Способ диагностики степени повреждения мозга при ишемии мозга

 

Изобретение относится к области медицины, в частности к неврологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики степени ишемии мозга. Способ обеспечивает повышение точности диагностики тяжести повреждения мозга на ранней стадии ишемии. В сыворотке крови спектрофотометрически в изопропанольной фазе определяют концентрацию диеновых коньюгатов при длине волны 232 нм (Е₂₃₂), сопряженных триенов и кетотриенов при длине волны 278 нм (Е₂₇₈), шиффовых оснований при длине волны 400 нм (Е₄₀₀), активность каталазы (Е_{каталазы}), активность супероксиддисмутазы (Е_сод), концентрацию пировиноградной кислоты (ПВК) и концентрацию молочной кислоты (МК), вычисляют коэффициент активности перекисного окисления относительно антиоксидантной системы (А) как отношение Е₂₃₂+Е₂₇₈+Е₄₀₀+Е_{каталазы}+Е_сод, затем рассчитывают выраженность гипоксии ткани мозга (В) как отношение ПВК/МК, а степень тяжести повреждения мозга (II) оценивают по отношению А/В и при его значении до 1,85 диагностируют легкую степень повреждения, при значении от 1,9 до 2,5 - среднюю степень, а при значении от 2,6 и выше - тяжелую степень повреждения мозга при ишемии мозга.

Изобретение относится к медицине, в частности к неврологии, и может быть использовано для дифференциальной диагностики степени ишемии мозга в ее остром периоде.

Известны способы диагностики ишемии мозга с помощью физиологических и электрофизиологических исследований, компьютерной томографии. Наиболее точным из вышеперечисленных способов является компьютерная томография.

Однако такой способ диагностики стоит дорого и для многих больниц является недоступным. Кроме того, как правило, его применение одноразово, что затрудняет контроль за развитием ишемического процесса (см."Лабораторные методы исследования в клинике". Справочник. М., 1987.).

Известен способ исследования ликвора.

Однако в известном способе степень повреждения ишемией можно оценить по количеству крови, поступившей в ликвор, что не всегда является объективным критерием, так как концентрация крови в ликвор будет зависеть от многих причин (от количества поврежденных сосудов, состояния их стенок и их диаметра)- (см. "Биохимические методы оценки тяжести эндогенной интоксикации у больных с термическими ожогами". Челябинск. 1988.).

Наиболее близким к заявленному изобретению и выбранным в качестве прототипа является способ прогнозирования развития ишемических нарушений мозгового кровообращения у мужчин с бессимптомным течением атеросклеротических окклюзирующих поражений магистральных артерий головы, где на основе проведенных обследований рассчитывают прогностические коэффициенты и по их значениям прогнозируют развитие ишемических нарушений мозгового кровообращения, транзиторную ишемическую атаку, ишемический инсульт или дисциркуляторную энцефалопатию. (RU 2068230 С1, 27.10.1996).

Задачей настоящего изобретения является повышение точности диагностики тяжести повреждения мозга на ранней стадии ишемии мозга.

Техническим результатом является определение биохимических показателей крови, характерных для ишемии мозга.

Указанная задача решается за счет того, что в известном способе диагностики степени повреждения мозга при ишемии мозга, согласно изобретению в сыворотке крови спектрофотометрически в изопропанольной фазе определяют концентрацию диеновых конъюгатов при длине волны 232 нм (E₂₃₂), сопряженных триенов и кетотриенов при длине волны 278 нм (E₂₇₈), шифровых оснований при длине волны 400 нм (Е₄₀₀), активность каталазы (Е_{каталазы}), активность супероксиддисмутазы (Е_сод), концентрацию пировиноградной кислоты (ПВК) и концентрацию молочной кислоты (МК), вычисляют коэффициент активности перекисного окисления относительно антиоксидантной системы (А) как отношение Е₂₃₂+Е₂₇₈+Е₄₀₀ к Е_{каталазы}+Е_сод, затем рассчитывают выраженность гипоксии ткани мозга (В) как отношение ПВК/МК, а степень тяжести повреждения мозга (П) оценивают по отношению А/В и при его значении до 1,85 диагностируют легкую степень повреждения, при значении от 1,9 до 2,5 - среднюю степень, а при значении от 2,6 и выше - тяжелую степень повреждения мозга при ишемии мозга.

Проведенные исследования по патентам и научно-техническим источникам информации показали, что предлагаемый способ не известен и не следует явным образом из изученного уровня техники, т.е. соответствует критериям "новизна" и "изобретательский уровень".

Предлагаемый способ можно применить в любой биохимической лаборатории, оснащенной типовым оборудованием, выпускаемым как отечественной так и зарубежной промышленностью. Таким образом, заявляемый способ является доступным, а следовательно, "практически применим".

Соотношение концентраций продуктов перекисного окисления липидов в изопропальной фазе к активности антиоксидантных ферментов сыворотки крови находится в прямо пропорциональной зависимости со степенью повреждения клеток ткани мозга при ишемии мозга.

Определение продуктов перекисного окисления в изопропанольной фазе сыворотки крови объясняется тем, что в этой фазе экстрагируются в основном фосфолипиды мембран клеток, в состав которых входят непредельные жирные кислоты, являющиеся субстратом для перекисного окисления липидов.

Для ткани мозга характерен аэробный путь окисления. Cуществует прямая зависимость между увеличением концентрации молочной кислоты и количеством кислорода, поступаемого к ткани мозга. При ишемии нарушается поступление кислорода к тканям, вследствие чего развивается тканевая гипоксия, которая находит свое отражение в увеличении концентрации молочной кислоты в сыворотке крови. Следовательно, по соотношению концентраций пировиноградной кислоты к молочной кислоте в сыворотке крови можно оценить выраженность гипоксии в клетках ткани поврежденного органа При анализе показателя П выявлена следующая закономерность: величина этого показателя находится в прямо пропорциональной зависимости от массы поврежденного органа, а значит и от степени повреждения.

Таким образом, чем больше значение П, тем более тяжелую степень повреждения диагностируют и, наоборот, чем меньше значение П, тем более легкая степень тяжести повреждения органа.

Следовательно, все вышеизложенное позволяет более точно диагностировать степень тяжести повреждения мозга ишемией на любой, в том числе и ранней стадии ее течения.

Заявляемый способ осуществляют с помощью спектрофотометра СФ-46 и центрифуги ОС-6М и реактивов: 1) для определения концентрации молочной кислоты необходимы: - концентрированная серная кислота, - смесь медного купороса с ортофосфорной кислотой в соотношении 1:3, - 1,5% раствор параоксилифенила в диметилфомамиде 2) для определения концентрации пировиноградной кислоты необходимы: - 1,5 раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ), - 2-4 динитрофенилгидразин (ДНФГ),
- 12% раствор щелочи
3) для определения продуктов перекисного окисления липидов:
- гептан: изопропанольная смесь в соотношении 1:1 и 3:7,
- lнНСl,
4) для определения каталазы:
- 0,03% перекись водорода
- 4% раствор молибдата аммония
5) для определения супероксиддисмутазы:
- НАДН,
- феназинметасульфат нитротетразолиевый синий.

Заявляемый способ осуществляют следующим образом.

Забор крови проводят из вены больного. Затем кровь центрифугируют и получают сыворотку крови.

Определение концентрации молочной и пировиноградной кислот, перекисного окисления липидов проводят по стандартным методикам.

Для определения концентрации молочной кислоты берут 0,02 мл сыворотки крови, добавляют 1 мл 5% ТХУ и центрифугируют. К 0.2 мл безбелкового фильтрата прибавляют 0,1 мл смеси медного купороса (СuSO₄-5Н₂0) с ортофосфорной кислотой и 2,5 мл концентрированной серной кислоты. Эту смесь встряхивают, нагревают, охлаждают. Затем добавляют 1 каплю раствора параоксидифенила и вновь встряхивают, нагревают, охлаждают и фотометрируют при длине волны 565 нм. По калибровочной кривой или по стандарту молочной кислоты определяют концентрацию молочной кислоты в исследуемой сыворотке крови.

Далее определяют концентрацию пировиноградной кислоты в сыворотке крови. Для этого к 0,3 мл сыворотки крови добавляют 0,7 мл воды, 1 мл 10% ТХУ, и эту смесь центрифугируют. К надосадочной жидкости (супернатанту) добавляют 0,4 мл 1% ДНФГ и выдерживают в темноте 20 минут. Затем к этой смеси добавляют 1мл 20% NaOH. Через 5 минут фотометрируют при длине волны 460 нм и рассчитывают по стандарту величину концентрации пировиноградной кислоты в исследуемой пробе.

Для определения перекисного окисления липидов к 0,5 мл сыворотки крови добавляют 5 мл реактива гептан: изопропиловый спирт в соотношении 1:1 по объему, встряхивают и охлаждают в течение часа в холодильнике, центрифугируют к супернатанту и добавляют 5 мл смеси реактива в соотношении 3:7 по объему, добавляют 2 мл соляной кислоты с рН 2. К нижней фазе добавляют прокаленный NaCl. Разделяют гептановую и изопропанольную фазы и каждую фазу фотометрируют, определяя показатели при длинах волн 220 нм, 232 нм, 278 нм, 400 нм.

Для определения каталазы к 0,02 мл сыворотки крови добавляют 2 мл 0,03% перекиси водорода. Через 10 минут добавляют 1 мл 4% раствора молибдата аммония, интенсивность развития окраски замеряют на спектрофотометре СФ-46 при длине волны 410 нм против контрольной пробы.

Активность супероксиддисмутазы (СОД) определяют по методу Е.Е. Дубинской. Активность фермента оценивали по степени торможения процесса восстановления супероксидными радикалами нитросинего тетразолия в формазан, который образуется в присутствии НАД-Н и феназимметасульфата.

Для расчета активности СОД в начале определяли процент торможения реакции восстановления нитросинего тетразолия в опытной пробе (Т%)
,
где Е - экстинция пробы, затем по формуле

Активность перекисного окисления липидов относительно антиоксидантной системы равна

Е232 - концентрация диеновых конъюгатов в изопропанольной фазе сыворотки крови в единицах экстинции спетрофотометра СФ-46;
Е278 - концентрация сопряженных триенов и кетотриенов в изопропанольной фазе сыворотки крови в единицах экстинции спектрофотометра СФ-46;
Е400 - концентрация шиффовых оснований в изопропанольной фазе сыворотки крови в единицах экстинции спектрофотометра СФ-46 Екаталазы - активность каталазы = Е холостой пробы к Е опытной пробы Е_сод - активность супероксиддисмутазы в относительной единице оптической плотности, рассчитанной по вышеприведенной формуле.

Для определения выраженности гипоксии при ишемии мозга вычисляют величину коэффициента В по формуле
В= ПВК/МК,
где ПВК - концентрация пировиноградной кислоты в сыворотке крови; МК - концентрация молочной кислоты в сыворотке крови.

Величину показателя П определяют следующим образом:
П-А/В
Проведенные клинические исследования на 120 больных с ишемией мозга позволили выделить несколько значений П в зависимости от степени тяжести ишемии мозга.

При П до 1,85 - легкая степень повреждения.

При П от 1,9-2,5 - средняя степень повреждения.

При П от 2,6 и выше - тяжелая степень повреждения.

Пример 1. Больная Соколова Н.И., 50 лет поступила с диагнозом: Инфаркт головного мозга П степени в бассейне задней нижней мозговой артерии. Сопутствующее заболевание - гипертония П-1У стадии продолжительностью более 20 лет.

Обследование: артериальное давление 160/80 мм рт.ст., пульс 78 ударов в минуту, ЭКГ - синусовый ритм 75-В ударов в минуту, гипертрофия левого желудочка с перегрузкой П А стадии, изменения в миокарде задней стенки левого желудочка и боковой правого. При компьютерной томографии патологических процессов в костях и полости черепа не обнаружено, на ЭХО-ЭГ смещения не выявлены.

Лабораторные результаты: коагулаграмма показала гипокоагуляцию на 1 и П этапах, ликвор бесцветный, прозрачный, белок 125, реакция Панди отрицательная, эритроциты свежие 0-1 в поле зрения.

Кровь - эритроциты 3,8 10, гемоглобин 120, СОЭ 18, лейкоциты 6,3, эозинофилы 1, палочкоядерные 1, сегментоядерные 6,6, лимфоциты 18, моноциты 1, глюкоза 4 мм/л, биллирубин 15 мм/л, В-липопротеиды 4,3 мм/п, ДК 0,854, СКТ 0,228, ШО 0,04, каталаза 0,365, СОД 1,85, ПВК 1,7, МК 6,8
;
;

Данная величина свидетельствует о наличии средней степени тяжести ишемии мозга в острейшем периоде. Проведено лечение, больная выписана через 20 дней.

Таким образом, предлагаемый способ позволяет повысить точность диагностики степени повреждения мозга.

Формула изобретения

Способ диагностики степени тяжести повреждения мозга при ишемии мозга отличающийся тем, что в сыворотке крови спектрофотометрически в изопропанольной фазе определяют концентрацию диеновых конъюгатов при длине волны 232 нм (Е₂₃₂), сопряженных триенов и кетотриенов при длине волны 278 нм (Е₂₇₈), шиффовых оснований при длине волны 400 нм (Е₄₀₀), активность каталазы (Е_{каталазы}), активность супероксиддисмутазы (Е_сод), концентрацию пировиноградной кислоты (ПВК) и концентрацию молочной кислоты (МК), вычисляют коэффициент активности перекисного окисления относительно антиоксидантной системы (А) как отношение Е₂₃₂+Е₂₇₈+Е_400к+Е_{каталазы}+Е_сод, затем рассчитывают выраженность гипоксии ткани мозга (В) как отношение ПВК/МК, а степень тяжести повреждения мозга (П) оценивают по отношению А/В и при его значении до 1,85 диагностируют легкую степень повреждения, при значении от 1,9 до 2,5 - среднюю степень, а при значении от 2,6 и выше - тяжелую степень повреждения мозга при ишемии мозга.