Способ количественного определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче методом жидкостной хроматографии

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинским, токсикологическим исследованиям. Способ обеспечивает расширение спектра определяемых компонентов из одной пробы мочи, повышение чувствительности и точности определения. Обрабатывают анализируемую пробу солянокислым раствором 2,4-динитрофенилгидразина и гексаном, гексановый экстракт высушивают, высушенный остаток растворяют в потоке элюента, состоящего из смеси ацетонитрила и воды при их объемном соотношении 60 : 40, и определяют содержание альдегида по калибровочному графику, при этом перед введением гексана в пробу последнюю подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН=1-2, а растворение высушенного остатка производят в элюенте, дополнительно содержащем по объему 2,0-2,5% ледяной уксусной кислоты и 1,0-1,5% диэтиламина. 2 з.п.ф-лы, 3 табл.

Изобретение относится к области медицины, в частности к медицинским, токсикологическим исследованиям, и может быть использовано при диагностике экологически обусловленной патологии, вызванной альдегидами, в лабораториях биохимии, специализированных учреждениях и клинико-диагностических лабораториях медицинских учреждений.

Большая часть современных методов определения альдегидов представлена колориметрическими методами определения формальдегида и ацетальдегида в различных субстратах, например, при взаимодействии с хромотроповой или фуксинсернистой кислотой. При наличии формальдегида или ацетальдегида в пробе появляется характерное окрашивание, по интенсивности которого определяют содержание альдегида в пробе. Чувствительность указанных известных методов составляет 0,03 мкг в пробе (см., например, В.Ф.Крамаренко "Токсикологическая химия", Киев, Изд-во "Выща школа", 1989 г., с. 127; И.Д.Гадаскина и др. "Превращение и определение промышленных органических ядов в организме"., Л., Изд-во "Медицина", 971 г., с. 153).

Недостатком указанных известных способов является неспецифичность определения альдегидов, т. к. реакция взаимодействия с вышеуказанными кислотами, положенная в основу известных способов, характерна и для других альдегидов и кетонов и позволяет определять лишь их сумму.

Известен также способ определения ацетальдегида в биосредах (крови и моче) методом газохроматографического анализа равновесной паровой фазы. Согласно этому способу биологическую жидкость нагревают до образования равновесной паровой фазы и анализируют газовую фазу на газовом хроматографе. Например, описан метод раздельного количественного определения этанола и этаналя в одной пробе биологического материала газохроматографическим методом в паровой фазе в интервале 0,01-5,0 мкг/мл. Чувствительность метода составляет 0,01 мкг/мл, погрешность - ±5 отн.%, при анализе этаналя в концентрациях менее 0,01 мкг/мл ошибка может достигать ±35-40 отн.% (см., например, Баньковский А.А., Садовник М.Н., Сатановский В.И. Лабораторное дело. - 1980. - 2. - С. 89-91.).

Недостатком указанного известного способа является низкая чувствительность и недостаточная точность определения низких концентраций альдегидов.

Также известен способ количественного определения формальдегида в биосреде путем совместной обработки пробы биосреды солянокислым раствором 2,4-динитрофенилгидразина и толуолом в течение 0,5 ч с последующим газохроматографическим определением образовавшегося 2,4-динитрофенилгидразона в толуольном экстракте методом абсолютной калибровки (см. авт, свид. СССР 1097955, кл. G 01 N 33/50, от 1982 г.).

Однако указанный известный способ длителен по времени и не позволяет с достаточной степенью чувствительности определять количество альдегида.

Наиболее близким к предлагаемому техническому решению по технической сущности является способ количественного определения формальдегида в молоке методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (см., например, Kaminski J. , Afwal A.S., Mahadevan S. Determination of formaldehyde in the milk by liquid chromatograpfy. //J. Liquid Chromatogr. 1993. - V.I 6. - P.521-526.). Согласно этому известному способу к 2 мл молока добавляют в качестве экстрагента 4 мл гексана и 2 мл 0,14%-ного солянокислотного раствора 2,4-динитрофенилгидразина и экстрагируют смесь. Экстракт выделяют, высушивают в токе азота. Сухой остаток растворяют в 1,0 мл ацетонитрила и анализируют на жидкостном хроматографе в ультрафиолетовом свете (длина волны 345 нм) на колонке (25 см х 4,6 мм), заполненной насадкой Lichrosorb RP8 10 U. Подвижная фаза - ацетонитрил : вода (40:60 по объему). Чувствительность определения - 0,0089 мкг/мл пробе с максимальной погрешностью 14%.

Недостатком указанного известного способа является низкая чувствительность определения.

Технической задачей предлагаемого способа является расширение спектра определяемых компонентов из одной пробы мочи, обеспечение селективности, повышение чувствительности и точности определения.

Указанная техническая задача достигается способом количественного определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче методом жидкостной хроматографии, согласно которому производят последовательную обработку анализируемой пробы солянокислым раствором 2,4-динитрофенилгидразина и гексаном, выделение гексанового экстракта, его высушивание, растворение высушенного остатка в элюенте, состоящем из смеси ацетонитрила и воды при их объемном соотношении 60:40, и определение содержания альдегида по калибровочному графику, при этом перед введением гексана в пробу последнюю подкисляют концентрированной хлористоводородной кислотой до рН 1-2, а растворение высушенного остатка производят в элюенте, дополнительно содержащем по объему 2,0 - 2,5% ледяной уксусной кислоты и 1,0 - 1,5 % диэтиламина.

Кроме того, количественное определение по предлагаемому способу проводят методом абсолютной калибровки по стандартным растворам альдегидов в моче, предварительно обработанным аналогично анализируемым пробам.

Экспериментальным путем было обнаружено, что добавление к пробе мочи солянокислого раствора 2,4-динитрофенилгидразина (2,4-ДНФГ), в частности 0,20%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина, в 2 М хлористоводородной кислоте (HCL), и последующее подкисление пробы концентрированной хлористоводородной кислотой до рН=1-2 позволяет более полно проводить реакцию превращения альдегидов в 2,4-динитрофенилгидразонпроизводные.

Данные о степени превращения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в соответствующие 2,4-динитрофенилгидразон производные этих альдегидов в различных условиях приведены в таблице 1.

Данные, приведенные в таблице 1, показывают, что оптимальный эффект превращения альдегидов в соответствующие 2,4-динитрофенилгидразон производные наблюдается при использовании 2,5 мл 0,20%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М хлористоводородной кислоте и 0,2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты в качестве реагентов при проведении реакции дериватизации, т. к. только при создании в пробе мочи рН=1-2 (за счет прибавления концентрированной хлористоводородной кислоты), обеспечивается наиболее полная степень превращения альдегидов в 2,4-динитрофенилгидразон производные.

Для обеспечения селективности и расширения спектра определяемых компонентов из одной пробы путем достижения эффективного хроматографического разделения смеси 2,4-динитрофенилгидразонов формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов на обращенно-фазном сорбенте к известному элюенту, содержащему ацетонитрил и воду в соотношении 60:40 по объему, добавляют модификаторы, в качестве которых используют ледяную уксусную кислоту и диэтиламин. Уксусная кислота добавляется в элюент в предложенном объемном соотношении 2,0-2,5% до установления реакции среды рН=2,0 с целью смещения равновесия "диссоциированная форма-молекулярная форма" в сторону образования мономерных молекул 2,4-динитрофенилгидразонов. Диэтиламин добавляют в объемном соотношении 1,0-1,5% для образования на поверхности адсорбента ассоциата "адсорбат-компонент элюента". Тем самым достигается симметричная форма и сужение основания хроматографических пиков 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов и обеспечивается высокая эффективность разделения исследуемых веществ (коэффициент разделения K_p≥1), что, в свою очередь, повышает чувствительность определения.

Эффективность разделения альдегидов, рассчитанная из хроматограмм, и чувствительность определения смеси 2,4-динитрофенилгидразонов формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, показывают, что только при добавлении в элюирующую жидкость модификаторов в количестве 2,0-2,5 об.% уксусной кислоты и 1,0-1,5 об. % диэтиламина обеспечивается эффективное разделение 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов и увеличение чувствительности определения альдегидов из одной пробы.

При осуществлении предлагаемого способа проводят следующие операции в нижеуказанной последовательности: - берут пробу мочи, содержащую формальдегид, ацетальдегид, пропионовый и масляный альдегид; - добавляют солянокислый раствор 2,4-динитрофенилгидразина; - вводят концентрированную хлористоводородную кислоту до рН 1-2; - затем в пробу мочи добавляют гексан и смесь встряхивают в течение 10 минут для проведения экстракции образующихся 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов; - после расслоения жидкостей отбирают верхний (гексановый) слой и центрифугируют; - отбирают аликвотную часть экстракта и высушивают под ИК-лампой; - высушенный остаток растворяют в элюенте, содержащем ацетонитрил и воду в объемном соотношении 60:40, а также добавленных к этому количеству 2,0-2,5 об. % ледяной уксусной и 1.0-1,5 об.% диэтиламина, и подвергают хроматографическому анализу; - количество альдегидов определяют с использованием калибровочного графика, который строят методом абсолютной калибровки.

Пример 1.

Брали 50 см³ мочи, содержащей формальдегид, ацетальдегид, пропионовый и масляный альдегид. В эту пробу добавляли 2,5 мл 0,2%-ного раствора 2,4-динитрофенилгидразина в 2 М хлористоводородной кислоте и 0,2 мл концентрированной хлористоводородной кислоты. Затем добавляли гексан в количестве 5 мл. Полученную смесь встряхивали в течение 10 минут для лучшего осуществления экстракции гексаном образующихся 2,4-динитрофенилгидразонов альдегидов. Полученный экстракт центрифугировали для лучшего разделения фаз в течение 20 мин со скроростью 1500 об/мин. Отбирали 2,0 мл гексанового экстракта, высушивали его под ИК-лампой досуха, остаток растворяли в элюенте и анализировали на жидкостном хроматографе "Милихром-4" в ультрафиолетовом свете при длине волны 360 нм на колонке 8 см х 3 мм, заполненной Диасорб C₁₆. При этом элюент, содержащий растворители: ацетонитрил: вода=60:40 (по объему)+2,5 об. % ледяной уксусной кислоты +1,0 об.% диэтиламина, прогоняли через колонку со скоростью 100 мкл/мин. Затем, используя ранее построенные калибровочные графики, проводили количественное определение формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче.

Для построения калибровочных графиков использовали пробы мочи, отобранные у контрольной группы детей, проживающих в экологически благополучной местности, и содержащие заданные концентрации формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов. Определение проводили аналогично примеру 1 за исключением того, что при построении калибровочных графиков полученный остаток, растворенный в элюенте, - стандартный раствор каждой пробы, анализировали на хроматографе не менее 5 раз.

В результате проведенных лабораторных исследований было установлено, что чувствительность определения формальдегида, ацетальдегида и пропионового альдегида в моче предлагаемым способом составляет 0,001 мкг/см³, масляного альдегида - 0,0009 мкг/см³.

Также в ходе лабораторных испытаний устанавливали точность (относительную погрешность) определения предлагаемым способом концентраций формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче при их совместном присутствии. Полученные данные приведены в таблице 3.

Данные, приведенные в таблице 3, показывают, что погрешность определения формальдегида предлагаемым способом составляет 7,24%, ацетальдегида - 9,67%, пропионового альдегида - 7,91%, масляного альдегида - 9,81%.

Таким образом, предлагаемым способом можно с высокой степенью точности и чувствительности определять формальдегид, ацетальдегид, пропионовый и масляный альдегиды в моче при их совместном присутствии в пробе.

Применение предлагаемого способа позволяет повысить чувствительность определения по формальдегиду в 89 раз по сравнению с прототипом.

Формула изобретения

1. Способ количественного определения формальдегида, ацетальдегида, пропионового и масляного альдегидов в моче методом жидкостной хроматографии, включающий последовательную обработку анализируемой пробы солянокислым раствором 2,4-динитрофенилгидразина и гексаном, выделение гексанового экстракта, его высушивание, растворение высушенного остатка в потоке элюента, состоящего из смеси ацетонитрила и воды при их объемном соотношении 60 : 40, и определение содержания альдегида по калибровочному графику, отличающийся тем, что перед введением гексана в пробу, последнюю подкисляют концентрированной соляной кислотой до рН= 1-2, а растворение высушенного остатка производят в элюенте, дополнительно содержащем по объему 2,0-2,5% ледяной уксусной кислоты и 1,0-1,5% диэтиламина.

2. Способ по п. 1, отличающийся тем, что скорость потока элюента составляет 100 мкл/мин.

3. Способ по п. 1, отличающийся тем, что высушивание гексанового экстракта производят ИК-лампой.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3