Пептидные фрагменты основного белка миелина, фармацевтические композиции на их основе и применение данных композиций для лечения рассеянного склероза

 

Описан полипептид формулы Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr, способный нейтрализовать или модулировать образование антимиелинового основного белка. Пептид может использоваться для лечения рассеянного склероза и обладает большей активностью по сравнению с миелиновым основным белком. Пептид не является токсичным и не проявляет себя в качестве иммуногенов. Описана также фармацевтическая композиция, содержащая пептид, а также способ лечения рассеянного склероза. 3 с. и 5 з.п. ф-лы, 4 табл., 35 ил.

Область, к которой относится изобретение Изобретение касается некоторых полипептидов и их использования для иммунорегуляции антител к миелиновому основному белку человека. Изобретение также относится к новым фармацевтическим композициям, содержащим указанные полипептиды, и к способу использования этих пептидов для лечения рассеянного склероза.

Уровень техники Рассеянный склероз (MS) - это многоочаговое демиелинизирующее заболевание центральной нервной системы (ЦНС) человека, связанное с воспалением. Повышенный синтез IgG в пределах гематоэнцефалического барьера (intra-BBB) является признаком рассеянного склероза (Tourtelotte, W. W., J. Neurol Sci 10: 279-304, 1970; Link, H. And Tibbling, G., Scand. J. Clin. Lab Invest 37: 397-401, 1977; Tourtelotte. W. W. and Ma, В., Neurology 28: 76-83, 1978; Walsh, J. M. and Tourtelotte, W. W., In: Hallpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple Sclerosis. Baltimore. Williams & Wilkins, 1982: 275-358; and Warren. K. G. , and Catz, I. Ann Neurol 17: 475-480, 1985).

Выработка IgG в пределах ВВВ, в основном, повышается у пациентов с клинически определенным заболеванием рассеянным склерозом (Schumacher, G. A., Beebe G. , Kibler R. Е., et al. Ann NY Acad Sci 15:266-272, 1965), как в случае активной, так и скрытой формы заболевания. Специфичность большинства IgG ЦНС не известна. Тогда как небольшая их часть обладает антивирусной активностью или выступает во взаимодействие с антигенами мозга, нуклеиновыми кислотами, эритроцитами или антигенами гладкой мускулатуры, другие неспецифические Ig могут быть задействованы в поликлональной активации В-клеток (Tourtelotte, W. W., and Ma, В., Neurology 28:76-83, 1978). В течение последнего десятилетия наблюдается значительный интерес к изучению антител, специфичных к миелиновым белкам.

Вслед за обнаружением циркулирующих иммунных комплексов, содержащих миелиновый основный белок (МВР) в качестве антигенного компонента (Dasgupta, M. К. Catz, I, Warren, К. G., et al.. Can. J. Neurol. Sci. 10:239-243, 1983), были выявлены повышенные титры антител к МВР (anti-MBP) в спинномозговой жидкости (CSF) больных с активной формой рассеянного склероза (MS) (Warren, К. G., and Catz, I., Ann Neurol 209:20-25, 1986).

Клиническая картина рассеянного склероза характеризуется фазами активного заболевания, такими как острые рецидивы или хроническое течение, и фазами клинической ремиссии. Для активной формы рассеянного склероза характерны повышенные уровни внутриоболочечных анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I. , Ann Neurol 209: 20-25, 1986, and Catz, I., and Warren, K. G., Can J. Neurol Sci. 13:21-24, 1986). Эти антитела обнаруживаются преимущественно в свободной (F) форме во время острых рецидивов и преимущественно в связной (В) форме, когда болезнь незаметно прогрессирует (Warren, К. G., and Catz, I. , Ann Neurol 209:20-25, 1986). Во время острых рецидивов титры анти-МВР в спинномозговой жидкости (CSF) соответствуют активному развитию заболевания (Warren, К. G., and Catz, I., Ann Neurol 21:183-187, 1987). Уровни анти-МВР также повышаются у больных с первыми приступами оптического неврита и у большинства больных с начальными стадиями рассеянного склероза (MS) (Warren, К. G., Catz, I., and Bauer, С., AnnNeurol 23: 297-299,1988; Warren. К., G., and Catz, I., J Neurol Sci. 91:143-151, 1989).

Продолжительные исследования кинетики уровней антител к МВР в CSF у пациентов, находящихся в стадии выздоровления после острого рецидива, показали постепенное падение титров анти-МВР в свободной (F) форме с соответствующим пропорциональным повышением (В)-фракций, т. е. анти-МВР в связанной форме (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 91: 143-151, 1989; Warren, К. G. , and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194,1988). В стадии ремиссии анти-МВР в CSF могут не обнаруживаться, что позволяет предположить, что нейтрализация анти-МВР связана с неактивной стадией заболевания (MS) (Warren, К. G. , and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1988). Наоборот, хронически прогрессирующий рассеянный склероз (MS), характеризующийся постоянным увеличением выработки анти-МВР в течение продолжительного периода времени, связан с ингибированием нейтрализации анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1988). Недавно в IgG-фракции, полученной из CSF больных MS, были идентифицированы антитела к основному миелиновому белку, в том числе анти-МВР, антитела, нейтрализующие анти-МВР, и антитела, ингибирующие нейтрализацию анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I., J. Neurol Sci. 96: 19-27, 1990).

Предыдущие исследования авторов изобретения с учетом сведений о В-клеточных аутоантителах показывает, что существует по крайней мере две отличающиеся друг от друга формы рассеянного склероза (MS): первая - когда у большинства больных вырабатываются аутоантитела к миелиновому основному белку (анти-МВР), и вторая, когда у меньшего числа больных вырабатываются антитела к белку протеолипидной природы (анти-PLP) (Warren, К. G., et al.,. Ann Neurol 35: 280-289, 1994). При той форме заболевания (MS), для которой характерно наличие анти-МВР, острые рецидивы сопровождаются увеличением соотношения свободных (F) и связанных (В) анти-МВР, тогда как хронически прогрессирующая фаза характеризуется более низким соотношением F/B анти-МВР, а больные на стадии ремиссии редко имеют слегка повышенные титры анти-МВР (Warren, К. G., and Catz, I, J. Neurol Sci. 88: 185-194, 1989).

Было показано, что часть пролиферирующих Т-клеток у больных рассеянным склерозом направлена к MBP (Allegretta et al.. Science, 718-721, 1990) и что Т-клетки человека могут узнавать множественные эпитопы на молекуле (Richert et al. , J. Neuroimmun 23, 55-66, 1989). MBP, по-видимому, также способом к активации некоторых Т-клеток без вовлечения антигенпрезентирующих клеток (Altman et al., Eur. J. Immunol. 17, 1635-1640, 1987). Похоже, что небольшие пептиды MBP могут распознаваться Т-клетками без внутриклеточного процессирования просто за счет их способности связывать антигены основного комплекса гистосовместимости класса П на поверхности презентирутощих клеток.

Поскольку экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ), признанный моделью рассеянного склероза (MS) на животных, может быть индуцирован введением чувствительным грызунам как MBP, так и PLP в сочетании с полным адъювантом Фрейнда, процесс демиелинизации при рассеянном склерозе, возможно, имеет аутоиммунный механизм (Fritz, R. В. et al., J. Immunol., 130, 1024-1024, 1983; Trotter, J. L. et aL, J. Neurol Sci. 79, 173-188, 1987). Принимая во внимание сведения о В-клеточных аутоантителах, эпитоп МВР, на который "нацелено" заболевание, локализован вблизи от три-пролиловой последовательности (остатки -99-100-101-) на участке между 80-м и 100-м остатком (Warren, К. G., et al., Ann Neurol 35: 280-289, 1994). Этот В-клеточный эпитоп частично перекрывает иммунодоминантный эпитоп Т-клеток, активных в отношении МВР, которые обнаружены в участках мозга, пораженных рассеянным склерозом (MS) (Oksenberg, g. R. et al., Nature, 362, 68-70, 1993).

Предыдущие исследования показали, что анти-МВР нейтрализуются МВР. Однако предварительные попытки лечения рассеянного склероза (MS) внутримышечным или подкожным введением гетерологичных МВР не привели к успеху (Campbell, В. , Vogel, R. J., Fisher, E. and Lorenz, R., Arch Neurol 29: 10-15, 1973; Gonsette, R. E., Delmotte, P. and Demonty, L., J Neurol 216: 27-31, 1977; and Romine, J. S. and Salk, J.. In: Hallpike, J. F, Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630). Проблема использования нативного МВР имеет две стороны. Белок получают из образцов мозга человека и потому существует потенциальная опасность, что в нем присутствуют латентные нейровирусы. Кроме того, несмотря на то, что, как правило, МВР не является иммуногенным, при введении лицам с нарушенной иммунной системой, МВР может проявлять себя как антиген и вызывать выработку антител к МВР.

Соответственно, настоящее изобретение направлено на решение вопроса: могут ли анти-МВР, выделенные из спинномозговой жидкости (CSF) больных рассеянным склерозом (MS) в стадии острого рецидива нейтрализоваться определенными пептидами МВР человека (h-МВР). Для этой цели синтетические пептиды, соответствующие полной длине h-MBP, использовали для определения возможной эпитопной области на h-MBP, которая нейтрализует анти-МВР, полученные от указанных больных. Следовательно, выбранные пептиды, которые нейтрализуют анти-МВР, могут использоваться для лечения рассеянного склероза (MS) более эффективно, чем МВР полной длины. Эти пептиды получены искусственным путем и потому не несут потенциальной угрозы, связанной с нейровирусами. Кроме того, в связи с малым размером эти пептиды не проявляют себя в качестве иммуногенов.

Следовательно, использование указанных пептидов как средства лечения рассеянного склероза поможет решить проблемы, возникающие при использовании нативного белка.

Кроме того, пептиды, полученные согласно настоящему изобретению, исследуют для определения эффективности их связывания или модуляции выработки анти-МВР рассеянного склероза (MS) in vivo.

Сущность изобретения В соответствии с изобретением синтезирован пептид, последовательность которых, в основном, гомологична части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Эти пептид способен нейтрализовать или модулировать выработку анти-МВР. В соответствии с настоящим изобретением пептид имеет формулу Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr Далее, согласно настоящему изобретению, создана фармацевтическая композиция, содержащая в качестве активного ингредиента указанный пептид в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

Кроме того, в соответствии с настоящим изобретением создан способ лечения рассеянного склероза, предусматривающий введение эффективного количества пептида как индивидуально, так и в сочетании для эффективной нейтрализации или модулирования выработки антител к МВР человека.

Краткое описание рисунков Фиг. 1 показывает локализацию восемнадцати синтетических пептидов по отношению к интактной молекуле МВР человека. Пептиды представлены в виде вертикальных полос и размещены после соответствующего им участка на молекуле МВР. Шкала показывает аминокислотные остатки на молекуле МВР человека.

Фиг.2 показывает кривые ингибирования антител к МБР, очищенных и полученных от 10 различных больных рассеянным склерозом, при введении МБР человека и МВР-пептидов.

Фиг. 3 показывает нейтрализацию анти-МВР, полученных от одного больного рассеянным (MS) МВР человека и пептидами МВР 80-97, МВР 91-106 и МБР 75-95.

Фиг. 4 - длительный мониторинг титров анти-МВР в спинномозговой жидкости у пациента с хроническим рассеянным склерозом (MS): уровни F (свободных) и В (связанных) анти-МВР были стабильно повышенными при исследовании 26 проб в течение 11-летнего периода с 1983 по 1993 г.

срm: счет в минуту -₀- связанные (В) анти-МВР, определенные после кислотного гидролиза иммунных комплексов в спинномозговой жидкости (CSF).

-•- свободные (F) анти-МВР.

Фиг.5 - контрольные больные: уровни анти-МВР CSF в 2 временных контролях (1F56, Fig. 5A и 3М66, Fig. 5B) и 2 временных контролях при использовании физиологического раствора. У всех четверых больных уровень (F)- и (В)-анти-МВР остается устойчиво повышенным по отношению к базовому уровню, когда CSF отбиралась для анализа каждые 30 мин в течение первых двух часов, так же, как и 24-мя часами позже. Обозначения такие же, как на фиг.4.

Фиг. 6 - сравнительные исследования пептидов от разных больных: уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости в группе из четырех больных (10F38, Fig. 6а; 13F43, Fig. 6С; 5М59, Fig. 6D; и 3М66, Fig. 6G), получивших увеличенные количества (1, 2.5, 5 и 10 мг соответственно) несвязанного контрольного синтетического пептида МВР-35-58 и в группе из четырех других больных (6F53, Fig. 6В; 8М41, Fig. 6D; и 4М45, Fig. 6F; и 1F56, Fig. 6H), которые получали повышенные количества (1, 2.5, 5 и 10 мг соответственно) анти-МВР, связывающих синтетический пептид МБР 75-95. CSF (F)-анти-МВР были связаны в дозо-зависимом соотношении пептидом МБР 75-95, и они не вступали во взаимодействие с пептидом МВР 35-58. Связанные анти-МВР оставались фактически нереакционноспособным.

Фиг.7 - сравнительные исследования пептидов от разных больных: когда больные MS подвергались временному контролю (1F56, Фиг.7С и 3М66, Фиг.7D) или временному контролю при использовании физиологического раствора (5М59, Фиг. 7А и 4М45, Фиг.7В), а также, когда они получали несвязанный контрольный пептид МВР 35-58 (5М59 и ЗМ66), уровни их (F)-анти-МВР и (В)-анти-МВР оставались постоянно неизмененными. Напротив, когда те же больные 4М45, 1F56 и 3М66 позже получили 5-10 мг анти-МВР, связанных с пептидом МВР 75-95, их (F)-анти-МВР переставали обнаруживаться в течение периода до 7 дней и возвращались на уровень базовой линии между 10 и 21 днем.

Фиг. 8 - повторяемые внутрикожные инъекции синтетического пептида: больной с хронически прогрессирующим MS получал 10 еженедельных инъекций 10 мг МВР 75-95, вводимых непосредственно в спинномозговую жидкость; титры (F) и (В)-анти-МВР измерялись до (обозначенные кружками) и спустя 30 мин после инъекции (обозначенные квадратами). Свободные (F)-анти-МВР (заштрихованные квадраты и кружки) становились неопределяемыми в течение 10 недель, несмотря на то, что уровень связанных (В)-антител оставался существенно неизмененным (незаштрихованные квадраты и кружки).

Фиг. 9. Внутривенное введение синтетического пептида: уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости соответствуют одной внутривенной инъекции 500 мг МВР 75-95; уровни связанных (В)- и свободных (F)-анти-МВР существенно снижаются при исследованиях спустя 10, 16 и 30 дней после инъекции. Обозначения - такие же, как на фиг.4.

Фиг.10. Дальнейшее изучение МВР эпитопа для анти-МВР MS с использованием группы из 41 декапептида, которые перекрывают участки между 61 и 110 остатками.

Описание:
- полосы обозначают процент ингибирования =100 - единицы радиоактивности;
- МВР и пептид МВР 75-95 были использованы в качестве позитивного контроля и обеспечили 100% ингибирование как свободных (F)-, так и связанных (В)-антител;
- пептиды МВР 51-60 и МВР 111-120 были использованы в качестве негативного контроля и привели к незначительному ингибированию (0-10%) связанных (В)- и свободных (F)-анти-МВР;
- декапептиды МВР 84-93, МВР 85-94, МВР 86-95 и МВР 87-96, которые обеспечили максимальное ингибирование (90-100%) как свободных (F)-, так и свободных (В)-антител, тесно ассоциируются с МВР эпитопом;
- пунктирная линия: 95%-ный достоверный интервал исследования по ингибированию.

На фиг.11 представлены количества свободных (F)-• и связанных (В)-о анти-МВР в ЦСЖ больного с односторонним оптическим невритом, которому были проведены две внутриоболочечные инъекции (it#l и it#2) 50 мг рМВР86-95 с интервалом 4 недели; w = число недель.

На фиг.11b представлены количества свободных (F)-• и связанных (В)-о анти-МВР в ЦСЖ больного с полным односторонним оптическим невритом, которому были проведены многочисленные внутриоболочечные инъекции (it#l, it#2, it#3, it#4 и it#5) 50 мг рМВР82-98 в первую неделю рецидива.

На фиг.11с представлены количества свободных (F)-• и связанных (В)-о анти-МВР в ЦСЖ больного с псевдоатерозом, которому были проведены пять ежедневных внутриоболочечных инъекций (it# l, it#2, it#3, it#4 и it#5) 50 мг рМВР82-98.

На фиг. 11d представлены количества свободных (F)-• и связанных (В)-о анти-МВР в ЦСЖ больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены четыре внутриоболочечные инъекции (it#l, it#2, it#3 и it#4) 50 мг рМВР86-95 каждые 2-3 дня в первую неделю рецидива и одна внутривенная инъекция (IV) 400 мг рМВР86-95, когда заболевание вступило в прогрессирующую фазу.

На фиг. 12 представлены количества свободных и связанных анти-МВР в ЦСЖ больного с полисимптоматичеким рецидивом, которому было проведено всего семь внутриоболочечных инъекций 50 мгрМВР86-95. Спустя 30 минут после it#2 образец ЦСЖ не брали; он был взят спустя 24 ч. Обозначения такие же, как на фиг. 11.

На Фиг. 13 представлены количества свободных и связанных анти-МВР в ЦСЖ больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены как внутриоболочечные (it#l, it#2 и it#3), так и внутривенные инъекции (IV# 1 и IV# 2) pMBP86-95. До или после it#2 образец ЦСЖ не брали. Обозначения такие же, как на фиг.11.

На фиг. 14 представлены количества свободных и связанных анти-МВР в ЦСЖ больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены как внутривенные (IV# 1, IV#2 и IV#3), так и внутриоболочечные (с it# 1 пo it#9) инъекции pMBP86-95 и рМВР82-98. Обозначения такие же, как на фиг.11.

Фиг. 15 отражает попытку предотвратить последующие рецидивы у больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены две внутривенные инъекции (IV#1 и IV#2) 400 мг pMBP86-95 и рМВР82-98. В ходе первого рецидива, спустя 3 месяца после IV#1, образец ЦСЖ не брали. Естественная частота рецидивов отражена наверху стрелками, соответствующими месяцам рецидива. Квадратом отмечено время эксперимента. Обозначения такие же, как на фиг.11.

Фиг. 16 отражает попытку предотвратить последующие рецидивы у больного рецидивирующим-прогрессирующим рассеянным склерозом, которому были проведены две внутриоболочечные (it# l и it# 2) и одна внутривенная (IV) инъекции pMBP86-95. □ - внутривенное введение большой дозы метилпреднизолона. Естественная частота рецидивов отражена наверху стрелками, соответствующими месяцам рецидива. Квадратом отмечено время эксперимента. Обозначения такие же, как на фиг.11.

На фиг.17 показан эффект внутриоболочечного и внутривенного введения пептида на количество МБР-специфических аутоантител в ЦСЖ больного хроническим прогрессирующим рассеянным склерозом. В эксперименте, представленном на фиг. 17а, рМВР75-95 вводили прямо в ЦСЖ (2.5 мг в 5 мл физиологического раствора) и МВР-специфические аутоантитела определяли твердофазным радиоиммунологическим тестом через различные интервалы времени (от 0.5 ч до 7 дней после инъекции). Инъекции пептида приводили к временной нейтрализации свободных анти-МВР (закрашенные кружки), но не оказывали влияния на связанные анти-МВР (незакрашенные кружки). Аутоантитела были необнаружимы через 1 и 2 ч и их количество начинало возвращаться к исходным значениям между 12 и 24 часами после инъекции. Аналогичные наблюдения были сделаны с семью другими больными хроническим прогрессирующим рассеянным склерозом. На фиг. 17b видно, что спустя 13 месяцев после внутриоболочечного введения, представленного на фиг. 17а, больному было внутривенно введено 500 мг рМВР75-95 в 50 мл физиологического раствора и МВР-специфические аутоантитела в ЦСЖ определяли на протяжении 3 месяцев (среднее ± стандартное отклонение).

На фиг.18 представлены уровни анти-МВР в ЦСЖ тринадцати больных хроническим прогрессирующим рассеянным склерозом, которым проводили внутривенные инъекции (IV# 1 5-6 мг/кг веса тела (256-500 мг в физиологическом растворе) рМВР75-95 (2 больных) или рМВР86-95 (11 больных); определяли как свободные, так и связанные анти-МВР (закрашенные и незакрашенные кружки соответственно). Уровень аутоантител в промежутке 1-4 месяцев после IV#1 был низким или необнаружимым, а затем возвращался к исходным значениям. В промежутке 6-10 месяцев после IV# 1 всем больным проводили вторую внутривенную инъекцию рМВР82-98 в той же дозе (IV#2).

Подробное описание изобретения
Настоящее изобретение касается пептидов, аминокислотная последовательность которых практически гомологична части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Термин "практически гомологична" означает, что небольшие различия между аминокислотной последовательностью миелинового основного белка человека и пептидами могут существовать при условии, что пептиды с небольшими различиями в аминокислотной последовательности способны функционировать в соответствии с изначально присущим назначением, т.е. способны нейтрализовать или модулировать выработку антител к миелиновому основному белку человека (анти-МВР). Проведенные в настоящем изобретении разъяснения делают очевидным для специалистов в данной области тот факт, что эмпирически небольшие вариации в аминокислотной последовательности указанных пептидов могут быть произведены без ущерба для их функции.

На основе другой работы, связанной с настоящим изобретением, а также на основе тестов по конкурентному ингибированию с использованием серии из 41 декапептида, был уточнен эпитоп МБР, связывающий анти-МВР при рассеянном склерозе. Он был локализован в области между аминокислотой 86 и аминокислотой 95. Исходя из наивысшего уровня ингибирования В-анти-МВР (равного или большего 95%), эпитоп МВР, связывающий анти-МВР, можно локализовать между аминокислотой 86 и аминокислотой 95. Наименьшая общая область эффективных декапептидов находится с аминокислоты 87 по аминокислоту 93. Таким образом, в соответствии с настоящим изобретением, пептиды могут быть представлены следующей формулой:
R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂
и его солей, при том, что R₁ и R₂ независимо выбраны из группы, включающей водород, гидрокси, аминокислотный остаток и полипептидный остаток; при том, что R₁ и R₂ не являются одновременно водородом или гидроксилом.

Семь аминокислот, соответствующих положениям с 87 по 93, по-видимому, недостаточно велики, чтобы эффективно связывать анти-МВР. Таким образом, R₁ и R₂ не должны быть одновременно водородом или гидроксилом.

Когда R₁ и R₂ являются аминокислотой, то эта аминокислота может быть выбрана из природных аминокислот. R₁ и R₂ не ограничиваются аминокислотами, встречающимися "выше" или "ниже" Val87 и Ilе93 в основном белке миелина человека, как показано в последовательности SEQ ID No:l. Могут быть проведены различные модификации, включая замены, добавления или делеции, как "выше", так и "ниже" последовательностей R₁ и R₂. Кроме того, модификации, включая замены, добавления или делеции, могут быть осуществлены в последовательности -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-, при том, что полученные таким образом пептиды способны выполнять нужную функцию, т.е. нейтрализуют или модулируют образование антител к основному белку миелина.

Термин "остаток полипептида" или "полипептидный остаток" подразумевает полипептиды различного размера, включая белки или их фрагменты. Как указано выше, когда R₁ и R₂ являются полипептидным остатком, то R₁ и R₂ не ограничиваются пептидами, встречающимися "выше" или "ниже" Val87 и Ilе93 в основном белке миелина человека. Могут быть использованы любые полипептидные остатки.

В одном из вариантов осуществления изобретения R₁ может быть пептидом, выбранным из группы пептидов, варьирующих в пределах от аминокислотного остатка 61 до аминокислотного остатка 86 последовательности SEQ ID No:1. Длина указанного пептида может варьировать от одного аминокислотного остатка до 26 аминокислотных остатков.

В другом варианте осуществления настоящего изобретения R₂ может быть пептидом, выбранным из группы пептидов, варьирующих в пределах от аминокислотного остатка 94 до аминокислотного остатка 106 последовательности SEQ ID No: l. Длина указанного пептида может варьировать от одного аминокислотного остатка до 13 аминокислотных остатков.

R₁ и/или R₂ могут быть повторами последовательности -Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile или ее модификациями, включая замещения, дополнения или делении. Таким образом, пептид может содержать многочисленные повторы сайта связывания анти-МВР (эпитопа).

Соединения, заявленные согласно настоящему изобретению, могут быть получены в соответствии с общепринятыми и хорошо известными методами синтеза полипептидов. Под термином "пептид" подразумевают пептиды, полученные из природных миелиновых основных белков человека в результате контролируемого гидролиза, осуществляемого до образования пептидов, относящихся к данному изобретению. Указанное понятие также включает и пептиды, полученные с помощью технологии рекомбинантных ДНК. С учетом известной последовательности заявленных пептидов в объем настоящего изобретения включено также установление соответствующей последовательности ДНК, кодирующей заявленную аминокислотную последовательность. Соответствующая последовательность ДНК может быть получена общепринятыми хорошо известными методами синтеза ДНК последовательностей. Полученные таким образом последовательности ДНК могут быть клонированы в соответствующих клонирующих векторах и использованы для трансформации подходящей клетки-хозяина с целью получения рекомбинантного пептида. Все изложенные выше подходы являются общепринятыми и хорошо известными для специалистов в данной области.

Пептиды, заявленные согласно настоящему изобретению, в основном гомологичны по своей аминокислотной последовательности части аминокислотной последовательности миелинового основного белка человека. Понятие "часть аминокислотной последовательности" означает, что последовательность может быть любой длины при условии, что она достаточно длинна для того, чтобы нейтрализовать или модулировать выработку антител к МВР, но имеет не такую длину, которая приводит к известным ранее проблемам, когда пептиды используются in vivo для лечения рассеянного склероза. В одном примере настоящего изобретения описаны пептиды, включающие от ~10 до ~25 аминокислотных остатков. Если заявленные пептиды используются как часть белков слияния, общий размер пептида может быть гораздо больше.

В соответствии с одним вариантом осуществления изобретения было установлено, что заявленные пептиды, соответствующие в значительной мере аминокислотной последовательности человеческого МВР, эффективны в отношении нейтрализации и модулирования выработки анти-МВР. Эти пептиды соответствуют аминокислотной последовательности человеческого МВР в интервале от 61 до 106 аминокислотного остатка. В одном примере эти пептиды соответствуют участку 75-106 аминокислотной последовательности человеческого МВР, когда пептиды используются для нейтрализации свободных анти-МВР. В последующем примере эти пептиды соответствуют участку 82-99 аминокислотной последовательности человеческого МВР, когда пептиды используются для нейтрализации и модулирования выработки связанных анти-МВР. Поэтому выбираются пептиды, состоящие из 10-25 аминокислотных остатков, из сплошной аминокислотной последовательности в пределах последовательности, показанной ниже (аминокислотные остатки SEQ ID NO: 1), при условии, что указанная последовательность может нейтрализовать или модулировать выработку антител к миелиновому основному белку человека.

Аминокислотные остатки 61-106 SEQ ID NO: 1
61 His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Hle Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly 106
Ниже приведены примеры пептидов, выбранных из группы, включающей:
МВР61-75 (аминокислотные остатки 61-75 SEQ ID NO:1)
His His Pro Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gin Lys
MBP64-78 (аминокислотные остатки 64-78 SEQ ID NO:1)
Ala Arg Thr Ala His Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly
MBP69-83 (аминокислотные остатки 69-83 SEQ ID NO:1)
Tyr Gly Ser Leu Pro Gln Lys Ser His Gly Arg Thr Gln Asp Glu
MBP75-95 (аминокислотные остатки 75-95 SEQ ID NO:1)
Lys Ser His Gly Arg Thr Glin Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr
MBP80-97 (аминокислотные остатки 80-97 SEQ ID NO:1)
Thr Gln Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn He Val Thr Pro Arg
MBP91-106 (аминокислотные остатки 91-106 SEQ ID NO: 1)
Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr Pro Pro Pro Ser Gln Gly Lys Gly
Один аспект настоящего изобретения касается пептидов, представленных формулой
R₁-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-R₂
и их солей, где R₁ и R₂ независимо друг от друга выбраны из группы, включающей водород, гидрокиси, остаток аминокислоты и остаток полипептида, при условии, что R₁ и R₂ не являются одновременно водородом или гидроксилом. Пептид может содержать замещения, добавления или делении при условии сохранения пептидом своего свойства нейтрализовать или модулировать выработку антител к МВР человека.

Ниже приведены примеры пептидов, выбранные из группы, включающей
МВР84-93
Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile
МВР85-94
Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val
МВР86-95
Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr
МВР87-96
Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-VaI-Thr-Pro
MBP82-98
Asp-Glu-Asn-Pro-Val-Val-His-Phe-Phe-Lys-Asn-Ile-Val-Thr-Pro-Arg-Thr
B силу наличия пяти дополнительных гидрофильных остатков пептид MBP82-98 имеет повышенную растворимость в сравнении с другими пептидами, заявленными в настоящем изобретении. Таким образом, использование данного пептида является предпочтительным по сравнению с другими пептидами, заявленными в настоящем изобретении.

Возможная роль анти-МВР в патогенезе рассеянного склероза продолжает исследоваться. О повышенных титрах анти-МВР у больных активной формой рассеянного склероза впервые сообщили Panich et al. (Panitch, H. S., Hooper, С. S., and Johnson, K. P., Arch Neurol 37: 206-209, 1980), которые использовали твердофазный радиоиммунологический анализ с МВР морской свинки. Пациенты с острым рецидивом заболевания, как правило, имели повышенное содержание анти-МВР, в основном, в свободной форме, тогда как некоторые больные в стадии клинической ремиссии могли иметь необнаруживаемые уровни анти-МВР. Во время переходного периода от острой дозы к ремиссии титры свободных анти-МВР прогрессивно снижались за период от нескольких недель до нескольких месяцев, в то время как уровень связанных антител был сравним с первоначальным. У других больных на стадии ремиссии можно было наблюдать низкие титры свободных и связанных анти-МВР, обычно с соотношением F/B меньше 1.

Это позволяет предположить, что антитела (антитело), нейтрализующие анти-МВР, связываются с анти-МВР. Иногда больные, которые точно соответствовали критериям клинически определяемого рассеянного склероза или больные с нейропатологически выявленным рассеянным склерозом, имели неопределяемый уровень анти-МВР в период активной стадии заболевания. Возможно, такие пациенты имеют антитела к другим миелиновым белкам. Отсутствие схемы выработки специфических антител не уменьшает потенциальной возможной роли анти-МВР в механизме демиелинизации у большинства больных рассеянным склерозом.

Недавно различные антитела к МВР были обнаружены во фракции IqG, выделенной из спинномозговой жидкости больных рассеянньм склерозом (Warren, К.G. and Catz, I., J. Neurol Sci 96: 19-27, 1990). Первичные антитела к МВР как в свободной, так и в связанной форме оказались связанными с активной фазой заболевания: F/B>1 у пациентов с острой формой и <1 - у пациентов с хронически прогрессирующей формой рассеянного склероза (Warren, К. G. and Catz, I., Ann Neurol 209: 20-25, 1986; Catz, I., and Warren, K. G. Can J Neurol Sci 13: 21 -24,1986; and Warren, K. G. and Catz, I., Ann Neurol 21: 183-187,1987). Вторичные антитела, которые нейтрализуют анти-МВР, появляются, когда заболевание переходит в неактивную форму. Третичные антитела, которые ингибируют нейтрализацию анти-МВР, обнаруживаются, когда заболевание становится хронически прогрессирующим и переходит в неактивную форму. Тот факт, что каскад антител к МБР ассоциирован с фазами (MS), позволяет предположить, что образование таких антител, возможно, играет важную роль в развитии данного заболевания.

Несмотря на то, что анти-МВР могут быть определены в CSF больных с активной формой рассеянного склероза (MS), их главная роль в патогенезе демиелинизации остается неподтвержденной. Участие анти-МВР в механизме развития рассеянного склероза (MS) лучше всего может быть установлено их нейтрализацией in vivo, возможно, при введении заявленных пептидов и мониторингом клинического течения заболевания. Если анти-МВР являются только первичными антителами, связанными с демиелинизацией при рассеянном склерозе (MS), вероятно, возможно блокировать димиелинизацию внутриоболочечным и/или внутривенным и/или оральным введением заявленных МВР пептидов, которые нейтрализовали бы анти-МВР и обеспечивали бы толерантность к МВР in situ. Другие миелиновые белки человека, возможно, также участвуют в димиелинизации при рассеянном склерозе (MS) и, в соответствии с этим, в объем настоящего изобретения включено использование пептидов, в значительной мере гомологичных по аминокислотной последовательности части аминокислотной последовательности указанных других миелиновых белков, для того, чтобы нейтрализовать соответствующие антитела. Несмотря на то, что предыдущие попытки лечения рассеянного склероза (MS) внутримышечным или подкожным введением гетерологичного МВР не оказались в полной мере успешными (Campbel, В.,Vogel, R. J., Fisher, E. and Lorenz, R., Arch. Neuro l29: 10-15, 1973; Gousette, R. E., Delmotte. P. and Demonty, L. J .Neurol 216: 27-31,1977; and Romine, J. S. and Salk; J., In: Halpike, J. F., Adams, C. W. M. and Tourtelotte, W. W., eds. Multiple Sclerosis. Baltimore, Williams & Wilkins, 1982: 621-630), внутриоболочечное и/или внутривенное введение МВР пептидов, которые нейтрализуют или модулируют выработку анти-МВР, в соответствии с изобретением продемонстрировало более успешные результаты.

Моделью MS на животных служит экспериментальный аллергический энцефаломиелит (ЕАЕ), представляющий собой опосредованное Т-клетками демиелинизирующее заболевание. Симптомы ЕАЕ могут быть скорригированы введением мышам синтетических пептидов МВР (Gaur, A. et al., Science, 258, 1491-1494, 1992). Более того, введение высоких доз МВР делегировало аутореактивные Т-клетки и аннулировало клинические и патологические симптомы ЕАЕ у мышей (Gritchfield, J. M. et al., Science, 263, 1139-1143, 1994). Даже оральное введение МВР модулировало течение ЕАЕ за счет индукции периферической толерантности (Chen, W. et al., Science, 265, 1237-1240, 1394).

Недавно на основании сдвоенных пробных экспериментов было высказано предположение, что толерантность может быть индуцирована у больных MS оральным введением миелиновых антигенов (Weiner, H, L. et al. Science 259, 1321-1324, 1993). Комбинация миелиновых антигенов и синтетических пептидов указанных антигенов, введенная оральным, и/или внутривенным, и/или внутриоболочечным путем, возможно, необходима для модулирования Т-клеток, В-клеток и макрофагов, участвующих в деструкции миелина у больных рассеянным склерозом (MS).

Соответственно изобретение также касается фармацевтической композиции, содержащей в качестве активного ингредиента пептид, описанный выше, отдельно или в композиции, в смеси с фармацевтически приемлемым носителем. Примеры фармацевтически пригодных носителей хорошо известны и включают, например, физиологический раствор.

Пептиды, заявленные в настоящем изобретении, могут назначаться людям для лечения или модулирования MS. Терапевтическая доза для внутривенного и/или орального введения при лечении MS может составлять от примерно 1.0 мг на 1 кг веса тела до примерно 10.0 мг на 1 кг веса тела. Если введение осуществляется внутриоболочечно, доза может составлять от около 1 до около 10 мг. В одном из примеров изобретения пептид применяется либо внутривенно, либо внутриоболочечно или сочетанием данных методов. Если требуется, пептиды могут назначаться как однократной дозой, так и последовательно в виде нескольких доз.

В соответствии с настоящим изобретением, внутривенное введение пептида снижает количество как свобоных, так и связанных анти-МВР антител; внутриоболочечное введение пептида оказалось эффективным только для нейтрализации или модулирования свободных анти-МВР антител.

В одном из вариантов осуществления настоящего изобретения было показано, что последовательное внутриоболочечное введение пептидов МВР может снижать количество свободных анти-МВР антител и поддерживать их количество на низком уровне в течение месяцев после инъекции пептидов больным, страдающим от моносимптоматических рецидивов. В одном из примеров, согласно данному варианту осуществления изобретения, 50 мг пептида МВР вводили больному ежедневно в течение четырех - пяти дней. Согласно другому примеру, может быть введена дополнительная доза спустя одну или две недели после первоначальных инъекций.

В то время, как в описании изобретения детально и подробно изложены предпочтительные варианты его осуществления, нижеследующие примеры иллюстрируют, но не ограничивают изобретение.

ПРИМЕР 1
Нейтрализация антител к МВР человека in vitro.

Фиг.1 показывает локализацию 18 пептидов человеческого МВР, используемых в этом опыте, по отношению к молекуле интактного МВР. Нативный МВР был выделен из ткани мозга, не пораженного рассеянным склерозом (MS) (Diebler, G. E., Martenson, R. Е-, Kies, W. W. Prep Biochem 2: 139-165, 1972) и далее очищен гель-фильтрацией. Конечные антигенные препараты были проверены на чистоту SDS-электрофорезом в полиакриламидном геле. В дальнейших исследованиях использовались только те препараты, которые перемещались соответственно молекулярному весу 18.5 кД. Очищенный МВР был использован в антиген-специфичной аффинной хроматографии, в опытах по нейтрализации и в твердофазном радиоиммуноисследовании при использовании анти-МВР.

Было синтезировано восемнадцать пептидов, покрывающих в сумме всю протяженность h-MBP и содержащих от 8 до 25 аминокислотных остатков. Синтез проводили методом Fmoc, как описано ранее (Groome, N.P., Dawkes, A., Barry, R. et al., J.Neuroimmun. 19:305-315,1988). Степень чистоты каждого препарата пептида проверяли обратно-фазной HPLC на колонке С18 и градиентом вода/ацетонитрил (0.1% TFA). Аминокислотный анализ пептидов проводили с использованием стандартных методов. Многие из использованных в настоящем исследовании пептидов содержали неприродный остаток цистеина, поскольку в сочетании с адъювантом Фрейнда они должны были действовать как иммуногены. Маловероятно, чтобы это обстоятельство повлияло на полученные результаты.

Цереброспинальную жидкость (ЦСЖ) получали в течение недели с момента появления симптомов от 35 больных с острыми рецидивами рассеянного склероза. Содержание IgG в ЦСЖ определяли нефелометрически. Использованные в данном эксперименте образцы ЦСЖ были выбраны так, чтобы исходно содержать большое количество IgG (≥0.080 г/л) и повышенные титры анти-МВР (отношение F/B>1.0). У всех больных рассеянный склероз был подтвержден клинически.

IgG выделяли из концентрированной ЦСЖ больных острым рассеянным склерозом путем аффинной хроматографии на белок А-сефарозе (Pharmacia^TM), как описано ранее (Warren, K. G. and Catz, I., J.Neurol. Sci. 96:19-27,1990). Степень чистоты каждого препарата IgG проверяли электрофорезом в полиакриламидном геле и изоэлектрофокусировкой. Когда образцы анти-МВР из очищенных препаратов IgG адсорбировали до нуля с МВР, то супернатанты после адсорбции не содержали остаточных IgG, что свидетельствовало о том, что анти-МВР были представлены только во фракции "увеличенных" IgG.

Очищенный МВР конъюгировали с CNBr-активированной Сефарозой 4В (Pharmacia^TM) в соответствии с инструкциями производителя. Очищенные IgG из ЦСЖ 35 больных с острыми рецидивами рассеянного склероза, содержащие повышенные количества анти-МВР, были использованы для выделения анти-МВР аффинной хроматографией на МВР-Сефарозе (Warren, K.G. and Catz, I. J.Neurol. Sci. 103:90-96,1991). Очищенные образцы анти-МВР сравнивали с исходными IgG электрофорезом в полиакриламидном геле. Когда очищенные образцы анти-МВР адсорбировали до нуля с МВР, то после адсорбции супернатанты не содержали остаточных IgG, что свидетельствовало о чистоте анти-МВР.

Одинаковые количества анти-МВР (15 единиц связывания радиоактивности, что соответствовало 100 при установке на шкале =%0) инкубировали с возрастающими количествами h-MBP (0-1000 нг) или индивидуальными пептидами МВР (0-10.000 нг) в жидкофазном тесте и после 1.5 часов инкубации во всех смесях определяли количество свободных анти-МВР. В опытах по нейтрализации использовали анти-МВР, полученные от 7 отдельных больных, или смешанные анти-МВР, полученные от 10 различных больных. В качестве отрицальных антигенных контролей использовали гистон тимуса теленка и человеческий сывороточный альбумин (в интервале 10-1000 нг). Одно моноклональное антитело (МКА) к пептиду МВР64-78 и поликлональную кроличью антисыворотку к пептиду МВР 1-8 использовали в качестве положительных антительных контролей (Groome, N., Harland, J. and Dawkes, A. , Neurochem. Int. 7:309-317,1985; Barry, R., Payton, M. and Groome, N. , Neurochem. Int. 2:291 -300,1991). В качестве отрицального антительного контроля использовали другое мышиное моноклональное антитело к эпитопу 45-50.

Уровни анти-МВР определяли в твердофазном радиоиммунологическом тесте с МВР человека (Warren, K.G. and Catz, I., Ann.Neurol. 209:20-25,1986; Warren, K.G. and Catz, I.. Ann.Neurol. 210:183-187.1987; и Warren, K.G. and Catz, I. , J.Neurol. Sci. 91:143-151,1989). Во всех фракциях, полученных после аффинной хроматографии, а также во всех нейтрализационных смесях определяли количества свободных анти-МВР. Все индивидуальные образцы тестировали четыре раза с использованием одного иодированного материала с тем, чтобы минимизировать различия между тестами.

Очищенные анти-МВР были полностью нейтрализованы МВР и пептидами МВР 80-97, МВР 91-106, и МВР 75-95 и были частично нейтрализованы пептидами МВР 64-78, МВР 69-83 и МВР 61-75 (табл.1 и фиг.2). Оставшиеся 12 пептидов не нейтрализовали очищенные анти-МВР, и их кинетические кривые показывают спад в пределах заштрихованной области, см. фиг.2. Гистон тимуса теленка и альбумин сыворотки человека не реагировали с очищенными анти-МВР даже при концентрациях выше 1000 нг. Клон 26 ингибировался только пептидом МВР 64-78. R 155 ингибировался только пептидом МВР 1-8. Клон 16 не реагировал ни с МВР, ни с другими пептидами (для чистоты изображения данные контроля не приведены). Контрольные образцы показывают обоснованность подхода в отношении нейтрализации, так как каждое контрольное антитело было абсолютно нейтрализовано выбранным пептидом и никакими другими. Это показывает, что специфичность взаимодействия имеет место даже при высоких концентрациях пептидов (10 000 нг).

Анти-МВР, полученные от 7 разных больных, были полностью нейтрализованы МВР человека и пептидами МБР 80-97, МВР 91-106 и МВР 75-95 (см. фиг.3, как иллюстрацию). Поскольку полученное от отдельных пациентов количество антител было ограничено, анти-МВР не подвергали реакции с остальными 15 пептидами.

Как указано выше, анти-МВР были нейтрализованы пептидами, соответствующими промежутку между 61-106 аминокислотными остатками. Пептиды, которые не нейтрализовали анти-МВР, охватывают аминоконцевой (примерно от 1 до 63 остатков) и карбоксиконцевой (примерно от 117 до 162 остатка) участки МВР человека. По-видимому, пептиды от различных не перекрывающихся участков МВР нейтрализуют одни и те же антитела. Это может объясняться тем, что антитела узнают прерывистый эпитоп, содержащий аминогруппы различных участков. Подобный факт ранее наблюдался Hruby et al. (Hruby, S., Alvord, E. C., Groome, N. P. et al., Molec Immun 24: 1359-1364, 1987), который показал, что крысиное моноклональное антитело имеет основной эпитоп в последовательности МВР 112-121, и в то время сильную перекрестную реактивность с другим эпитопом 39-91. Это более вероятно, чем возможность того, что антитело имеет перекрестную реактивность по отношению к двум совершенно различным последовательностям, которые не образуют прерывистого эпитопа (Hruby, S., Alvord, E. С. , Alvord, E. С., Marteuson R. E. et al., J. Neurochem 44: 637-650, 1985). Данные по нейтрализации могут быть объяснены способностью пептидов, соответствующих различным участкам МВР, частично занимать связывающую область антитела, взаимодействуя с различными аминокислотами в боковых цепях. Это объяснение подтверждается тем наблюдением, что пептиды, обеспечивающие полное ингибирование (МВР 80-97, МВР 91-106 и МВР 75-95), приблизительно в 100 раз менее эффективны в молярном отношении, чем интактный МВР. Исходя из вышеизложенной гипотезы, это могло быть обусловлено тем, что каждый пептидный клон не способен достичь энергии связывания с действительным эпитопом МВР.

ПРИМЕР 2
Нейтрализация или модулирование образования антител к МБР человека in vivo
Подбор больных и контрольные исследования
Больные, которых подобрали для данного исследовательского проекта, наблюдались в клинике по уходу и исследованию больных рассеянным склерозом Университета Альберты, Эдмонтон, Канада. Пациенты были продиагностированы как больные рассеянным склерозом по критерию Шумахера (1965) с подтверждением диагноза методом получения изображения мозга с помощью магнитного резонанса и/или иммунохимическими профилями спинномозговой жидкости (CSF). Для того, чтобы проиллюстрировать, что при хронически прогрессирующем рассеянном склерозе (MS) уровень анти-МВР устойчиво повышен в течение продолжительных периодов времени, от месяцев до нескольких лет, у больных повторно брали пункции CSF поясничного отдела с контролем свободных и связанных анти-МВР. У больных с хронически прогрессирующим заболеванием (MS) уровень аутоантител остается устойчиво повышенным в течение 11 лет и спонтанного спада уровня анти-МВР не происходит (фиг.14 как иллюстрирующий пример).

Для того, чтобы определить, что изначально повышенные уровни анти-МВР в спинномозговой жидкости (CSF) оставались относительно постоянными в течение 24 часов, у двух больных (1F56 и 3М66) брали образцы CSF каждые 30 мин в течение 2 ч так же, как 24-мя часами позже, с контролированием свободной и связанной форм анти-МВР (фиг.5А и 5В соответственно). Больные 1F56 и 3М66 служили в качестве временных контролей. Уровни свободных и связанных анти-МВР оставались неизменно повышенными при исследованиях CSF каждые 30 мин в течение 2-х часов так же, как и спустя 24 ч.

Кроме того, подобным образом был определен эффект введения 5 см³ физиологического раствора в спинномозговую жидкость двум другим больным (4М45 и 5М59) (фиг. 5С и 5Д соответственно). Эти больные служили в качестве временных контролей с физиологическим раствором. При введении 5 см³ физиологического раствора внутриоболочечно уровни F и В анти-МВР оставались повышенными по сравнению с базовым уровнем, когда образцы CSF исследовались, как описано выше, подтверждая таким образом, что "эффект разведения" на титры анти-МВР был незначительным.

Уровни анти-МВР определяли твердофазным радиоиммунологическим анализом с МВР человека, адсорбированным в лунках панели для микротитрования "Иммунлон". Лунки покрывали 100 мкл МВР в концентрации 10 мкг/мл (1 мкг/лунку) и инкубировали в течение ночи при 37^oС. После нанесения BSA и трехкратного отмывания водой панели выдерживались при комнатной температуре. Образцы (100 мкл) CSF или экстракта ткани, растворенные в 0.010 г IgG/л (0.01 М PBS буфер, 0.05% Твин 20), инкубировали в МВР-покрытых ячейках в течение 1-2 ч при комнатной температуре. После пяти отмываний буфером (0.01 М PBS, 0.05% Твин 20) ячейки инкубировали с антителами козы к IgG-Fc кролика (0.01 М PBS, 0.05% Твин 20, 0.5% BSA) в течение 1 ч при комнатной температуре и затем отмывали, как описано выше. Наконец, добавляли меченый ¹²⁵I-протеин А (или ¹²⁵I -протеин G) и инкубировали в течение 1 ч при комнатной температуре. Когда в качестве метки использовали ¹²⁵I-протеин G, BSA в буфере для исследований и для процедуры истощения заменяли на овальбумин. После трехкратного завершающего отмывания водой лунки обсчитывали индивидуально. Результаты, выраженные в единицах радиоактивности, представляли следующим образом: (счет образца - счет контроля) е (общий счет радиоактивности - счет контроля). Все образцы исследовали в 10 повторах, и время счета составляло 10 мин для того, чтобы зарегистрировать >10000 единиц радиоактивности в каждом положительном образце.

Перед исследованием все образцы CSF и/или образцы ткани разводили до конечной концентрации IgG 0.010 г/л. Свободные (F) анти-МВР определяли непосредственно в CSF или тканевом экстракте, тогда как уровни связанных антител определяли после кислотного гидролиза иммунных комплексов. Неспецифичное связывание наблюдалось для каждого образца в непокрытых лунках. С целью локализации эпитопа синтетические пептиды сначала подвергали взаимодействию с очищенными антителами в жидкофазном конкурентном исследовании, после чего анти-МВР определяли радиоиммунологическим анализом во всех конечных смесях. Результаты анализов конкурентного связывания и радиоиммуноанализа выражали как процент ингибирования синтетического пептида, определенный как 100 единиц радиоактивности. Пробы исследовались в 10 повторах и обсчитывались в течение 10 мин на LKB1275 Minigamma-счетчике. Объединенные выделенные из ткани анти-МВР использовались в 5 предварительно приготовленных разведениях в качестве позитивных контролей. CSF, собранная от больных с неневрологическими заболеваниями, служила негативным контролем. Воспроизводимость исследований составляла от 3 до 5%, а разброс данных менее 7%.

Определение постоянной повышенных уровней анти-МВР в CSF в контрольных экспериментах составило следующую стадию исследования.

Контрольный "слепой" эксперимент фазы I с дублированным пептидом - внутриоболочечная инъекция
Проводят фазу 1 эксперимента по определению действия синтетического пептида МВР 75-95 на титры F и В анти-МВР в спинномозговой жидкости. После утверждения в Научном Совете по этике Университета Альберты проект был осуществлен при участии больных с клинически установленным диагнозом рассеянного склероза (MS) (Schumacher et al., Ann NY Acad. Sci., 122, 552-568, 1965), тяжелобольных инвалидов с сильно прогрессирующим заболеванием. Четырнадцать больных согласились добровольно участвовать в этом исследовании; 8 больных были отобраны по начальному титру F анти-МВР в CSF (около 8 единиц радиоактивности) (табл.2) для получения одной внутриоболочечной инъекции либо пептидов МВР 75-95, которые связывают анти-МВР in vitro, либо не связывающего контрольного пептида МВР 35-58 (Warren and Catz, 1993).

Эксперимент проводили методом двойного "слепого" варианта, когда ни исследователи, ни испытуемые не знали природы вводимого вещества. Все пептиды были закодированы семью наугад выбранными однозначными номерами посторонним врачом. Парные пептиды, растворенные в 5 см³ физиологического раствора и введенные в CSF путем поясничной пункции, использовались в возрастающих дозах (1, 2.5, 5 и 10 мг). CSF исследовалась до инъекции (базовая линия) с 30 минутными интервалами в течение 2 ч после инъекции, 24 часами позже и затем с предельным интервалом в течение 3-4 недель до тех пор, пока уровни анти-МВР не вернулись к базовому (исходному). Подсчет клеток, общий белок, глюкоза, уровни IgG и альбумина были определены во всех образцах CSF. Уровни свободных и связанных анти-МВР определяли радиоиммуноанализом, как описано выше.

Табл. 2: Клинические данные и уровни анти-МВР в CSF у 14 больных с хронически прогрессирующим рассеянным склерозом (MS), давших согласие участвовать в фазе 1 научного исследования, предусматривающего внутриоболочечную однократную инъекцию синтетических пептидов МВР. Поскольку был необходим исходно высокий уровень свободных (F) анти-МВР (>8 единиц радиоактивности), для того, чтобы получить значительное постинъекционное изменение, для исследования было отобрано только 8 из 14 больных.

Все пептиды, используемые в данных исследованиях, синтезировались под кодом "продукт хорошего качества" (GMP) на основе F_moc (9-метоксикарбонил) метода Рrосуоп Inc. (L. Ontario, Canada). Чистоту пептидов контролировали жидкостной обратнофазовой хроматографией на колонке С 18 при водно-ацетонитрильном градиенте, содержащем 0.1% ТХУ. Масс-спектроскопия и аминокислотный анализ выполнялись на основе стандартных методик. Перед введением все пептиды тестировались на пирогенность (Ванкуверский Генеральный госпиталь, Ванкувер, Канада), стерильность (местная лаборатория Общественного Здравоохранения Северной Альберты, Эдмонтон, Канада) и острую токсичность (Служба Лаборатория медицинских исследований Университета Альберты, Канада). Было показано, что они "пригодны" для введения людям. Соответствующие количества закодированных синтетических пептидов растворяли в 5 см³ стерильного физиологического раствора (0.9% Nad, инъекция USP, апирогенный, Baxter Corp, Toronto, Canada) фильтровали 2 раза через стерилизующую мембрану с размером пор 0.22 мкм (Millex-GX, Millipore Corp., Bedford, M A, USA) и вводили в спинномозговую жидкость (CSF) путем поясничной инъекции.

Сравнительные (между пациентами) исследования пептидов
Больные 6F33, 8М41, 4М45 и 1F56 получали синтетический пептид МВР 75-95, способный связывать анти-МВР in vitro, а пациенты 10F36, 13F43, 5М59 и 3М66 получали "контрольный" несвязывающий синтетический пептид МВР 35-58 в возрастающих дозах 1, 2.5, 5 и 10 мг соответственно (фиг.6). У больного 6F53 (фиг. 6В), который получил 1 мг МВР 75-95, наблюдалось 75% уменьшение свободных анти-МВР с немедленным возвращением их к исходному уровню; у больного 8М41 (фиг. 6D), который получил 2.5 мг МВР 75-95, наблюдались полное связывание-нейтрализация свободных анти-МВР, а затем их уровень вернулся к исходному через 24 ч; у больного 4М45 (фиг.6F), которому ввели 5 мг МВР 75-95, произошли резкое и полное связывание-нейтрализация свободных анти-МВР, что продолжалось в течение 7 дней с возвратом к исходному уровню, как было установлено, спустя 21 день; у больного 1F56 (фиг. 6Н), которому ввели 10 мг МВР 75-95, также произошли полное связывание-нейтрализация свободных анти-МВР, что продолжалось в течение 7 дней, и затем уровень антител вернулся к исходным значениям, как было установлено, в период с 14 по 28 день. Уровни связанных анти-МВР несущественно изменялись при однократном внутриоболочечном введении МВР 75-95. У больных 10F38, 13F43, 5М59 и 3М66, которым было введено соответственно 1,2.5, 5 и 10 мг контрольного несвязывающего пептида МВР 35-58, уровни свободных и связанных антител в CSF оставались измененными по отношению к исходному в течение 24 часов эксперимента (фиг.6А, 6С, 6Е и 6G соответственно). Традиционные CSF-параметры воспаления при MS, такие, как счет клеток, абсолютные уровни общего белка, IgG и альбумина, олигоклональное связывание, индекс IgG и синтез IgG в CNS оставались неизменяемыми до и после введения пептида.

Сравнительные исследования пептидов при введении одному пациенту
Эти исследования проводились для того, чтобы минимизировать вариабельность результатов полученных исследований нескольких больных. У больного 5М59, которому вводили либо физиологический раствор (временный контроль), либо 5 мг несвязывающего пептида МВР 35-58, уровни свободных анти-МВР оставались повышенными относительно исходного уровня во время обоих экспериментов (фиг. 7А). Больному 4М45 первоначально вводили физиологический раствор (временную контроль), а двумя месяцами позже ему ввели 5 мг МВР 75-95. Уровни свободных больных анти-МВР оставались устойчиво повышенными во всех образцах, собранных во время контрольного эксперимента, и стали необнаруживаемыми после введения МВР 75-95 (фиг.7В). Подобные результаты были получены и у больной 1F56, которая имела устойчиво повышенные уровни свободных антител в течение контрольного эксперимента, а после введения 10 мг МВР 75-95 ее свободные анти-МВР стали необнаруживаемыми (фиг.7С). Полное исследование было проведено с больным 3М66. У него уровни свободных анти-МВР были устойчиво повышенными в течение контрольного эксперимента или при введении 10 мг МВР 35-58; однако, когда были введены 10 мг МВР 75-95, свободные анти-МВР были полностью нейтрализованы и не обнаруживались в течение 7 дней (фиг.7D).

Повторное введение синтетического пептида МВР 75-95
После установления того, что пептид МВР 75-95 нейтрализует свободные анти-МВР in vivo за период, больший чем 7 суток, было принято решение о повторном введении 10 мг МВР 75-95 в спинномозговую жидкость еженедельно в течение 10 недель. Этот эксперимент был проведен с участием трех больных с прогрессирующим рассеянным склерозом (MS), которые не участвовали в эксперименте по однократному введению пептидов и дали согласие на это исследование. Свободные и связанные анти-МВР определялись за 1-2 недели до первого введения, до и после 30 мин после каждой инъекции и вновь спустя 1 и 2 месяца после последней инъекции. Счет клеток, общий белок, глюкозу, IgG и альбумин определяли во всех образцах CSF, полученных перед каждой из 10 инъекций. Перед первой и после последней инъекции отбирали кровь и анализировали содержание электролитов, креатинина, ферментов сердца и печени и гематологические показатели.

Когда больные хронически прогрессирующей формой рассеянного склероза (MS) получали повторные внутриоболочечные инъекции 10 мг МВР 75-95 с недельным интервалом (в течение периода до 10 недель), первоначально высокий уровень свободных анти-МВР мог становиться необнаруживаемым, пока вводился пептид; когда пептид прекращали вводить, уровень свободных анти-МВР возвращался на исходный в течение 1 месяца (фиг.8). Титры связанных антител оставались постоянно высокими в ходе всего эксперимента, что свидетельствовало о том, что у данных больных синтез анти-МВР продолжался и внутриоболочечное введение пептида оказывало только "стирающий" эффект на свободные анти-МВР антитела.

Больные, которые участвовали в этих исследованиях и которые получали либо однократные инъекции синтетических пептидов, либо повторяемые еженедельно инъекции, имели хронически прогрессирующий рассеянный склероз с повышенной степенью неврологических повреждений. Ни один из этих больных не сообщил об ухудшении неврологических симптомов или об обострениях болезни (MS), последовавших в результате внутриоболочечного введения пептидов, и клеточная реакция в CSF не развивалась. Больные, получавшие повторные введения МВР 75-95, контролировались на развитие возможных соматических осложнений, включая изменения электролитов, так же и дисфункцию сердца, печени, почек и гематологические изменения, и никаких нежелательных осложнений не было выявлено.

Внутривенное ведение МВР 75-95
После установления того факта, что внутриоболочечное введение пептида МВР 75-95 приводит к связыванию свободных анти-МВР без изменения уровня связанных антител, было решено определить влияние внутривенного введения того же пептида на титры в CSF свободных и связанных анти-МВР; 500 мг МВР 75-95 растворяли в 100 см³ физиологического раствора и вводили внутривенно спустя 30 мин больному 8М41 при постоянном контроле анти-МВР в CSF каждые 30 мин в течение первых двух часов, 18 ч спустя и 10,16 и 30 дней спустя. Кровь отбирали перед инъекцией, а также через 16 и 30 дней и анализировали на содержание электролитов, креатинина, сердечных и печеночных ферментов и гематологические показатели. В спинномозговой жидкости определяли количество клеток, общий белок, глюкозу, содержание IgG и альбумина. Никаких отрицательных эффектов не наблюдалось.

Как показано на фиг.8, внутривенное введение 500 мг МВР 75-95 не дает никаких изменений в уровнях титров связанных и свободных анти-МВР в CSF на протяжении первых двух часов; 30%-ное падение уровня свободных анти-МВР в CSF наблюдалось через 18 часов. Когда CSF повторно подвергалась анализу через 10, 16 и 30 дней, уровни свободных и связанных анти-МВР опускались ниже исходного с 11 единиц радиоактивности до 4, 2 и 1 радиоактивных единиц соответственно.

При повторных наблюдениях у пациентов с внутриоболочечными инъекциями МВР часто наблюдалась устойчивость повышенных уровней связанных антител, тогда как свободные анти-МВР были необнаруживаемыми после внутриоболочечной инъекции МВР 75-95. Это свидетельствует о том, что воспалительный процесс, вызванный аутоантителами к МВР, остается активным во время и после внутриоболочечного введения МВР 75-95. Для подтверждения этого наблюдения МВР 75-95 был введен внутривенно пациенту, который предварительно получил внутриоболочечную инъекцию пептида. После внутривенного введения уровни и свободных и связанных антител в CSF значительно снижались при наблюдении в течение месяца. Снижение как свободных, так и связанных антител CSF после внутривенного введения МВР 75-95 означает, что имеет место снижающая регуляция аутоиммунного воспалительного процесса, ответственного за синтез анти-МВР. Дальнейшие наблюдения показали, что уровень анти-МВР начал возрастать спустя 4-6 месяцев после первого внутривенного введения, второе внутривенное введение того же пептида выработало низкую регуляцию синтеза анти-МВР сроком до 2 лет у примерно 70 различных пациентов с хроническим прогрессивным MS.

МВР эпитоп для анти-МВР при MS
Для определения локализации МВР эпитопа для анти-МВР при MS свободные и связанные анти-МВР, очищенные аффинной хроматографией из CSF и ткани мозга больных рассеянным склерозом (MS) (Warren К. G. , et al., Ann. Neurol. 35,280-283,1994), подвергали взаимодействию в исследованиях по конкурентному ингибированию с 41 последовательным синтетическим пептидом МВР равной длины (каждый пептид состоит из 10 остатков и перекрывает соседний на 9 остатков), занимающих участок между 61 и 110 остатками МВР человека. Было установлено, что пептид(ы), обеспечивающие максимальное ингибирование, наиболее прочно соединяются с антиген-связывающей областью антитела.

Максимальное ингибирование (i80%) очищенных свободных и связанных анти-МВР из ткани мозга больного рассеянным склерозом (фиг.10) обеспечивалось четырьмя декапептидами, обозначенными МВР 84-93, МВР 85-94, МВР 86-95 и МВР 87-96, позволяя предположить, что эпитоп МВР для анти-МВР локализован между 84 и 96 остатками. Минимальный участок общих аминокислотных остатков находится между 87 и 93 остатком. Связанные антитела имеют более ограниченную направленность, чем свободные антитела.

Роль антител к анти-МВР в патогенезе демиелинизации при рассеянном склерозе еще не установлена и может единственно быть определена модулированием анти-МВР in vivo и последовательным наблюдением за клиническими и патологическими проявлениями. Например, во время острых стадий MS, когда отношение свободных и связанных антител выше 1, пептид, который известен как связывающий свободные анти-МВР, может быть введен внутриоболочечно для того, чтобы связать свободно циркулирующие антитела и скорригировать клинические симптомы острого рецидива; еженедельное введение может быть необходимо до наступления ремиссии. Для больных с хронически прогрессирующим заболеванием внутривенное введение пептида так же, как и внутриоболочечное ведение, может быть необходимо для регулирования механизмов воспаления, которые вызваны анти-МВР.

ПРИМЕР 3
Соответствующая дозировка для внутриоболочечного введения рМВР86-95 или рМВР82-98 больным с острыми рецидивами
Для рецидивов рассеянного склероза характерны значения F/B анти-МВР, больше чем 1.0, поскольку в ЦСЖ преобладают свободные антитела. Обычно, в течение трех месяцев по мере перехода рецидива в последующую фазу выздоровления/ремиссии, уровень F анти-МВР постепенно снижается и с наступлением полной биологической ремиссии F и В анти-МВР становятся необнаружимы в ЦСЖ.

У больных, которые участвовали в экспериментах, описанных в последующих примерах, был диагностирован рецидивно-возвратный или рецидивно-прогрессирующий рассеянный склероз.

В настоящем и последующих примерах применяли рМВР86-95 или рМВР82-98. рМВР86-95 был очень слабо растворим в физиологическом растворе, поскольку содержал четыре гидрофильных и шесть гидрофобных остатков. С другой стороны, пептид рМВР82-98 обладал повышенной растворимостью в физиологическом растворе, поскольку содержал пять дополнительных гидрофильных остатков.

В экспериментах, имеющих целью определить соответствующие дозировки для внутриоболочечного введения рМВР86-95 или рМВР82-98, которые немедленно снижали бы количество F анти-МВР до необнаружимого уровня, принимали участие двое больных. У одного больного был острый рецидив атаксии с утратой равновесия.

С началом рецидива данному больному была проведена единичная внутриоболочечная инъекция 10 мг рМВР86-95; количество F и В антител определяли до инъекции и через 1 час после инъекции, а также еще 5 раз на протяжении последующих 3 месяцев. Примененная дозировка рМВР8б-95 подавляла F анти-МВР лишь частично и кривая восстановления уровня антител была близка к естественной; у этого больного продолжались прогрессирующие спастические парапарезы и атаксия. Был сделан вывод о том, что единичная внутриоболочечная инъекция 10 мг рМВР86-95 недостаточна для полного подавления F анти-МВР и изменения естественной скорости выздоровления.

У другой больной, 18-летней женщины с острым оптическим невритом, которой производили единичную внутриоболочечную инъекцию 50 мг рМВР86-95, количество F и В антител определяли до инъекции и через 30 минут после инъекции. Через 30 мин после инъекции свободные антитела не обнаруживались. Больная не согласилась на последующие поясничные пункции. Был сделан вывод о том, что дозировка не менее 50 мг рМВР86-95 необходима для связывания и нейтрализации F анти-МВР в СЦЖ на срок не менее 30 мин.

ПРИМЕР 4
Частота и продолжительность введений больным с моносимптоматическими рецидивами
В данном эксперименте определяли частоту и продолжительность введений рМВР, которые требуются для поддержания низкого или необнаружимого уровня свободных антител в течение длительного времени. Четыре пациента, участовавшие в данном эксперименте, получали синтетические пептиды в течение первой недели рецидива.

У первых двух больных были рецидивы острого одностороннего оптического неврита. Одному из этих больных (фиг. 11a) было проведено две внутриоболочечные инъекции 50 мг рМВР86-95 (it#1, it#2) с интервалом в четыре недели. После каждой инъекции свободные (F) анти-МВР становились необнаружимы в течение 1 ч. Через неделю после первой инъекции уровень F анти-МВР был повышен, а спустя 4 недели уровень F анти-МВР был весьма высок. В тот момент больному была проведена вторая внутриоболочечная инъекция (it#2) и F анти-МВР стали необнаружимы в течение 30 мин. В течение последующих 24 ч их уровень не контролировали. Был сделан вывод о том, что выбранная частота недостаточна и что для поддержания незначительного уровня антител могут потребоваться многократные инъекции в течение первой недели рецидива.

Второму больному с полным односторонним оптическим невритом проводили множественные внутриоболочечные инъекции 50 мгрМВР82-98 в течение первой недели рецидива: четыре ежедневные инъекции (фиг. 11b: it#1, it#2, it#3, it#4) и пятую инъекцию (it#5) спустя неделю. Профиль анти-МВР у данного больного показал уверенное и быстрое снижение в течение семидневного периода. Важно, что спустя 7 недель и 6 месяцев уровень анти-МВР в СЦЖ данного больного оставался необнаружимым и больной не испытывал рецидивов оптического неврита или других рецидивов рассеянного склероза. Кроме того, односторонняя слепота, являвшаяся вторичной по отношению к невриту, была полностью устранена.

Та же самая схема ежедневных внутриоболочечных инъекций 50 мг рМВР82-98 была применена к больным рассеянным склерозом с различными типами моносимптоматических рецидивов.

На фиг. 11с представлен профиль анти-МВР у больного с острым псевдоатетозом левой руки, которому были проведены пять ежедневных внутриоболочечных инъекций 50 мгрМВР82-98 (it# 1, it#2, it#3, it#4, it#5) за вторую неделю рецидива. Уровень свободных антител снизился до необнаружимого в течение 4 дней и оставался таковым на 11 день и месяц спустя. Функция левой руки у больного восстановилась настолько, что он опять смог ездить на мотоцикле и играть на гитаре.

У последнего больного из данной группы был приступ острой левосторонней гемиплегии, осложненный хроническим прогрессирующим рассеянным склерозом. Ему было проведено четыре внутриоболочечные инъекции 50 мг рМВР82-98 (it#1, it#2, it#3, it#4, it#5) с интервалом в 2-3 дня. Количество анти-МВР определяли до и 30 мин спустя после каждой инъекции (фиг. 11 d: it#1, it#2, it#3, it# 4) и через 10 дней после первой инъекции. Исходно повышенный уровень свободных антител снизился до необнаружимого в течение 7 дней, после чего больной вернулся по клиническим и биохимическим параметрам в исходное прогрессирующее состояние и вскоре после этого больному было внутривенно введено 400 мг рМВР86-95. После данной инъекции уровень связанных антител оставался сниженным 4 месяца. Однако после последней поясничной пункции, проведенной через 8.5 месяцев после внутривенной инъекции, заболевание вернулось к своему хроническому прогрессирующему течению, как клинически, так и биохимически.

ПРИМЕР 5
Частота и продолжительность введений больным с полисимптоматическими рецидивами
Те же самые МВР пептиды затем вводили больным с полисимптоматическими рецидивами, при которых затронуты различные области центральной нервной системы. В эту группу входили три пациента: один с возвратно-рецидивирующей и два с возвратно-прогрессирующей формами заболевания.

У первой больной был острый полисимптоматический рецидив. В первую неделю рецидива ей было проведено три инъекции 50 мг рМВР86-95 в дни 1,3 и 7 (фиг. 12: it#1, it#2 и it#3). Количество анти-МВР определяли до и 30 минут спустя после каждой инъекции. После этих трех инъекций свободные анти-МВР были подавлены до почти необнаружимых уровней. Произведенный месяц спустя анализ показал возрастание количества свободных анти-МВР и через 1,5 месяца наступил новый рецидив, который был клинически и биохимически подтвержден. В это время больной был проведен второй курс из четырех внутриоболочечных инъекций 50 мг рМВР86-95 в дни 45, 48, 49 и 50 рецидива (it#4, it#5, it#6 и it# 7). Количество анти-МВР определяли до и 30 минут спустя после каждой инъекции и еще три раза в течение последующих двух месяцев. Опять же F анти-МВР были подавлены по меньшей мере на две недели, но у больной опять наступил рецидив, и в это время уровень свободных антител вернулся к исходному дорецидивному значению. Очевидно, необходимо более продолжительное внутриоболочечное введение синтетического пептида для того, чтобы поддерживать уровни F анти-МВР на низких/необнаружимых значениях.

У второго больного был возвратно-прогрессирующий рассеянный склероз (фиг. 13). Когда больной находился в прогрессивной фазе (F=B), ему была проведена внутривенная инъекция 500 мг рМВР86-95 (IV#1). При том, что количества свободных и связанных антител оставались сниженными на протяжении месяца, через 9 недель у больного наступил полисимптоматический клинический рецидив, характеризующийся чрезвычайно повышенным уровнем F анти-МВР. В это время ему были проведены три внутриоболочечные инъекции 50 мг рМВР86-95 (it# 1, it#2 и it#3) в дни 1,3 и 12 рецидива, а количество анти-МВР определяли до 30 мин и 24 ч спустя после первой и третьей инъекций. Обследование через месяц показало, что больной вернулся к исходному клиническому и биохимическому статусу прогрессирующего спастического парапареза. Затем через 2 недели ему была проведена вторая внутривенная инъекция 500 мг рМВР86-95 (IV#2). По сравнению с исходными уровнями его способность стоять и ходить значительно улучшилась.

Последнему больному из данной группы, находящемуся в прогрессивной фазе (F= B)(фиг. 14), была проведена внутривенная инъекция 500 мг рМВР86-95 (IV# 1). Уровень анти-МВР в СЦЖ определяли через 9 дней, затем ежемесячно в течение двух месяцев и спустя 4,5 месяца после (IV#1). После этой инъекции уровни свободных и связанных анти-МВР оставались сниженными 2 месяца; через 4,5 месяца после IV#1 больной стал жаловаться на увеличивающуюся слабость, что было подтверждено клинически и биохимически повышенными уровнями антител, характерными для хронического прогрессирующего заболевания. В течение следующего месяца больному была проведена вторая внутривенная инъекция 500 мг рМВР82-98 (IV# 2). Анализ образца ЦСЖ, взятого перед второй инъекцией, указывал на острый характер рецидива (F>B) и на следующий день у больного развилась острая диплопия из-за левостороннего пареза прямой кишки. В это время больной явно находился в состоянии клинического и биохимического рецидива, который продолжался более 4,5 месяцев и характеризовался утратой равновесия, слабостью в ногах и двоением в глазах. Для того чтобы снизить уровень F анти-МВР, больному было проведено два курса внутриоболочечных инъекций рМВР82-98.

В ходе первого курса, начатого 4-5 месяцев спустя после начала рецидива, больному вводили 50 мг рМВР82-98 ежедневно в течение 5 дней (it#1, it#2, it# 3, it#4 и it#5), а количество анти-МВР, определяемых до и через 30 мин после каждой инъекции, оставалось повышенным. Поскольку рецидив не прекращался и острота состояния больного не снималась, было решено провести второй курс с более высокими дозировками пептида и с большей частотой введений. Больному было проведено по две инъекции в день 100 мг рМВР82-98 в течение двух дней (дни 19 и 20: it#6, it#7, it#8 и it#9). Количество анти-МВР определяли до и через 30 мин после каждой инъекции. После второго курса инъекций F анти-МВР были снижены до пренебрежимых значений и при проверке спустя неделю (день 28) профиль ЦСЖ у данного больного был характерным для медленно прогрессирующего заболевания (F/B анти-МВР=1.0). В это время больному была проведена третья внутривенная инъекция 500 мг рМВР82-98 (IV#3), которая более не снизила образование анти-МВР.

ПРИМЕР 6
Внутривенное введение пептидов МВР для предотвращения последующих рецидивов
Двум больным с возвратно-прогрессирующим рассеянным склерозом с частыми рецидивами проводили внутривенные инъекции рМВР86-95 или рМВР82-98 с тем, чтобы определить, при каком из способов введения удастся предотвратить последующие рецидивы.

У первой больной рецидивы наступали 2-3 раза в год в течение 4 лет, что приводило к постепенной прогрессии спастического парапареза (фиг. 15). Ей были проведены две внутривенные инъекции с интервалом в 6 месяцев, одна - 400 мг рМВР86-95 (IV# 1) и вторая - 400 мг рМВР82-98 (IV#2); клиническое обследование и анализ СЦЖ проводили ежемесячно. На фиг. 15 представлены уровни анти-МВР в течение 9 месяцев (верхняя область в рамке). Первая внутривенная инъекция привела к подавлению синтеза анти-МВР на 2 месяца. На третий месяц после инъекции у данной больной наступил клинический рецидив; к сожалению, образец СЦЖ в этот момент взят не был. В течение последующих 2-3 месяцев, после того как рецидив прекратился и заболевание перешло в хроническую прогрессирующую фазу, больной был проведена вторая внутривенная инъекция (IV#2). Уровень анти-МВР в СЦЖ опять был снижен на 2 месяца, но спустя три месяца после второй инъекции у больной наступил рецидив, связанный со значительным повышением F анти-МВР. Подобно частоте рецидивов. характерной для 4-х предыдущих лет, у данной больной наблюдались 2-3 рецидива в год несмотря на две внутривенные инъекции рМВР86-95 и рМВР82-98.

Вторая больная (фиг. 16), которая переносила от 1 до 4 рецидивов в год в течение 10 лет (верхняя шкала), страдала параплегией и была прикована к инвалидному креслу. В течение одиннадцатого года больная опять перенесла 4 рецидива (верхняя область в рамке), хотя и получала внутриоболочечные и внутривенные инъекции синтетических пептидов МВР. В ходе первого рецидива, после двух внутриоболочечных инъекций 50 мг рМВР86-95 в день 1 и в день 6 (it#1, it#2) уровень F анти-МВР у данной больной значительно понизился; в день 6 ей также была проведена внутривенная инъекция 300 мг рМВР86-95 (IV), что привело к подавлению как В, так и F анти-МВР на последующие три месяца. Через четыре месяца после внутривенной инъекции у данной больной наступил клинический рецидив, который обострялся с течением времени: уровень антител в СЦЖ был резко повышен. Спустя 6,5 месяцев после внутривенных инъекций (IV) больной провели курс из четырех ежедневных инъекций 50 мг рМВР82-98 (it#3, it# 4, it#5 и it#6), которыми также не удалось понизить уровень свободных антител и снять клинический рецидив.

ПРИМЕР 7
Сравнение различных способов введения пептида
На начальных этапах эксперимента синтетические пептиды МВР вводили восьми больным с прогрессирующим хроническим рассеянным склерозом. Больным внутриоболочечно вводили МВР-связывающий пептид МВР(75-95) или контрольный несвязывающий пептид МВР(35-58) в увеличивающихся дозах от 1 до 10 мг в 5 мл физиологического раствора; четырем больным, которым первоначально вводили контрольный несвязывающий пептид (МВР35-58), позже вводили связывающий пептид МВР(75-95).

Введение МВР(75-95) в СЦЖ приводило к временной нейтрализации свободных МВР-специфических антител; эффекта на связанные антитела не наблюдалось. Продолжительность эффекта оценивалась в 1 ч (1 мг пептида), 24 ч (2.5 мг пептида) или 7 дней (5-10 мг пептида). Поскольку эффект внугриоболочечного введения пептида был неполным (уровень В анти-МВР оставался повышенным) и сравнительно непродолжительным, этот способ введения сравнили с внутривенным введением. В отличие от внутриоболочечных инъекций, через месяц после однократной внутривенной инъекции как свободные, так и связанные анти-МВР были необнаружимы и уровни их оставались низкими в течение 3 месяцев, а после бустерной инъекции - на срок до 26 месяцев (фиг. 17). Аналогичные наблюдения были сделаны на сегодня приблизительно над 70-ю больными с хроническим прогрессирующим рассеянным склерозом, которым внутривенно вводили такие МВР-связывающие пептиды, как МВР75-95, МВР86-95 или МВР82-98. Была выбрана доза 500 мг (5 мг/кг веса тела) в 10-50 мл физиологического раствора из-за большего объема крови по сравнению с СЦЖ (фактор 15) и быстрого выведения пептидов из кровотока почками; дозы пептидов, соответствующие введенным внутривенной, внутриоболочечно не вводили, поскольку такой объем не может быть введен в СЦЖ.

Таким образом, можно заключить, что внутриоболочечное введение пептидов в дозах, проверенных на данных больных, приводило к временному "стирающему" эффекту только на F анти-МВР, в отличие от внутривенных инъекций, которые подавляли синтез анти-МВР. Однократная внутривенная инъекция индуцировала продолжительную толерантность.

ПРИМЕР 8
Продолжительность толерантности после внутривенного введения пептида МВР
С учетом полученных результатов была исследована кинетика толерантности к МВР и к настоящему времени получены данные в отношении приблизительно 70 больных, наблюдавшихся в течение 2 лет после многочисленных внутривенных инъекций МВР(75-95), МВР(86-95) или МВР(82-98). Дозы пептида составляли 5-6 мг/кг веса тела (275-500 мг) и вводились внутривенно в 10-50 мл физиологического раствора. До внутривенных введений пептида у всех 13-ти больных отмечены высокие уровни свободных и связанных анти-ИВР антител в СЦЖ (фиг.18, табл. 3). Через месяц после введения пептида МВР-специфические антитела были практически необнаружимы и уровень их оставался низким обычно на протяжении 3-4 месяцев, после чего начинал увеличиваться; у некоторых больных через 8 месяцев этот уровень возвращался к исходному. В срок 6-10 месяцев после (IV# 1) всем больным проводили бустерную инъекцию (IV#2) 275-500 мг (5-6 мг/кг веса тела) рМВР(82-98) в 10 мл физиологического раствора (IV#2). Более длинный пептид, выбранный для второй инъекции, был более растворим и потому мог вводиться в меньшем объеме раствора. В целом, в данной группе уровень анти-МВР в ЦСЖ резко снижался на протяжении периода от 6 недель до 2 месяцев с момента инъекции и оставался необнаружимым продолжительное время (до 26 месяцев). Из всей группы приблизительно 70-ти больных один больной не смог завершить эксперимент из-за легочного тромба и последующего лечения антикоагулянтами, что исключало поясничные пункции, а другой был исключен из опытной группы, поскольку получал внутривенно большие дозы кортикостероидов. Из приблизительно 70-ти больных у 63-х спустя 18-26 месяцев после бустерной инъекции анти-МВР были необнаружимы.

ПРИМЕР 9
Устойчивая толерантность у больных с гаплотипом HLA-DR2
Гаплотипы HLA-DR больных рассеянным склерозом определяли молекулярным типированием геномной ДНК (табл.3). У четырех из одиннадцати больных, участвовавших в эксперименте, отмечено заболевание, связанное с гаплотипом DR2 (DRB1*1501 или DRB1*15021); у всех этих больных отмечены низкие или необнаружимые уровни аутоантител в течение одного года после второй внутривенной инъекции пептида МВР. Пептид МВР связывался HLA-DR2 с высокой аффинностью и был иммунодоминантен для HLA-DR2-рестрицированных МВР-специфических Т-клеток. HLA-DR4 (DRB1*0401) и HLA-DR7 (DRB1*0701) связывали введенный пептид МВР; исследование связывания не было выполнено в отношении молекул DR больного k(M) (DRB1*0407, DRB1*0801). Пептид МВР не связывался HLA-DR3 (DRB1*03011); два пациента, у которых в конце эксперимента отмечены высокие уровни анти-МВР, имели гаплотип DRB1*03011 (табл. 3).

Приведенные результаты показывают, что продолжительность толерантности к МВР зависит от гаплотипа больного. Толерантность может быть более продолжительной, когда толерантны как Т, так и В МВР-специфические клетки.

В табл. 3 приведены гаплотипы 11-ти больных рассеянным склерозом, прошедших обследование через 1 год с момента второй внутривенной инъекции пептида (IV# 2). У всех четырех больных с гаплотипом HLA-DR2 (DRB1*1501 или DRB1*15021) уровень аутоантител сохранялся низким в течение года после (IV# 2).

ПРИМЕР 10
Подкожные инъекции пептида не индуцируют толерантности
Исследовали оптимальный способ введения пептида группе из 33 больных рассеянным склерозом путем подкожных инъекций МВР(82-98) в физиологическом растворе. У 26 больных однократная подкожная инъекция возрастающих количеств (от 1 до 1000 мг) МВР(82-98) не влияла на уровень аутоантител в ЦСЖ (данные не приведены); восьми больным из данной группы была впоследствии проведена внутривенная инъекция пептида и в течение двух месяцев количества аутоантител в СЦЖ оставались необнаружимыми (табл. 4А). У пяти других больных суммарная доза в 900-1000 мг (5•500 мг, ежедневно в течение пяти дней, а затем еще одна подкожная инъекция 400 или 500 мг) приводила лишь к умеренному снижению уровня анти-МВР аутоантител в ЦСЖ (табл. 4В). Для того чтобы проверить не окажется ли другой график введений более эффективным, двум больным были проведены две подкожные инъекции 250 мг МВР(82-98) с интервалом в месяц (табл. 4С). Опять же, уровень аутоантител не изменился. Совокупность приведенных результатов показывает, что только внутривенное введение пептида МВР индуцирует продолжительную толератноность к МВР при использовании тех дох, пептида, которые были применены в настоящем эксперименте.

Совокупность приведенных данных показывает, что только внутривенный способ введения эффективен для индукции толератности к МВР.

В предпочтительные варианты осуществления изобретения могут быть введены модификации, которые не нарушают духа и объема изобретения как они определены в последующей формуле.

Формула изобретения

1. Пептид с формулой формулы Asp Glu Asn Pro Val Val His Phe Phe Lys Asn Ile Val Thr Pro Arg Thr.

2. Фармацевтическая композиция, нейтрализующая или модулирующая образование антимиелинового основного белка, содержащая пептид по п.1 и фармацевтически приемлемый носитель.

3. Способ лечения рассеянного склероза, заключающийся во введении больному эффективного количества пептида по п.1 в смеси с фармацевтически приемлемым носителем.

4. Способ по п. 3, отличающийся тем, что пептид вводят внутривенно, внутриоболочечно или обоими способами.

5. Способ по п. 4, отличающийся тем, что пептид вводят внутривенно в дозе, лежащей в пределах от 1 мг/кг веса тела до 10 мг/кг веса тела.

6. Способ по п.4, отличающийся тем, что пептид вводят внутриоболочечно в дозе, лежащей в пределах от 1 до 100 мг.

7. Способ по п.4, отличающийся тем, что пептид вводят ежедневно в течение четырех или пяти дней.

8. Способ по п.7, отличающийся тем, что спустя примерно одну неделю после первой инъекции вводят дополнительную дозу пептида.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30