феноловым красным в качестве индикатора, наблюдалась дозозависимая супрессия опорожнения желудка. Супрессия опорожнения желудка была такова, что выделение краски у нормальных крыс HSD, которым вводили 1 мкг амилина, и у крыс с диабетом, которым вводили 1 г, было таким же, как то, что наблюдалось немедленно после кормления через желудочный зонд (P=0,22, 0,14). Доза, при которой наблюдалось 50% от максимального изменения опорожнения желудка (ЭД₅₀), у нормальных крыс составляла 0,43 г (0,60 нмоль амилина на кг веса тела) ±0,19log единиц. У крыс с диабетом ЭД₅₀ для супрессии опорожнения желудка составляла 2,2 мкг (2,3 нмоль/кг) ± 0,18log единиц. По обработанным кривым, приведенным на фиг. 14, можно видеть, что доза амилина приблизительно 2 мкг, введенная крысе с диабетом, восстанавливали опорожнение желудка до скорости, наблюдавшейся у нормальных крыс, не получавших амилина.

Как показано на фиг. 15, когда 3 крысам подкожно инъецировали 1 мкг крысиного амилина, его концентрация в плазме, измеренная 10 минутами позже, составляла 66 ± 10 пМ, а пиковая концентрация через 20 минут составляла 74 ± 26 пМ. У 3 крыс, которым инъецировали подкожно болюсно 10 мкг, соответствующие 10- и 20-минутные концентрации составляли 347 ± 43 пМ и 301 ± 57 пМ соответственно. 1 мкг подкожная доза амилина, которая ингибирует опорожнение желудка приблизительно на 50% в течение 20 минут (ЭД₅₀) должна начинать работать вскоре после инъекции, вызывая эффект спустя 20 минут. Эффект, который начинался около 20 минут после инъекции, например, не может быть выявлен с помощью этой системы. Из этого следует, что концентрации в плазме, эффективные на 50% для ингибирования опорожнения желудка ((ЭД₅₀), наблюдались задолго до достижения пика плазменных концентраций в 74 пМ и, следовательно, были значительно меньше 74 пМ.

Результаты этих экспериментов показывают, что амилин сильно и дозозависимым образом ингибирует опорожнение желудка.

Пример 6
Эксперименты, описанные в этом примере, были выполнены для изучения эффектов антагониста рецепторов амилина на толерантность к глюкозе, принятой per os, и всасывания трития, находящегося в меченой глюкозе, принятой per os в качестве нагрузки.

Поглощение принятой через рот нагрузки глюкозой определяли у 11 находящихся в сознании голодавших 24 часа тучных (500 - 600 г) крыс LA/N в двух вариантах, по 14 дней каждый. В одном варианте крысам подкожно инъецировали 3 мкг селективного антагониста амилина АС-0187 (ац-¹⁰N^32Y8-32сальмон кальцитонин) за три минуты до кормления через желудочный зонд. В другом варианте крысам инъецировали только носитель физиологический раствор. Крысам вводили посредством желудочного зонда 5 мкКи /3³H/глюкозы в 1 мл 50% глюкозы. Образцы крови, взятые после анестезии их хвостов через 0, 15, 30, 60, 90 и 120 минут после кормления через зонд, исследовали на наличие трития из глюкозы и самой глюкозы.

Как показано на фиг. 16, предварительная инъекция антагониста амилина, АС-0187, ускоряла появление трития (из глюкозы) в плазме на 48% спустя 15 минут после кормления через желудочный зонд (P < 0,02) и на 45% (P < 0,001) спустя 30 минут после кормления через желудочный зонд (парный t-тест). Как показано на фиг. 17, предварительная инъекция АС-0187 приводила также к более выраженному подъему уровня плазменной глюкозы спустя 15 минут после введения через 0,5 г глюкозы (5,89 ± 0,17 до 8,33 ± 0,28 мМ по сравнению с 6,83 ± 0,28 мМ, P < 0,001, парный t-тест). Помимо этого, у животных, которым вводили АС-0187, плазменная глюкоза снижалась раньше (6,89 ± 0,28 мМ по сравнению с 8,15 ± 0,39 мМ спустя 60 минут после введения глюкозы через желудочный зонд, P < 0,001, парный t-тест).

Таким образом, у тучных крыс LA/N селективный антагонист амилина повышал скорость появления в плазме меченой глюкозы после пероральной нагрузки глюкозой, а также повышал скорость подъема и падения плазменной концентрации немеченой глюкозы. Эти данные подтверждают, что антагонист амилина, противодействуя эффекту эндогенно секретируемого амилина, ускоряет, таким образом, опорожнение желудка.

Формула изобретения

1. Способ снижения моторики желудочно-кишечного тракта или замедления опорожнения желудка у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества амилина или агониста амилина, причем агонист амилина не является ПРГК или кальцитонином.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ охватывает снижение моторики желудка.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что указанный способ охватывает задержку опорожнения желудка.

4. Способ по п. 1, 2 или 3, отличающийся тем, что указанный пациент подвергается гастроинтестинальной диагностической процедуре.

5. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная гастроинтестинальная диагностическая процедура является радиологическим исследованием.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что указанная гастроинтестиальная диагностическая процедура является магнитно-резонансной томографией.

7. Способ по п. 1, 2 или 3, отличающийся тем, что указанная моторика желудка связана с поражением желудочно-кишечного тракта.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что указанное поражение желудочно-кишечного тракта является спазмом.

9. Способ по п.8, отличающийся тем, что указанный спазм связан с поражением, выбранным из группы, состоящей из острого дивертикулита, или поражения желчевыводящих путей, или поражения сфинктера Одди.

10. Способ лечения возникающего после приема пищи демпинг-синдрома у пациента, включающий введение указанному пациенту терапевтически эффективного количества агониста амилина, причем агонист амилина не является ПРГК или кальцитонином.

11. Способ лечения возникающей после приема пищи гипергликемии, включающий введение терапевтически эффективного количества агониста амилина, причем агонист амилина не является ПРГК или кальцитонином.

12. Способ по п.11, отличающийся тем, что указанный агонист амилина является амилином.

13. Способ по п. 12, отличающийся тем, что указанный амилин является крысиным амилином.

14. Способ лечения возникающей после приема пищи гипергликемии, являющейся следствием сахарного диабета типа 2, который включает введение терапевтически эффективного количества агониста амилина, причем агонист амилина не является ПРГК или кальцитонином.

15. Способ по любому из п.1-3, 10, 11 или 14, отличающийся тем, что указанный агонистический аналог амилина является ^25,28,29Про-ч-амилином.

16. Способ лечения при проглатывании токсина, включающий введение амилина или агониста амилина в количестве, эффективном для предотвращения или уменьшения прохождения содержимого желудка в кишечник, и аспирацию содержимого желудка.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18