Лазерный анализатор микрочастиц и биологических микрообъектов

 

Изобретение относится к измерительной технике и предназначено для исследования параметров взвеси частиц различной природы микронных и субмикронных размеров. Сущность изобретения: в устройство введены последовательно расположенные акустооптический расщепитель лазерного пучка, вход которого соединен с выходом радиочастотного генератора и со вторым входом смесителя, и блок оптических клиньев, лазерные пучки после которых пересекаются в кювете с микрочастицами, которая имеет плоскопараллельные прозрачные окна, заполнена иммерсионной жидкостью и содержит прозрачную стеклянную пробирку с исследуемыми микрообъектами, внутри которой размещен стержень с полым каналом, расположенным по ходу пересекающихся лазерных пучков. Техническим результатом является уменьшение погрешности измерения параметров микрочастиц. 2 ил., 1 табл.

Изобретение относится к измерительной технике и предназначено для исследования параметров взвеси частиц различной природы микронных и субмикронных размеров, например, для решения практических задач в области микробиологии, медицинской диагностики, экологического мониторинга, технологии высокодисперсных порошковых материалов и т. п.

Известны приборы для анализа параметров взвешенных частиц [1], содержащие непроточную прозрачную кювету с исследуемыми частицами, снабженную устройством перемешивания взвеси, источник монохроматического коллимированного излучения, оптическую собирающую линзу, набор фотоприемников малоуглового рассеивания, а также фотоприемники бокового рассеивания, оси которых проходят через кювету под различными углами по отношению к оптической оси, на которой расположены источник монохроматического излучения и кювета, набор фотоприемников, аналого-цифровой преобразователь, на вход которого подключены выходы всех фотоприемников, и компьютер, обеспечивающий автоматическое функционирование, хранение и обработку результатов измерений. Прибор позволяет определять не только размеры частиц, но и распределения их по размерам. К недостаткам этого устройства можно отнести невозможность анализа характеристик подвижности исследуемого объекта и идентификации живых и неживых (обездвиженных) микроорганизмов.

Известны лазерные системы для определения размеров движущихся сферических частиц [2, 3, 4], которые содержат лазер, расщепитель, преобразующий падающий на него пучок в два параллельных пучка, имеющих ту же самую длину волны, фокусирующую линзу, обеспечивающую пересечение лазерных пучков в области, где перемещаются исследуемые частицы, линзу для сбора рассеянного света на апертуру фотодетектора и блок обработки полученного сигнала.

Недостаток этих систем связан с тем, что сигнал на выходе фотоприемника содержит низкочастотную составляющую, которая из-за присущей ей нестабильности приводит к существенным ошибкам в оценке размеров и параметров движения исследуемых частиц.

Наиболее близким техническим решением по отношению к заявляемому устройству является лазерный спектрофотометр [5, 6], содержащий два лазера с различными частотами излучения, высокоточную скоростную электронную следящую систему автоподстройки лазеров по фазе и фокусирующую линзу, обеспечивающую пересечение лазерных пучков в ограниченном объеме кюветы с исследуемыми частицами. Свет, рассеянный частицами, с помощью приемного объектива подается на фотоприемник, подключенный к усилителю высокой частоты. Выход усилителя высокой частоты соединен с одним из входов смесителя частоты, второй вход которого соединен с выходом синтезатора частот. Выход смесителя через усилитель низкой частоты подключен к аналого-цифровому преобразователю, соединенному с шиной компьютера.

Недостатком указанного спектрофотометра светового рассеивания является наличие двух лазеров и системы фазовой привязки их частот, что усложняет техническую реализацию и приводит к дополнительной погрешности в оценке спектра, обусловленной неточностью работы системы фазовой подстройки.

Предложенный лазерный анализатор микрочастиц содержит лазер, коллиматор, последовательно расположенные по ходу лазерных пучков кювету с микрочастицами, фокусирующий объектив и фотоприемник. В его состав входят радиочастотный генератор, а также последовательно соединенные усилитель сигнала фотоприемника, смеситель, фильтр низких частот и аналого-цифровой преобразователь, подключенный к шине компьютера. В заявляемое устройство входят также последовательно расположенные акустооптический расщепитель лазерного пучка и блок оптических клиньев, лазерные пучки после которого пересекаются в кювете с микрочастицами. Выход радиочастотного генератора соединен со входом акустооптического расщепителя лазерного пучка и подключен ко второму входу смесителя.

Кювета лазерного анализатора микрочастиц имеет плоскопараллельные прозрачные окна, заполнена иммерсионной жидкостью и содержит стандартную стеклянную пробирку с исследуемыми микрочастицами. Внутрь стеклянной пробирки помещен стержень с полым каналом, расположенным по ходу пересекающихся лазерных пучков. Наличие стержня с полым отверстием позволяет убрать помеху, обусловленную конвективными движениями микрочастиц.

Новыми предложенными элементами устройства являются дополнительно введенные последовательно расположенные акустооптический расщепитель лазерного пучка и блок оптических клиньев, лазерные пучки которых пересекаются в кювете с микрочастицами, а также подключение выхода радиочастотного генератора ко входу акустооптического расщепителя лазерного пучка и ко второму входу смесителя.

Отличие кюветы лазерного анализатора микрочастиц от выбранного прототипа состоит в том, что она имеет плоскопараллельные прозрачные окна, заполнена иммерсионной жидкостью и содержит прозрачную стеклянную пробирку с исследуемыми микрочастицами. Дополнительным отличием является то, что внутри стеклянной пробирки размещен стержень с полым каналом, расположенным по ходу пересекающихся лазерных пучков.

Принципиально новым техническим решением является введение последовательно расположенных акустооптического расщепителя лазерного пучка и блока оптических клиньев, а также подключение выхода генератора частоты ко входу акустооптического расщепителя лазерного пучка и ко второму входу смесителя.

Введенные блоки обеспечивают более точное цифровое определение спектра рассеянного света исследуемой суспензии частиц за счет уменьшения уровня помех. Снижение этого уровня обеспечивается благодаря двойному гетеродинированию полученного сигнала.

Предложенная схема анализатора позволяет принимать излучение в широкой апертуре, обеспечивая высокий уровень интенсивности оптического сигнала на входе фотоприемника, что имеет существенное значение в связи с малыми размерами бактерий и малой интенсивностью рассеянного ими света. Следующим преимуществом этой схемы является возможность простыми средствами отфильтровать низкочастотные компоненты получаемого фототока, что позволяет устранить известную в фотокорреляционной спектроскопии проблему пьедестала корреляционной функции и связанные с ним погрешности в оценке оптических характеристик рассеянного поля и использовать дешевые малочувствительные фотоприемники, а не счетчики фотонов.

Принципиально новым в конструкции кюветы является то, что пробирка с исследуемыми микрочастицами помещена в кювету с прозрачными плоскопараллельными окнами, заполнена иммерсионной жидкостью и содержит внутри стержень с полым каналом, расположенным по ходу пересекающихся лазерных пучков.

Такая конструкция кюветы уменьшает конвекционные эффекты и позволяет устранить искажающее действие пробирки как цилиндрической линзы света.

На фиг.1 представлена схема лазерного анализатора микрочастиц.

На фиг.2 представлена конструкция кюветы.

Лазерный анализатор микрочастиц (фиг. 1) содержит лазер 1, коллиматор 2, акустооптический расщепитель лазерного пучка 3, блок оптических клиньев 4, последовательно расположенные по ходу лазерных пучков 5, 6 кювету 7 с микрочастицами, фокусирующий объектив рассеянного света 8 и фотоприемник 9. В его состав входят последовательно соединенные усилитель 10 сигнала фотоприемника, смеситель 11, фильтр низких частот 12, аналого-цифровой преобразователь 13, подключенный к шине компьютера 14, а также радиочастотный генератор 15. Выход генератора 15 соединен со входом акустооптического расщепителя лазерного пучка 3 и подключен ко второму входу смесителя частоты 11.

Кювета 16 (фиг.2) лазерного анализатора микрочастиц имеет плоскопараллельные прозрачные окна 17, 18, заполнена иммерсионной жидкостью 19 и содержит прозрачную стеклянную пробирку 20 с исследуемыми микрочастицами. Внутри стеклянной пробирки размещен стержень 21 с полым каналом, расположенным по ходу пересекающихся лазерных пучков 5, 6.

Анализатор работает следующим образом: в исследуемую точку среды под некоторым углом Θ направляются два зондирующих лазерных пучка. Рассеянное лазерное излучение принимается объективом и направляется на фотоприемник, расположенный на оси оптической схемы. Определение характеристик подвижности исследуемых объектов, их размеров, а также обнаружение и идентификация живых популяций осуществляется путем анализа формы полученных спектров. Спектральный анализ выполняется при помощи современного персонального компьютера.

Преимущество этой схемы состоит в том, что значения частоты не зависят от местоположения фотодетектора.

Теоретические рассмотрения возможностей созданного лазерного анализатора микрочастиц показывают, что спектр сигнала, полученного с выхода фотоприемника, соответствует спектру рассеянного исследуемыми частицами поля и для броуновских частиц имеет вид где N - число частиц в измерительном объеме, Е - амплитуда поля рассеянного одной частицей, Δω = ω₀-ω, ω₀ - частота излучения зондирующего пучка, ω - текущая частота, n - коэффициент преломления среды, λ - длина волны зондирующего излучения, Θ - угол между зондирующими пучками, D - коэффициент диффузии микрочастиц. Выражение в квадратных скобках представляет собой лоренциан, максимум которого находится на частоте зондирующего поля ω₀, а полуширина, определяемая на уровне 0,5 от максимума равна: Δω_0,5= k²D (2) Для частиц, обладающих собственной подвижностью, спектральная плотность рассеянного света определяется следующим выражением: где функция Р равна плотности вероятности скоростей рассеивающих частиц, то есть В частности, если скорости частиц распределены равномерно от 0 до v_m, а их направления равновероятны, то при условии, что |ω-ω₀|<kν²_m.
Анализируя (1), (2) можно сделать следующий вывод: в случае неживых (броуновских) частиц, зная полуширину спектра можно определить коэффициент диффузии

который, как известно, четко связан с радиусом частицы R через соотношение Эйнштейна-Стокса.

где К - постоянная Больцмана, а η - вязкость среды, в которой взвешены частицы. Таким образом, открывается возможность, используя спектр рассеянного света, оценить радиус броуновских частиц.

Комбинируя формулы (2) и (6) получим

где
Таким образом, по ширине формы спектра, аппроксимированной лоренцевой кривой, можно оценить коэффициент диффузии или гидродинамический радиус рассеивающих сферических микрочастиц.

Что касается самодвижущихся (живых) частиц, то, как следует из (3), (4), зная форму спектральной плотности рассеянного ими света, можно получить такую важную статистическую характеристику подвижности микрочастиц, как плотность вероятности скорости, ее среднее значение и дисперсию.

Экспериментальные исследования предложенного устройства были выполнены на суспензии латексных микрочастиц и пробах бактерий Е-коли. Цель этих исследований латексных микрочастиц состояла в том, чтобы подтвердить правильность принципов построения и технических решений, положенных в основу оптической и электронной частей анализатора. Второй этап экспериментальных работ состоял в исследовании характеристик света, рассеянного на живых, а затем умерщвленных (обездвиженных) бактериях Е-коли. Цель этих экспериментов состояла в том, чтобы, подтвердить возможность обнаружения (различения) живых и неживых (обездвиженных) микрообъектов.

В качестве пробных образцов были выбраны частицы латекса с диаметрами 0.9 мкм, 1.7 мкм, 3 мкм. Оцифрованные сигналы после н.ч. фильтрации и частотного преобразования в область нулевых частот были введены в компьютер, который по специальной программе вычислял их спектральную плотность (энергетический спектр). Количество отсчетов сигнала в одной выборке составляло 1024, интервал квантования составлял 5 мс, число осреднений было выбрано равным 95, спектральная плотность получалась по 512 точкам путем осреднения по 95 частным спектрам. Полученные значения ширины спектра на уровне 0.5 для выбранного угла рассеяния Θ = 27° составили соответственно для частиц радиусом 0.45, 0.85 и 1.5 мкм 3.208, 1.584 и 1.006 Гц. На основании полученных данных были рассчитаны коэффициенты диффузии для каждой партии латекса при значениях Т= 293^o и вязкости η=8,904•10^-4 Ра/с, при Т=298^oК (вода) и определены радиусы частиц.

Полученные значения радиусов сведены в таблицу, где верхний ряд - известный радиус латекса, средний - его значение, рассчитанное по данным эксперимента, и нижний - относительная ошибка.

Как следует из приведенной таблицы, ошибки не превышают 7,5%, что с учетом дисперсии размеров латексов является хорошим результатом.

Для выполнения исследований, связанных с идентификацией подвижных и обездвиженных микробов были приготовлены три пробы бактерий Е-коли в логарифмической стадии роста. Эксперименты проводились при угле рассеяния равном 5.9^o. Методика получения спектральных плотностей была аналогична той, которая использовалась в экспериментах с латексом.

Из анализа полученных данных было выявлено, что при выбранном угле рассеяния ширины спектральных плотностей для живых и обездвиженных микробов различаются приблизительно в три раза: для живых подвижных микробов они составляют, соответственно 1,6 Гц, а для мертвых 0,6 Гц. Таким образом, результаты этих экспериментов позволяют с уверенностью сделать вывод о возможности идентификации проб живых и неживых бактерий методами спектроскопии оптического смешения.

Литература
1. Патент РФ 2106627, выданный 10.03.98 г., МКИ G 01 N 33/15, 33/48.

2. Патент США 4701051, выданный 20.10.87 г., МКИ G 01 N 15/02.

3. Патент США 4233664, выдан 11.11.80 г., МКИ G 01 N 15/02.

4. Патент США 4986659, выдан 22.01.91 г., МКИ G 01 N 15/02.

5. С. П. Багаев, И.Ф. Орлов, В.Н. Чеботаев. Форма линии рассеяния света броуновскими частицами. Оптика и спектроскопия, т. 71, вып.1, 1991 г., с. 144-150.

6. S.N. Bagaev, V.A. Gusev, V.A. Orlov, and S.N. Panov. Investigation of Moving Species of Microorganisms by Laser Light Scattering Spectroscopy. Laser Phisics, Vol. 6, 3, 1996, pp. 596-599.

Формула изобретения

Лазерный анализатор микрочастиц и биологических микрообъектов, содержащий лазер с коллиматором, последовательно расположенные по ходу лазерных пучков кювету с исследуемой взвесью микрочастиц или микрообъектов, фокусирующий объектив и фотоприемник, радиочастотный генератор, последовательно соединенные усилитель сигнала фотоприемника, смеситель, фильтр низких частот и аналого-цифровой преобразователь, подключенный к шине компьютера, отличающийся тем, что в него введены последовательно расположенные акустооптический расщепитель лазерного пучка, вход которого соединен с выходом радиочастотного генератора и со вторым входом смесителя, и блок оптических клиньев, лазерные пучки после которых пересекаются в кювете с микрочастицами, которая имеет плоскопараллельные прозрачные окна, заполнена иммерсионной жидкостью и содержит прозрачную стеклянную пробирку с исследуемыми микрообъектами, внутри которой размещен стержень с полым каналом, расположенным по ходу пересекающихся лазерных пучков.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3