Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro

 

Изобретение относится к медицине и может быть использовано, в частности, в фармакологии. Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro заключается в использовании тест-объектов. При этом в качестве тест-объекта используют ферменты глутатионредуктазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и каталазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1. Способ обладает высокой специфичностью и чувствительностью. 3 табл.

Изобретение относится к медицине, и может быть использовано, в частности, в фармакологии.

Разработка современных эффективных экспресс-методов для скрининга веществ, обладающих антиоксидантной активностью, является актуальной в связи с необходимостью сокращения сроков исследования веществ, обладающих различной биологической активностью. Эта задача может быть решена путем разработки молекулярных тест-систем с использованием ферментов в качестве тест-объектов.

Антиоксидантную активность оценивают на различных моделях.

Известен стандартный микробиологический метод хемолюминесценции, позволяющий выявлять вещества, обладающие антиоксидантной активностью, с помощью тест-объекта, в качестве которого используют перитонеальные макрофаги [Руководство по экспериментальному (доклиническому) изучению новых фармокологических веществ, Минздрав РФ, 2000 г.].

Наиболее близким способом к заявляемому относится известный метод определения антиоксидантной активности с использованием в качестве тест-объекта нейтрофилов крови. Ингибировался зимозаном процесс кислородного взрыва и исследовался процесс его ингибирования исследуемым препаратом [патент РФ 2115425].

Исследование в известном способе проводились на цельной крови донора. Гепаринизированная кровь, полученная из локтевой вены, в количестве 0,1 мл добавлялась в анализатор хемолюминометра, затем добавлялось по 0,1 мл раствора люминола и зимозана (для индуцированного кислородного взрыва в нейтрофилах крови). В клетках крови нарастал кислородный взрыв, что регистрировалось по увеличению хемолюминесценции. На пике кислородного взрыва в анализатор вводился препарат и измерялось изменение люминесценции. Контролем служила кровь, к которой не добавлялся препарат.

Недостатком этих способов выявления веществ, обладающих антиоксидантной активностью, является большая трудоемкость и необходимость постоянного контроля за сохранностью и чистотой стандартных тест-объектов, что значительно увеличивает экономические и временные затраты на первичный скрининг.

Цель данного изобретения - создание способа, обладающего высокой специфичностью и чувствительностью, хорошей воспроизводимостью, меньшей трудоемкостью, более высокой экономичностью, чем известные способы.

Поставленная цель достигается за счет использования в качестве тест-объектов ферментов глутатионредуктазы, супероксиддисмутазы, глутатионпероксидазы и каталазы, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1.

Фермент глутатионредуктаза (далее ГР) катализирует восстановление дисульфида глутатиона (окисленного глутатиона) в глутатион (восстановленный глутатион) [Классификатор ферментов. - М., 1995 г., 1.6.4.2.].

Фермент супероксиддисмутаза (далее СОД) катализирует реакцию дисмутации супероксидного аниона (O₂ ^-) [Классификатор ферментов. - М. , 1995 г., 1.15.11.].

Фермент глутатионпероксидаза (далее ГП) катализирует окисление восстановленной формы глутатиона в присутствии гидропероксида (Н₂O₂) или липидного пероксида (LOOH) [Классификатор ферментов. - М., 1995 г., 1.11.1.9.].

Фермент каталаза расщепляет перекись водорода и присутствует во всех животных и растительных клетках и органах [Классификатор ферментов. - M., 1995 г., 1.11.1.6.].

Для доказательства специфичности заявляемого способа выявления веществ, обладающих антиоксидантной активностью, in vitro с применением заявляемых ферментов были изучены вещества: - с установленной антиоксидантной активностью, принадлежащие к различным химическим классам; - с неизвестной биологической активностью; - вещества, относящиеся к другим фармакологическим группам и не обладающие искомыми свойствами.

Изученные вещества и их характеристика приведены в таблицах 1 и 3.

Изучали влияние веществ, указанных в таблице 1, на скорость реакций, катализируемых ферментами ГР, СОД, ГП, и КАТ in vitro. Скорости реакций, катализируемых заявляемыми ферментами, определяли спектрофотометрически известными методами. Скорость ГП и ГР реакций определяли по убыли НАДФН (никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный) при длине волны 340 нм. Скорость СОД-реакции определяли в присутствии тетразолия нитросинего и феназинметасульфата по приросту НАДН (никотинамидадениндинуклеотид восстановленный) при длине волны 540 нм. Скорость КАТ-реакции определяли по убыли субстрата (Н₂O₂), которую измеряли в виде комплекса с молибдатом аммония по поглощению при длине волны 410 нм. Измеряли скорость ферментативной реакции без добавления изучаемого вещества (контроль) и после добавления изучаемого вещества (опыт). Полученные результаты представлены в таблице 2. В таблице 2 приводятся средние арифметические значения из 2-3 параллельных определений и стандартные отклонения среднего результата (M±m). В примерах приведены результаты, полученные при оптимальных концентрациях вещества в пробе. Из представленных примеров видно, что вещества с антиоксидантной активностью активизируют ферменты ГР, СОД, ГП, КАТ. Вещества, не обладающие антиоксидантной активностью, угнетают заявляемые ферменты.

Исследуемые вещества 5 и 6 обладают антиоксидантной активностью, а исследуемое вещество 7 не обладает антиоксидантной активностью.

Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, на заявляемых четырех ферментах позволяет добиться высокой степени точности при определении искомой активности.

Формула изобретения

Способ выявления веществ, обладающих антиоксидантными свойствами, in vitro, заключающийся в использовании тест-объектов, отличающийся тем, что в качестве тест-объекта используют ферменты глутатионредуктазу, супероксиддисмутазу, глутатионпероксидазу и каталазу, определяют скорость ферментативной реакции веществ на тест-объектах, при этом соотношение скорости ферментативной реакции на тест-объекте после добавления вещества и скорости ферментативной реакции до добавления вещества должно быть больше 1.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3