К-днк для получения рекомбинантного вируса клещевого энцефалита (tbev)

 

Изобретение относится к генной инженерии. Заявлена к-ДНК для получения рекомбинантного вируса клещевого энцефалита. к-ДНК включает кодирующую и некодирующую последовательности, которые приведены в описании. Кодирующая последовательность может включать перед положением 1 дополнительный G. к-ДНК кодирует аминокислотные последовательности с модификациями и заменами, приведенными в описании. Изобретение позволяет получить вакцины против клещевого энцефалита (TBEV). 7 з.п. ф-лы, 8 ил., 4 табл.

Настоящее изобретение относится к способу получения техникой рекомбинантных ДНК вакцины против вируса клещевого энцефалита (ТВЕ-вируса), способу ее получения, а также лежащим в основе этого получения нуклеиновым кислотам и трансформированным клеткам-хозяевам. В особенности изобретение относится к полноразмерной кДНК, которая кодирует РНК-транскрипт ТВЕ. С помощью предлагаемого согласно изобретению способа можно получать аттенуированные ТВЕ-вирусы, которые пригодны в особенности для производства вакцины.

Вирус клещевого энцефалита (ТВЕ-вирус) является представителем семейства флавивирусов. Это семейство вирусов разделяется на три рода, а именно род пестивирусов, род вирусов гепатита С и род флавивирусов. Понятие "флавивирусы" в настоящем описании используют всегда в качестве синонима для рода, но не для семейства.

Флавивирусы охватывают примерно 70 известных представителей, некоторые из которых являются возбудителями болезней человека. К ним в особенности причисляют вирус желтой лихорадки, вирусы лихорадки Денге (типы 1-4), японский В-вирус (Japan B-virus) и ТВЕ-вирус. В то время как указанные первыми вирусы, а также множество остальных флавивирусов переносятся комарами, переносимые клещами, а именно иксодовыми клещами, ТВЕ-вирусы образуют экологически и эпидемиологически отдельную подгруппу внутри флавивирусов. ТВЕ-вирусы отличаются также по определенным молекулярно-биологическим, генетическим свойствам от других флавивирусов.

Геном флавивирусов представляет собой однонитевую, длиной примерно 11000 нуклеотидов молекулу РНК. Эта молекула плюс-нитевая, т.е. по своей ориентации она соответствует мРНК. С этой молекулы РНК на рибосомах считываются (транслируются) все вирусные протеины. РНК-геном флавивирусов является инфекционным, т.е. вирусная РНК без каких-либо других компонентов вирусной частицы с помощью пригодных методов вводится в инфицируемые клетки; это приводит к продуктивной вирусной инфекции, следовательно, к образованию новой, инфекционной вирусной частицы.

Против ряда вызываемых флавивирусами заболеваний применяются или разрабатываются вакцины. В принципе, можно различать два вида вакцин, а именно живые вакцины и убитые вакцины.

Живые вакцины по своей вирулентности представляют собой ослабленные (= аттенуированные) вирусные штаммы, которые не вызывают никакой или только очень слабую картину болезни (непатогенны), однако индуцируют иммуноответ, защищающий от вирулентного вируса дикого типа. В случае чаще всего используемых до настоящего времени живых вакцин речь идет либо об имеющихся в природе вирусах (например, Vaccinia-вирус), либо о штаммах вирусов, которые изменяют в лаборатории за счет повторяющихся пассирований в различных биологических системах (например, вирусы полиомелита, вирусы желтой лихорадки). В случае флавивирусов живая вакцина против вируса желтой лихорадки применяется уже с 30-х годов. Живые вакцины против 4 типов вируса лихорадки Денге находятся в стадии клинических испытаний.

В случае убитых вакцин речь идет о первоначально вирулентных вирусах, которые выращиваются в пригодных биологических системах и затем инактивируются химическим способом (например, путем обработки формальдегидом). При производстве убитых вакцин существует необходимость работы с большими количествами вирулентных, патогенных вирусов. За счет инактивации могут изменяться структурные свойства вирусных частиц. Это может приводить к менее специфическому и менее эффективному иммуноответу. При применении убитых вакцин отсутствует опасность инфицирования, однако, индуцируется иммуноответ, который защищает также от репликационно-компетентного, вирулентного вируса. Такие убитые вакцины применяют против ТВЕ-вируса и против японского В-вируса (Monath., Т.1990).

В отношении получения вакцины в случае РНК-вирусов нужно принимать во внимание их высокую частоту мутаций. Вследствие высокой частоты мутаций используемый для производства вакцины посевной вирус всегда гетерогенный и также может постоянно изменяться за счет пассирования. Благодаря этому могут изменяться свойства вируса, вследствие чего могут возникать производственно-технологические трудности и проблемы обеспечения техники безопасности. Различные, применяющиеся посевные вакцинные вирусы желтой лихорадки 17D уже обладают значительным различием последовательностей, которые также могут предполагать биологическое различие (Post и др., 1992, Zedger и др., 1992).

Таким образом, оказывается, что при получении вакцин вместо гетерогенного посевного вируса предпочтительно исходить из однородного кДНК-клона. Сверх того, предпочтительно также использовать для приготовления убитой вакцины специфический аттенуированный вирусный штамм.

Без инфекционного кДНК-клона в случае РНК-вирусов аттенуированные штаммы могут быть случайно обнаружены в природе, либо получены в лаборатории путем селекции случайных мутантов за счет повторяющегося пассирования. При этом практически невозможно влиять на молекулярный принцип аттенуирования, его степень и вероятность реверсии к вирулентному дикому типу (последнее представляет собой важнейший фактор безопасности живой вакцины). Как следствие этого, в настоящее время нет никакого штамма ТВЕ-вируса, который пригоден в качестве живой вакцины.

В отношении генно-инженерного изменения и получения различных флавивирусов известно, что трудно или даже невозможно стабильно клонировать кДНК-молекулу со всей информацией генома флавивируса, например в E.coli. При этих работах, кроме того, наблюдают, что происходят спонтанные мутации, которые приводят к тому, что нельзя получить инфекционные РНК. Предполагают, что определенные элементы последовательности для бактерий, в которых должны размножаться кДНК-клоны, токсичны. При этом возникающие проблемы, однако, очень различны: в то время, как для вируса лихорадки Денге типа 4 (Zai и др. , 1991) и японского В-вируса (Sumigoshi и др., 1992) можно найти пригодные векторные системы, чтобы получить полную кДНК-матрицу, эту проблему для вируса желтой лихорадки можно решить только путем клонирования трех отдельных ДНК-фрагментов (Rice и др., 1989). Впрочем, для вируса лихорадки Денге типа 2 и других флавивирусов вплоть до настоящего времени не найдено никаких пригодных векторных систем. Точные причины этих проблем стабильности неизвестны. Поэтому результаты, которые получают при приготовлении инфекционного клона одного определенного флавивируса, нельзя переносить на другие флавивирусы.

В особенности для ТВЕ-вируса до сих пор неизвестно, в какой ориентации и при применении каких ДНК-последовательностей и клеток-хозяев можно генерировать инфекционный клон ТВЕ-вируса.

Задачей настоящего изобретения является получение инфекционного клона в качестве исходного материала для продукции вакцинного вируса.

Понятие "инфекционный клон" здесь обозначает, что геном вируса в форме кДНК с помощью методов генной инженерии вносится в векторную систему, что позволяет осуществлять целевые изменения в этом геноме и за счет соответствующих методов снова получать вирусы с измененными в случае необходимости свойствами. Известно, что в случае комплексных геномов, и в особенности в случае РНК-геномов, при этом преодолевают множество проблем.

Настоящее изобретение впервые позволяет располагать полной нуклеиновой кислотой, которая кодирует инфекционный РНК-транскрипт ТВЕ-вируса и отличается тем, что содержит а) последовательности согласно фиг.5, а также б) последовательности, которые гомологичны до 70% с общей последовательностью фиг.5.

Согласно особому варианту осуществления изобретения эта гомология составляет 80 и предпочтительно 95%.

Последовательность нуклеиновой кислоты согласно фиг.5 представляет собой полную кДНК ТВЕ-вируса штамма Neudörfl. Эта общая последовательность, включая 5'- и 3'-некодирующие нуклеотидные последовательности этого штамма, образует существенную предпосылку для предлагаемого согласно изобретению способа получения инфекционного клона ТВЕ-вируса. Раскрытая до сих пор в предшествующем уровне техники последовательность охватывает лишь частичную последовательность, которая включает нуклеотиды вплоть до 10488. Последовательность, начинающаяся с Poly(А) в положении 10489, является новой и впервые дополняет нуклеотидную последовательность, которая кодирует инфекционный ТВЕ-вирус.

Быстрое развитие методов генной инженерии в последние годы в возрастающей мере позволяет целенаправленно изменять нуклеиновые кислоты. Известные методы целевого генетического изменения описываются для двунитевой ДНК-молекулы. Вирусы с относительно маленькими геномами из двунитевой ДНК, как, например, вирусы полиомиелита, поэтому уже очень быстро можно изменять генетически целенаправленно: геном непосредственно клонируют в пригодной бактериальной векторной системе, изменяют и в измененной форме вносят в клетки-хозяева, что приводит к образованию желательного вируса-мутанта (Shah, 1990).

В противоположность ДНК-вирусам в случае РНК-вирусов необходим путь, требующий существенно больше затрат. Сначала нужно получить двунитевую копию (кДНК) РНК-генома. Эту кДНК затем целиком или в виде фрагментов клонируют в пригодных бактериальных системах, анализируют и целенаправленно изменяют. На этой ДНК затем ин витро или в клетке синтезируется плюс-нитевая РНК-копия, которая обеспечивает образование желательного, целенаправленно измененного вируса. При этом предполагают, что такой инфекционный клон содержит вое генетические элементы, которые необходимы для репликации вируса. Отсутствие одного-единственного нуклеотида или встраивание одного-единственного неправильного (ошибочного) нуклеотида может привести к тому, что не генерируется никакой инфекционный вирус. Впервые на основе представленной на фиг.5 ДНК-последовательности штамма Neudörfl удалось получить инфекционный клон, который позволяет целенаправленно изменять геном ТВЕ-вируса. Это достигают тем, что клонированную кДНК превращают в инфекционную РНК. Этот процесс может происходить либо в клетке, либо ин витро. При этом требуется, чтобы эта стадия транскрипции осуществлялась под контролем пригодной системы промотор/фермент, которая позволяет превращать весь кДНК-клон в РНК. Зачастую применяемые РНК-полимеразы, как, например, SP6, Т3, Т7, различаются в отношении своей способности синтезировать длинные транскрипты (матрицы), они обладают свойством обрывать транскрипцию предпочтительно в различных для каждого фермента сайтах. Также относительно этого до сих пор неизвестно, какой фермент способен транскрибировать кДНК-клон ТВЕ-генома в полную РНК.

Как уже указывалось выше, кДНК можно изменять целенаправленно путем мутаций в ее кодирующей или некодирующей области. Таким образом можно влиять на вирулентность или выход вируса. Согласно изобретению, таким образом, имеются в распоряжении кодирующие ТВЕ-вирус кДНК-последовательности, которые за счет замещения, инсерции или делеции изменяются так, что продуцируется ослабленный ТВЕ-вирус, или благодаря этому влияют на скорость репликации ТВЕ-вируса.

Согласно особенному варианту осуществления становится доступной кДНК, которая отличается мутацией на 5'-конце. 5'-Конец флавивирусов содержит САР-структуру первого нуклеотида, А (Mandl и др., 1989). Такая структура образуется с помощью обычных РНК-полимераз только с плохой эффективностью. Согласно изобретению кДНК согласно фиг.5 изменяется таким образом (фиг.3), что CAP прикрепляется к 5'-концевому G. Таким образом образуется РНК, которая по сравнению с природной вирусной РНК удлинена на один нуклеотид. Это целенаправленное изменение кДНК приводит к тому, что образуется инфекционная РНК с существенно более высокими выходами.

Дальнейшие модификации кодирующей ТВЕ-вирус кДНК можно осуществлять в месте расщепления pr (М). Расщепление pr (М)-протеина до имеющегося в зрелых вирионах М-протеина необходимо для инфекционности ТВЕ-вируса.

Уменьшение эффективности этого расщепления приводит к аттенуированию (ослаблению) вируса.

Другая мутация, которая приводит к пониженной вирулентности ТВЕ-вируса, состоит в удалении сайта гликозилирования, как, например, путем мутации в соответствующем сайте N-гликозилирования Е-протеина.

Следующая мутация состоит в изменении аминокислоты 384 Е-протеина, которая например имеется в мутанте В4 (Holgmann и др., 1990).

Дальнейший аттенуирующий принцип для ТВЕ-вируса состоит во введении одной или нескольких мутаций соответственно последовательности изолята ТВЕ-вируса 263. В случае этого штамма речь идет об естественно существующем ТВЕ-вирусе с аттенуированными свойствами, геномная последовательность которого в указанных в табл. 3 положениях отличается от таковой ТВЕ-вируса штамма Neudörfl.

Благодаря мутациям в кодирующей ТВЕ-вирус кДНК, как это, например, указано выше, можно получать аттенуированный вирус, который пригоден в качестве живой вакцины. За счет комбинации по меньшей мере двух аттенуирующих принципов можно повышать степень аттенуации до желательной величины и повышать во много раз безопасность (вероятность реверсии до вирулентного дикого типа в случае двух независимых аттенуирующих мутаций соответствует продукту с одной вероятностью). Частота реверсии отдельных мутаций аминокислот может сильно ограничиваться за счет использования вырожденности генетического кода, благодаря изменению двух оснований соответствующего кодона.

Таким образом, согласно изобретению получают возможность вместо аттенуированных, случайно изолированных из природного материала вирусных штаммов, целенаправленно влиять на молекулярный принцип аттенуирования, его степень и вероятность реверсии до вирулентного дикого типа. Таким образом впервые получают мутанты ТВЕ-вируса, которые пригодны в качестве живой вакцины.

Сверх того, однако, согласно изобретению также можно целенаправленно влиять на концевые некодирующие (NC) участки ТВЕ-вируса. Эти некодирующие геномные участки вирусной РНК содержат особенно часто важные регуляторные элементы. Эти элементы определяют репликацию вирусного генома, влияют на образование вирусного протеина и во всей вероятности необходимы, чтобы обеспечивать "упаковку" вирусных геномов в вирионы. На биологические свойства вируса, включая его вирулентность и патогенность, таким образом, решающим образом влияют за счет NC-геномных участков. Поэтому для функционирования инфекционного ТВЕ-вируса особенное значение имеет то, что эти NC-геномные участки корректно и генетически стабильно встраиваются в кодирующую ТВЕ-вирус кДНК.

Сравнение некоторых, переносимых комарами флавивирусов показывает, что 5'-, как и 3'-концевые NC-геномные участки, содержат определенные, сохраняющиеся между этими вирусами элементы последовательности. Анализ геномных последовательностей ТВЕ-вирусов в этих областях, однако, показывает большие отклонения от соотношений, которые найдены для переносимых комарами вирусов Эти отклонения можно обобщить следующим образом: 1) 5'-концевые вторичные структуры внутри ТВЕ-вирусов не сохраняются и отличаются от сохраняющихся вторичных структур переносимых комарами вирусов, 2) в то время как переносимые комарами флавивирусы содержат второй стартовый, кодон, таковой отсутствует у ТВЕ-вирусов, 3) в то время как переносимые комарами флавивирусы в 3'-NC-области содержат консервативные виды последовательностей, таковые полностью отсутствуют у ТВЕ-вирусов, 4) потенциальная циркуляризуемая последовательность переносимых комарами флавивирусов не имеет никакой гомологии с ТВЕ-вирусами, 5) 3'-NC-область ТВЕ-вируса в случае близкородственных штаммов сама обладает чрезвычайной изменчивостью, которую обычно не находят в случае никакого другого флавивируса. Так, например, штамм Neudörfl имеет почти вдвое более длинную 3'-NC-область (см. фиг.5а), чем штамм Hypr. Первый содержит элементы последовательности, которые отсутствуют в случае других штаммов и других флавивирусов. Одним из этих элементов является поли(А)-вид (мотив), длина которого может изменяться от 6 остатков А до нескольких сотен. Такого рода структуру никогда не находили в случае переносимых комарами флавивирусов.

Изобретение охватывает впервые полученную область 3'-NC штамма Neudörfl, которая представлена на фиг.5а, а также такие 3'-NC-последовательности, которые гомологичны таковым фиг.5а на 65%, предпочтительно на 80%. Применение этих 3'-NC-последовательностей имеет особое значение для получения вакцин против вариантов и подтипов ТВЕ-вируса.

ТВЕ-вирус, как известно, находится в природе в различных вариантах. В особенности в восточной России и в Китае распространен обозначаемый как дальневосточный подтип ТВЕ-вируса, который связан с появлением значительно более сильной картины болезни, с повышенной заболеваемостью и летальным исходом. С другой стороны, эти подтипы, как многие другие штаммы ТВЕ-вируса, а также другие близкородственные ТВЕ-вирусы (например, Zooping III, турецкий энцефалитный вирус, вирус омской геморрагической лихорадки) имеют более или менее сильные отклонения в их антигенных структурах от таковых штамма Neudörfl. Для оптимального защитного действия, однако, антигенные свойства вакцины должны по-возможности совпадать с таковыми циркулирующих в соответствующем регионе вирусов. Так как эти штаммы, однако, обладают частично различающимися свойствами вирулентности и могут значительно отличаться друг от друга в строении своей 3'-NC-области, проблематично получение для каждого из этих штаммов аттенуированных вакцин на основе специфических пригодных инфекционных клонов.

Благодаря изобретению можно комбинировать последовательности, которые кодируют протеины различных штаммов, подтипов или близкородственных ТВЕ-вирусов с 3'-NC-областью штамма Neudörfl согласно фиг.5а или со слегка измененной по сравнению с ней последовательностью. Таким образом удается получать аттенуированные вакцины с желательными антигенными свойствами. Изобретение охватывает, таким образом, кодирующие инфекционный ТВЕ-вирус нуклеиновые кислоты, которые наряду с кодирующей последовательностью любого ТВЕ-штамма или подтипа включают 3'-некодирующую последовательность согласно фиг.5а.

Кроме того, согласно изобретению также должны охватываться кодирующие инфекционный ТВЕ-вирус нуклеиновые кислоты, которые состоят из кодирующей последовательности согласно фиг.5 и 3'-некодирующей последовательности родственного или другого ТВЕ-вируса или флавивируса. Особенно предпочтительны такие конструкции, которые включают кодирующую ТВЕ-вирус последовательность согласно фиг. 5 и 3'-некодирующую последовательность ТВЕ-вирусного штамма Hypr.

Изобретение включает все инфекционные клоны ТВЕ-вируса, которые производятся в качестве РНК-транскрипта из вышеуказанных последовательностей.

Далее, изобретение охватывает такие кДНК-конструкции, которые за счет встраивания кодирующей иммуномодулятор нуклеотидной последовательности приводят к инфекционному клону с более эффективным иммуноответом. С точки зрения безопасности, организации и стоимости производства желательно, чтобы вакцина индуцировала пролонгированный и широкий иммуноответ. В случае многих используемых в настоящее время вакцин необходимы частые повторные прививки, и иммунизацию против различных вирусов нельзя осуществлять за счет одной-единственной вакцины. В 3'-NC-область можно вводить дополнительную генетическую информацию, благодаря чему можно модулировать или стимулировать иммуноответ. Это также возможно тогда, когда часть 3'-NC-области заменяют соответствующими, кодирующими иммуномодулятор последовательностями. Такие кодирующие иммуномодулятор последовательности можно выбирать из ДНК-последовательностей, которые кодируют интерлейкины, дифтерийный токсин, холерный токсин, чувствительный к высоким температурам E.coli. токсин и коклюшный токсин. Таким образом можно повышать эффективность вакцины и/или достигать более продолжительно действующего иммуноответа, соответственно расширять диапазон иммуноответа (например, против нескольких вариантов ТВЕ-вируса).

Получение предлагаемого согласно изобретению инфекционного ТВЕ-вирусного клона подробнее поясняется благодаря нижеследующему описанию, а также примерам осуществления и следующим за ними чертежам и таблицам.

На фиг.1 представлена карта векторной плазмиды рВR 322 с соответствующими для описанных клонов сайтами рестрикции.

На фиг.2 представлена карта клона Т 7-2 с соответствующими сайтами рестрикции.

На фиг. 3 представлены нуклеотидные последовательности 5'-и 3'- концов клонов Т 7-2, NK-4, 3ND-I и 3 НА.

На фиг. 4 представлена карта клона 3 ND-I с соответствующими сайтами рестрикции.

На фиг.5 (5-1)-(5-13) представлена двунитевая полноценная кДНК-последовательность генома ТВЕ-вирусного штамма Neudörfl, включая 3'-некодирующую последовательность, которая находится в клонах 3 ND-I и NK-4 с поли(А)-длиной из 49 нуклеотидов. Стоп-кодон, который терминирует открытые рамки считывания, подчеркнут.

На фиг.5а воспроизводится 3'-некодирующая последовательность ТВЕ-вирусного штамма Neudörfl.

На фиг.6 представлена карта клона NK-4 с соответствующими сайтами рестрикции.

На фиг.7 представлена карта клона 3 НА с соответствующими сайтами рестрикции.

На фиг. 8 представлено сравнение нейровирулентности и нейроинвазивности между ТВЕ-вирусным штаммом Neudörfl и мутантом RВ 4.

Табл. 1 представляет список используемых для получения кДНК из ТВЕ-вирусной РНК и для инсерции олигонуклеотидных праймеров и их положение в ТВЕ-вирусной нуклеотидной последовательности соответственно фиг.5.

Табл. 2 показывает различие последовательностей между полученным инфекционным клоном ТВЕ-вируса и wt-последовательностью ТВЕ-вирусного штамма Neudörfl. Путем секвенирования кДНК инфекционного клона ТВЕ-вируса и wt - ДНК-последовательности штамма Neudörfl можно идентифицировать некоторые изменения в последовательностях, которые появляются при приготовлении инфекционного клона (IK).

Табл. 3 доказывает различие последовательностей между ТВЕ-вирусным штаммом Neudörfl и аттенуированным природным изолятом 263.

Табл. 4 показывает еще раз в наглядной форме модификации и их положение, которые могут применяться согласно изобретению, чтобы получить аттенуированный штамм.

Предлагаемое согласно изобретению получение ТВЕ-вируса с помощью инфекционного TBЕ-вирусного клона можно осуществлять с помощью следующих стадий способа: а) ин витро получение РНК-транскрипта из рекомбинантной РНК-конструкции, которая включает ДНК согласно фиг.5,
б) трансфекция клеток-хозяев с помощью полученного в п. а) РНК-транскрипта и
в) получение инфекционной вирусной частицы.

Альтернативно транскрипцию РНК можно осуществлять также ин виво (следовательно, в клетках-хозяевах);
а) трансфекция клеток-хозяев с помощью ДНК-конструкции, которая включает ДНК фиг.5, и
б) получение инфекционной вирусной частицы.

В вышеуказанном способе для трансформации, соответственно трансфекции клеток-хозяев используют ДНК-конструкцию, которая наряду с кодирующей ТВЕ-вирус ДНК-последовательностью содержит векторную систему, а также промотор. Пригодные промоторы выбирают из прокариотических промоторов SР 6, Т 3 и Т 7 или из эукариотических промоторов CMV, RSV, ss-актина, SV4 или адено-2.

Если нужно получить измененный в своей вирулентности ТВЕ-вирусный клон или нужно улучшить выход инфекционного вируса за счет модификации ТВЕ-вирусного генома, необходимо исходить, как указано выше, из модифицированной ДНК. Соответствующие стадии получения ТВЕ-вируса с помощью инфекционного клона тогда охватывают либо
а) ин виво получение РНК-транскрипта рекомбинантной модифицированной ДНК-конструкции,
б) трансфекцию клеток-хозяев с помощью вирусного РНК-транскрипта и
в) получение инфекционной модифицированной вирусной частицы, либо
а1) трансфекцию клетки-хозяина с помощью рекомбинантной модифицированной ДНК-конструкции и
б1) получение инфекционной модифицированной вирусной частицы.

Вышеприведенные альтернативные способы получения ТВЕ-вируса с помощью инфекционного ТВЕ-вирусного клона осуществляют через трансформированные или трансфецированные прокариотические или эукариотические клетки-хозяева, которые также должны охватываться изобретением. В качестве особенно предпочтительных клеток-хозяев пригодны Е.coli, vero-, CНО- или ВНК-клетки.

Настоящее изобретение, кроме того, охватывает приготовление вакцины против клещевого энцефалита, которая содержит рекомбинантно полученный ТВЕ-вирус вместе с фармацевтически приемлемым носителем и в случае необходимости иммуномодулятором.

Если нужно приготовить убитую вакцину, то исходят из инфекционного ТВЕ-вируса, который, как описано выше, инактивируют. Предпочтительно исходят из аттенуированного ТВЕ-вируса. Так, например, с помощью предлагаемого согласно изобретению инфекционного клона можно получать аттенуированный штамм, который можно использовать в качестве посевного вируса для продуцирования убитой вакцины. Такой посевной вирус с ослабленной патогенностью уменьшает опасность, которая связана с производством убитых вакцин. Как указывалось выше, при этом желательно чтобы используемый вирусный штамм по-возможности эффективно размножался в соответствующих культурах клеток, с целью достижения повышения выхода вируса. Повышенный выход согласно изобретению получают в случае необходимости за счет введения мутаций в 3'-некодирующую область согласно фиг.5а. За счет одновременной мутации в других местах генома можно получать штаммы, которые при равных стоимостях производства приводят к более высоким выходам, однако ухудшены по своей вирулентности по сравнению со штаммом Neudörfl.

Приготовление вакцины осуществляют известными специалисту способами. Вакцинная доза содержит безопасное и иммунологически эффективное количество рекомбинантного вируса и фармацевтически приемлемый носитель, а также в случае необходимости иммуномодулятор.

Для приготовления живой вакцины особенно предпочтительно исходить из аттенуированного ТВЕ-вируса. При этом доза предпочтительно составляет 1-10000 инфекционных единиц для взрослого, особенно предпочтительно 10-100 инфекционных единиц.

Эту прививку можно осуществлять не только с помощью производимого согласно изобретению нуклеиновых кислот вируса, но и также путем прямого введения самих нуклеиновых кислот.

При этом клетки подвергнутого вакцинации организма продуцируют из введенных нуклеиновых кислот аттенуированные вирусы, которые вызывают иммуноответ. Прямое применение предлагаемых согласно изобретению инфекционных нуклеиновых кислот, таким образом, имеет большое преимущество, состоящее в том, что для приготовления вакцины, в противоположность прежним живым вакцинам, не нужно осуществлять необходимое размножение вируса, например, в системах культур клеток. Сверх того, благодаря этому решаются проблемы обычных живых вакцин, как, например, устойчивость при хранении, безопасность производства и чистота.

Согласно изобретению предусматривается создание вакцины для парентерального введения, в особенности для внутримышечного введения. Наряду с этим, однако, также можно готовить вакцину в виде орально вводимой формы.

Изобретение поясняется подробнее, руководствуясь следующими примерами.

Пример 1. Получение кДНК.

ТВЕ-Вирус выращивают согласно уже ранее описанному методу (Heinz и Kunz, 1981) в культурах фибробластов куриных эмбрионов и получают очищенным из надосадочной жидкости. Эта очистка охватывает по существу осаждение вируса путем ультрацентрифугирования и затем двукратное разделение путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы.

Из очищенных вирусных препаратов затем получают вирусную геномную ДНК путем двукратной экстракции с помощью фенола и хлороформа и осаждают этанолом в присутствии R Nase-ингибитора (человеческий плацентарный РНК sin, Promega). Количество и целостность полученной таким образом РНК определяют путем электрофореза на денатурирующих глиоксаль-агароза-гелях, которые окрашены с помощью акридинового оранжевого (McMaster и Carmichael, 1977). Примерно 1 мкг такой РНК затем используют для синтеза специфической кДНК.

Двунитевую кДНК синтезируют по методу Gubler и Hoffman (1983) при применении содержащихся в "наборе для синтеза кДНК" (кат. 1013882) фирмы Boehringer-Mannheim реагентов. В качестве праймера для синтеза кДНК служат либо гексануклеотиды со случайной последовательностью, либо специфические олигонуклеотиды чаще всего длиной 20 оснований (например, Т 36, Т 45, Т 61, H01, см. табл. 1, которые синтезируются соответственно опубликованной Mandl и др. (1988 и 1989) последовательности ТВЕ-вирусного прототипа штамма Neudörfl (Medprobe®, Осло, Норвегия). Полученную кДНК дополнительно контролируют на 1%-ном агарозном геле и либо прямо клонируют в бактериальной плазмиде (см. ниже), либо при разбавлениях 1:100, 1:1000 или 1:10000 используют в качестве исходного материала для получения специфических фрагментов с помощью полимеразной цепной реакции (PCR). Для РСR применяют ранее описанные условия (Mandl и др., 1989). Правда, для получения длинных (1000-4500 пар оснований) PCR-фрагментов время инкубации при 68^oC, в течение которого происходит ферментативный ДНК-синтез, удлиняют вплоть до 7 минут. Используемые для PCR праймеры представляют собой синтетические олигонуклеотиды чаще всего длиной 20 оснований (Medprobe®) и используются в концентрации 100 нг/мл. Для специфической конструкции соответствующих концам вирусного генома кДНК-молекул и для специфического мутагенеза (см. ниже) также применяют более длинные олигонуклеотиды (длиной вплоть до 51 основания, см. табл. 1), которые, кроме соответствующей вирусному геному последовательности, содержат также другие элементы последовательности (сайты рестрикции, промоторы, ошибочные спаривания для мутагенеза). Эти праймеры используют в концентрациях вплоть до 1 мкг/мл при PCR.

Пример 2. Клонирование кДНК.

Двунитевую кДНК разрезают с помощью рестрикционных ферментов, сайты рестрикции в последовательности ТВЕ-вируса известны на основании опубликованных геномных последовательностей (Mandl и др., 1988, 1989), и клонируют в плазмиде рВR 322 (фиг. 1). Для этой цели 100 нг pBR 322 (New England Biolabs) разрезают с помощью того же самого реcтрикционного фермента, если необходимо, соответствующий фрагмент после электрофореза на 1% агарозном геле (BioRad) выделяют путем электроэлюирования (электроэлюатор фирмы IВI) и смешивают с кДНК. Смесь очищают путем экстракций фенолом и хлороформом, осаждают метанолом и в объеме 20-30 мкл лигирующего буфера (Stratagene) вместе с 2 мкл Т4 ДНК-лигазы (Stratagene) инкубируют при 16^oC. Затем лигированную смесь нагревают в течение 5 минут при 65^oС, чтобы инактивировать фермент, и используют 2 мкл 5-20-кратных разбавлений для трансформации Е.coli бактерий (штамм НВ 101). Трансформацию осуществляют либо по методу "теплового удара" (Hitzeschockmethode) (Maniatis и др., 1962) при применении компетентных бактерий (Epicurian E.coli, фирмы Stratagene) или путем электропорации с помощью прибора GenePulser (Biorad). Рекомбинантные колонии клеток выращивают, используя доступные стандартные лабораторные методы, и выделяют плазмидную ДНК (Maniatis и др., 1982).

Вышеописанные методы прямого клонирования кДНК, например, применяют для того, чтобы получить длиной 3797 пар оснований (п.о.) кДНК-фрагмент (от Pst I 3021 до Pst I 6818), вставленный в один Pst I сайт pBR 322 (клон Pst I, см. ниже). Преимущество этого метода состоит в том, что таким образом клонированные кДНК-фрагменты, как правило, не обнаруживают никаких погрешностей в нуклеотидной последовательности, как это можно зачастую наблюдать при применении PCR. Однако с помощью этого метода можно клонировать не все области генома ТВЕ-вируса, соответствующие кДНК-фрагментам. В особенности получение кДНК-фрагментов, которые соответствуют концам вирусного генома, требует использования PCR. Фрагменты, которые получают с помощью PCR, затем по такому методу, как описанный выше, клонируют или используют при PCR олигонуклеотидные праймеры, которые на своих 5'-концах имеют места разреза для рестрикционных ферментов, которые затем можно применять при клонировании.

Пример 3. Характеристика и секвенирование клонированной кДНК.

Каждый, клонированный в бактериальной плазмиде кДНК-фрагмент точно исследуют в отношении его длины и ориентации в плазмиде, возможного наличия делеций или инсерций или появившихся за счет рекомбинации изменений. Для этой цели несколько мкг плазмидной ДНК из 2-3 мл культур соответствующей E. coli HB 101 колонии очищают (Magic Mini Prep System® фирма Promega) и переваривают с помощью различных рестрикционных ферментов. Разделенные затем на 1-2% агарозном геле фрагменты дают специфические полосы (Bandenmuster), благодаря которым сначала грубо можно охарактеризовывать кДНК-фрагменты. Из тех плазмид, которые выбирают на основании этих анализов, 1-2 мг готовят в высокоочищенной форме (очистка в градиенте CsCl, Maniatis и др., 1962). Примерно 1 мкг таких плазмидных препаратов затем используют для отдельной реакции секвенирования. Секвенирование осуществляют при применении маркированных флуоресцентным красителем дидезокситерминаторов (АВI, Перкин Элмер) и автоматического секвенатора 373А фирмы АВI (теперь Перкин Элмер) при использовании реагентов этой фирмы и указанных изготовителем реакционных условий для секвенирования двунитевых ДНК. В качестве праймеров в реакциях для расшифровки последовательностей (Sequenzreaktionen) служит коллекция примерно из 100 20-мерных олигонуклеотидов (Medprobe® Осло, Норвегия), последовательности дополнены на расстояниях не более чем 400 нуклеотидов до плюс- и минус-нити ТВЕ-вирусного штамма Neudörfl. При применении этих праймеров нуклеотидную последовательность можно анализировать в любом месте генома в обеих ориентациях. В принципе, для проводимых далее работ до клонированию используют только фрагменты, последовательность которых полностью подтверждена. Все обусловленные РСR мутации, которые приводят к изменениям аминокислотной последовательности, устраняют согласно стандартным методикам (Maniatis и др. , 1982) путем замены рестрикционных фрагментов безукоризненными фрагментами из других клонов, которые получают либо путем РСR, либо путем прямого клонирования кДНК. Последовательности таких исправленных клонов снова анализируют путем полного секвенирования.

Компьютерные обработки данных по расшифровке последовательностей осуществляют с помощью Microgenie - (Бекман) и PcGene- (Intellegenetics) блоков программного обеспечения.

Пример 4. Конструкция и описание плазмиды Т 7-2.

Плазмида Т 7-2 (фиг.2) содержит кДНК 5'-концевой области ТВЕ-вирусного штамма Neudörfl, встроенную в вектор pBR 322 (фиг.1). В cайты рестрикции СIаI (23) и SaI I (651) pBR 322 встраивают ДНК-фрагмент, кодирующий ТВЕ-вирусные последовательности. Этот фрагмент охватывает 5'-конец (нуклеотидное положение I) вплоть до имеющегося только однократно в нативной ТВЕ-последовательнооти сайта СIаI в положении 3154. Перед 5'-концом находится другой нуклеотид (G), который отсутствует в нативной последовательности ТВЕ-вируса, а также Т 7 промоторная последовательность и сайт рестрикции SaI I, с помощью которого фрагмент лигируют в вектор. Точная нуклеотидная последовательность 5'-конца и лежащие в ее основе последовательности представлены на фиг. 3. Секвенирование показывает, что по сравнению с нативной последовательностью ТВЕ-вирусного штамма Neudörfl плазмида Т 7-2 имеет два нуклеотидных изменения (табл. 2):
1) спонтанную мутацию в положении 930 (Т-->С), которая соответствует естественно имеющейся изменчивости применяемого в качестве исходного материала вирусного препарата,
2) спонтанную мутацию в положении 3147 (С-->Т), которая вводится специфически, чтобы нарушить NheI сайт в положении 3142.

Получение T 7-2 осуществляют путем следующих стадий конструирования.

Сначала готовят кДНК-фрагмент, как описано в примере 1, с помощью РСR с праймерами Т01 и Т45 (табл. 1) и клонируют в pBR 322, разрезанной с помощью SaI I и СIаI (см. фиг.1). Полученный клон содержит кДНК, точно соответствующую последовательности ТВЕ-вирусного штамма Neudörfl (фиг.5) с нуклеотидами 1-3154 за исключением единственной спонтанной мутации в положении 930 (табл. 2). Этот фрагмент разрезают с помощью NheI (3142) и СIаI (3154) и полученный фрагмент, который состоит из 9 пар оснований и двух выступов длиной 4 и 2 нуклеотида (фиг. 5), заменяют путем вставки, образованной с помощью олигонуклеотидов Т 77 и Т 78 (табл. 1). Благодаря этому вводят мутацию в положение 3147. Для того чтобы ввести дополнительный G-нуклеотид, а также Т 7 промоторную последовательноси в 5'-конец некодирующей ТВЕ-вирусной последовательность, фрагмент концевого, введенного благодаря праймеру Т01 сайта SaII вплоть до MIu I-сайта (положение 208) заменяют на РСR-фрагмент, который получают с помощью праймеров Т 83 (гибридизирован за сайтом MIu I, см. фиг. 5) и Т 84 (содержит Т 7 - промоторную последовательность, перед которой место разреза SaI I и после которой дополнительный G, за которым следуют 20 5'-терминальных нуклеотидов ТВЕ-последовательности, см. табл. 1), и получают плазмиду Т 7-2 вышеописанного вида.

Пример 5. Конструкция и описание плазмиды 3ND-I.

Плазмида 3ND-I содержит кДНК 3'-концевой области (нуклеотид 3017-11141) генома ТВЕ-вируса штамма Neudörfl, вставленного в вектор pBR 322. В рВR 322, разрезанную с помощью Pst I (3607) и Ааt II (4284), вставляют кДНК-фрагмент ТВЕ-вируса, который включает нативные ТВЕ-последовательности от сайта рестрикции Pst I (положение 3017) вплоть до 3'-конца (положение 11141). Два 3'-концевых нуклеотида (CТ, фиг.3) представляют собой часть введенного сайта NheI, за которым следует сайт Ааt II, с помощью которых фрагмент вводят путем лигирования в вектор. Как указывается далее, рестрикция с помощью и последующее частичное дополнение получающегося 5'-выступа позволяет получать точно соответствующий последовательности ТВЕ-вируса 3'-конец. Точная нуклеотидная последовательность 3'-конца и соседние области представлены на фиг. 3. По сравнению с нативной последовательностью ТВЕ-вируса штамма Neudörfl 3ND-I имеет 6 спонтанных мутаций, которые обобщены в табл. 2. Эти мутации вызываются Таq-полимеразой при PCR.

Клон 3ND-I содержит полную 3'-некодирующую последовательность, которая соответствует ТВЕ-вирусу штамма Neudörfl. Такая последовательность до сих пор была неизвестна. Этот участок последовательности клона 3ND-I полностью представлен на фиг. 5 и 5а. Длина внутренней поли (А)-последовательности в нативном вирусе по-видимому изменчива (Mandl и др., 1991) и в случае клона 3ND-I составляет 49 нуклеотидов.

Получение плазмиды 3ND-I осуществляют путем следующих стадий конструирования.

Путем прямого клонирования кДНК (описано в примере 2) получают клон Рst I, в случае которого простирающийся от положения 3021 вплоть до положения 6818 ТВЕ-вируоа фрагмент вставляют в один Pst I-сайт вектора pBR 322. Ориентация вставки противоположна таковой резистентного к ампициллину гена pBR 322. Из этого клона удаляют МIu I (6446 в ТВЕ) /Ааt II (4284 в pВR 322) - фрагмент и заменяют на получаемый с помощью праймеров Т 16 и Т 61 (табл. 1) РСR-фрагмент. Для этой цели РСR-фрагмент длиной 4500 пар оснований переваривают с помощью МIu I (положение 6446 ТВЕ-последовательности, см. фиг.5) и Ааt II (содержится в праймере Т 61) и лигируют в соответствующие места разреза. Благодаря этому специфическая для ТВЕ-вируса вставка удлиняется вплоть до поли(А)-последовательности (начинающейся с положения 10489). кДНК, которая соответствует 3'-некодирующей области штамма Neudörfl, получают с помощью праймера Н01 (табл. 1) и амплифицируют посредством РСR с помощью праймеров Т 27 и Н05 (табл. 1) и клонируют в PBR 322 между сайтами рестрикции Dra I (3230) и Ааt II (4284) (см. фиг.1). Из таким образом полученных клонов выбирают плазмиду Dra - 7, содержащую вставку с ТВЕ-вирусной последовательностью от нуклеотидной позиции 10482 вплоть до 3'-конца (позиция 11142), которая содержит поли(А)-последовательность длиной 49 нуклеотидов и не имеет никакого отличия в нуклеотидах от нативной последовательности ТВЕ-вируса штамма Neudörfl. Фрагмент от Dra - сайта (10484 в ТВЕ-вирусном геноме) вплоть до Ааt II - места разреза за 3'-концом (см. фиг.3) присоединяют к вышеописанной конструкции, чтобы получить клон 3ND-I вышеуказанного вида.

Пример 6. Конструкция и описание плазмиды NK-4.

Плазмида NK-4 содержит полноценную кДНК-последовательность ТВЕ-вируса штамма Neudörfl, встроенную в вектор pBR 322 между сайтами рестрикции SaI I (651) и Ааt II (4284). 5'- и 3'-конец соответствуют таковым клонов Т 7-2, соответственно 3ND-I (фиг.3). 3'-Некодирующая последовательность соответствует описанной в клоне 3ND-I и представлена на фиг.5а. В целом восемь спонтанных мутаций, по сравнению с нативной последовательностью ТВЕ-вируса штамма Neudörfl, соответствуют таковым вышеописанных плазмид (табл. 2).

Для получения плазмиды NK-4 выделяют СIаI (3154) - Ааt II 3'-концевой фрагмент из 3ND-I и лигируют в плазмиду Т 7-2, разрезанную с помощью CIaI и Ааt II. Таким образом, образовавшаяся плазмида имеет величину 1489 к.б. (тысяч пар оснований, килобаз) и может вводиться в Е.coli НВ 101 - клетки только путем электропорации. Рекомбинантные клоны размножаются только плохо и содержат плазмиду NK-4 в уменьшенном, по сравнению с PBR 322 по меньшей мере в 100 раз, число копий.

Пример 7. Конструкция и описание плазмиды 3НА.

Плазмида 3НА (фиг. 7) содержит кДНК, которая соответствует 3'-концевой области гекома ТВЕ-вируса штамма Hypr. Вставка начинается с нуклеотида 10002 ТВЕ-вируса, охватывает часть гена, кодирующего NS 5-протеин, а также всю 3'-некодирующую последовательность ТВЕ-вируса штамма Hypr вплоть до 3'-конца в положении 10835. Как и в случае клонов 3ND-I и NK-4, непосредственно у 3'-конца расположен сайт рестрикции NheI. К нему примыкает сайт рестрикции BamHI, который вводится также, как и следующий BamHI - сайт, на другом конце фрагмента, чтобы его клонировать в соответствующем сайте рестрикции вектора pВR 322 в положении 375. Точная нуклеотидная последовательность 3'-конца и окружающие последовательности представлены на фиг.3
Для получения плазмиды 3НА получают кДНК геномной РНК ТВЕ-вируса штамма Hypr при применении праймера Н01 (табл. 1) и соответствующий фрагмент амплифицируют посредством РCR с помощью праймеров Н11 и Н12 (табл. 1). РСR-Праймеры образуют на своих 5'-концах ВаmHI - сайты рестрикции, которые служат для клонирования сегмента в BamHI-сайте pBR 322. 5'-Концевой сайт BamHI претерпевает в процессе клонирования делецию основания и поэтому в плазмиде 3НА нет функциональной последовательности узнавания, следовательно, BamHI не разрезается. (Соответствующий сайт рестрикции представлен на фиг.7 в скобках).

Пример 8. Ин витро транскрипция РНК.

Те плазмиды, которые содержат Т7-промоторную последовательность (NK-4 и Т7-2), соответственно продукты лигирования этих плазмид с другими (см. ниже), при применении РНК, которая соответствует полному геному ТВЕ-вируса, можно получать посредством ин витро транскрипции. Транскрипцию осуществляют с помощью очищенной в градиенте CsCl ДНК и с помощью содержащихся в MEGA scrip Т 7 - наборе® (Ambion, Техас, США) реагентов по существу в указанных изготовителем условиях. Время инкубации при 37^oС, однако, увеличивают до 3 часов и не проводят последующей за РНК-синтезом обработки с помощью DNAse I в типичных экспериментах.

Кроме того, концентрацию нуклеотида GTP в тех реакционных смесях, в которых используют m7G (5')ррр (5')G Cap - аналог (Амбион), уменьшают до одной пятой. В реакционном объеме 20 мкл содержится примерно 1 мкг ДНК. Полученную РНК непосредственно применяют далее. Анализ аликвоты таких РНК-продуктов на агарозных гелях (McMaster и Carmichael, 1977) показывает, что в таких реакционных смесях 1 мкг ДНК дает примерно 10 мкг РНК, размер которой соответствует таковому вирусного генома.

Пример 9. Трансфекция РНК в эукариотных клетках и анализ размножения вируса.

ВНК-Клетки культивируют согласно доступной лабораторной практике в 77 см²-склянках и почти конфлюентные участки клеток отслаивают с помощью двух аликвот по 6 мл раствора трипсин-ЭДТК (Gibco). Клетки снова суспендируют в 10 мл питательной среды и в пробирках Falcon емкостью 50 мл осаждают путем центрифугирования в центрифуге Sigma 4K10 (800 об/мин, 7 минут, 20^oC). Осадок клеток после центрифугирования затем дважды суспендируют в холодном (4^oС), не содержащем РНКазу РВS (Gibco) и вторично осаждают, как описано выше. После этого осадок снова суспендируют в 5 мл РВS и в виде аликвот по 0,8 мл (соответственно примерно •10⁶ клеток) переносят в кюветы размером 0,4 см для электропорации (BioRad). РНК, которые выделяются из вирусных препаратов или которые получаются путем Т 7-ин витро-транскрипции, вносят прямо пипеткой в кюветы и осторожно смешивают с суспензией клеток. Используемые количества РНК составляют от нескольких пг РНК до нескольких мг
РНК. Затем кюветы помещают в прибор Gene Pulser фирмы BioRad и осуществляют электропорацию со следующими параметрами: напряжение 1,5 кВ, мощность 25 μF, никакого использования "дополнительного емкостного сопротивления", установление регулятора импульса на "бесконечность". При этих условиях в виде константы времени обычно получают 0,9. Спустя 10 секунд после первого импульса тока осуществляют второй и затем кювету оставляют стоять в течение 10 минут при комнатной температуре. Лишь затем клетки высевают в новые склянки с культурой клеток и культивируют ближайший день в среде, которая содержит 5% фетальной телячьей сыворотки. Как только клетки становятся конфлюентными, концентрацию сыворотки уменьшают до 1%.

Для повторного контролирования размножения вируса ежедневно отбирают аликвоты по 50 мкл культуральной среды и замораживают при -20^oС. С помощью 4-фазного метода ELISA (Heinz и др., 1986) определяют ТВЕ-вирус в надосадочных жидкостях культуры клеток.

Пример 10. Получение ТВЕ-вируса штамма Neudörfl при использовании рекомбинантной кДНК.

ТВЕ-Вирус штамма Neudörfl может генерироваться описанными рекомбинантными плазмидами двумя различными путями.

1. 1 мкг NK-I линеаризируют с помощью 5 ед. рестрикционного фермента NheI и очищают путем экстракции фенолом/хлороформом и осаждают этанолом. ДНК затем растворяют в реакционном буфере Кленова (New England Biolabs) и в присутствии нуклеотидов dСТР и dТТР (Boehringer - Mannheim) инкубируют в течение 15 минут при 37^oС с ферментом Кленова (New England Biolabs) в реакционном объеме в целом 30 мкл. Продукт реакции снова очищают, как описано выше, и затем используют в реакции транскрипции РНК.

2. Несколько мкг 3ND-I, как описано выше, разрезают с помощью NheI и 5'-выступ дополняют частично за счет реакции по Кленову. После этого плазмиду разрезают с помощью СIаI и примерно длиной 8000 нуклеотидов специфический для ТВЕ фрагмент на 0,3% SeaKem Gold агарозе (FMC) отделяют от других продуктов реакции и очищают путем электроэлюирования. Затем аликвоту этого препарата анализируют для определения количества на агарозном геле. 500 нг Т 7-2 линеаризируют с помощью CIaI и объединяют примерно с 1-2 мкг очищенного 3ND-I-фрагмента. Смесь очищают и лигируют в 30 мкл объема с Т 4 -ДНК-лигазы (Stratagene) в течение ночи при 16^oC. Лигированную смесь затем инактивируют при 65^oC в течение 5 минут и снова очищают и используют для ин витро реакции РНК-транскрипции.

РНК, которую получают одним из этих обоих методов, используют для трансформации ВНК-клеток (электропорация) и наблюдают за размножением вируса с помощью 4-фазного метода ELISA в надосадочной культуре клеток. Антигенную структуру полученного таким образом рекомбинантного вируса анализируют с помощью некоторого числа моноклональных антител, которые направлены против протеина оболочки ТВЕ-вируса (Heinz и др., 1963, Guirakhoo и др., 1989), и она полностью соответствует таковой нативного ТВЕ-вируса штамма Neudörfl.
Специфическую (удельную) инфекционность полученной этими методами из NK-4 РНК сравнивают с таковой, выделенной из вирусного препарата РНК. Для обоих РНК-препаратов в различных экспериментах эта инфекционность составляет 5-50 пкг РНК на инфекционную единицу (при электропорации ВНК-клеток, как описано). Обработка реакционной смеси после транскрипции с помощью DNAse не оказывает никакого влияния на специфическую (удельную) инфекционность РНК. РНК, которую получают без САР-аналога, обладает в 100 раз меньшей специфической (удельной) инфекционностью. Если плазмиду обрабатывают не с помощью NheI и последующей инкубации по Кленову, а разрезают с помощью Ааt II, то получают примерно в 10 раз пониженную специфическую инфекционность. Правда, при этом остается неясным, идентичен ли 3'-конец генома рекомбинантного вируса с таковым нативного вируса и содержит ли он дополнительные нуклеотиды, так как некоторые нуклеотиды Ааt II-сайта находятся после NheI-сайта (см. фиг.3).

Пример 11. Получение TBE-вируса штамма Neudörfl, который содержит 3'-конец другого штамма (штамм Hypr).

Несколько мкг 3НА разрезают с помощью NheI (получают 2 фрагмента: 4210 п.o., 980 п.о.) и инкубируют с ферментом Кленова, как описано для NK-4. Плазмиду переваривают далее с помощью Eag I (получают 4 фрагмента: 3650, 800, 560, 180) и образовавшийся длиной в 800 нуклеотидов специфический для ТВЕ-вируса фрагмент выделяют очищенным из 1% агарозного геля. 1 мкг NK-I также разрезают с помощью Eag I и объединяют примерно с 200 нг очищенного NheI - Eag I - фрагмента плазмиды НА3. Смесь очищают, лигируют и транскрибируют, РНК, как описано выше, трансформируют ВНК-клетки. Из образовавшегося рекомбинантного вируса выделяют РНК и переводят в кДНК. Из этой кДНК путем PCR амплифицируют несколько коротких отрезков и последовательность этих фрагментов анализируют непосредственно без предварительного клонирования. Это секвенирование подтверждает ожидаемую структуру генома рекомбинантного вируса с последовательностью ТВЕ-вируса штамма Neudörfl вплоть до положения 10038 и генома ТВЕ-вируса штамма Hypr от 10039 до 3'-конца. Определяемая с помощью моноклональных антител (Guirakhoo и др., 1989, Holzmann и др., 1992) антигенная структура соответствует полностью таковой штамма Neudörfl, однако рекомбинантный вирус в ВНК-клетках показывает характерный для штамма Hypr более сильный цитопатический эффект раньше, чем более слабый эффект, который вызывает нативный вирус штамма Neudörfl.

Пример 12. Получение аттенуированного мутанта ТВЕ-вируса при применении рекомбинантной кДНК.

Точечная мутация ТВЕ-вируса штамма Neudörfl., которая приводит к изменению аминокислотной последовательности Е-протеина в положении 384 от тирозина к гистидину, имеет следствием значительную аттенуацию вируса в отношении его нейровирулентности и его нейроинвазивности в животной модели (мышь) (Holzmann и др., 1990). Этот аттенуированный мутант ТВЕ-вируса получают также с помощью предлагаемого согласно изобретению инфекционного клона.

Плазмиду Т 7-2 разрезают с помощью ферментов BamHI (1988) и CIaI (3154), оба образовавшихся фрагмента длиной в 5740 п.о. и 1170 п.о. разделяют на 1% агарозном геле и элюируют. Фрагмент длиной 1170 п.о. разрезают с помощью Hinf I (сайт рестрикции в ТВЕ-вирусе в положении 2136) и полученные фрагменты длиной 1020 п.о. и 150 п.о. разделяют и элюируют фрагмент длиной 1020 п.о. Примерно равные количества полученного BamHI/CIaI-фрагмента (1540 п.о.) и Hinf I/CIaI- фрагмента (1020 п.о.) смешивают с 4-5 кратным молярным избытком маленького PCP-фрагмента, который содержит желательную мутацию и который получают следующим образом: 1 нг плазмиды Т 7-2 используют в качестве исходного материала в PCR-реакции с праймерами Т91 и Mut 01 (табл. 1). Праймер Mut 01 трансформирует как вышеупомянутый Hinf I-сайт (2136), так и мутируемое нуклеотидное положение (G вместо А в минус-нити генома в положении 2103). Праймер Т 91 занимает такую позицию, что образующийся PСR-фрагмент содержит также ВаmНI-сайт в нуклеотидной позиции 1988. Полученный РСР-продукт разрезают с помощью ферментов BamHI и Hinf I, отделяют через 1,2% агарозный гель и путем электроэлюции выделяют BamHI/ Hinf I-фрагмент длиной 150 п.о. и, как указано выше, смешивают с обоими другими фрагментами. Смесь этих трех фрагментов очищают, лигируют и трансформируют E.coli HB 101. Рекомбинантные плазмиды выделяют и желательную последовательность подтверждают путем секвенирования. Полученную таким образом плазмиду, которая отличается только одной-единственной точечной мутацией от плазмиды Т 7-2, можно применять таким же образом, как и Т 7-2, для получения ТВЕ-вируса. (см. выше). Полученный рекомбинантный вирус (R В 4) анализируют с помощью моноклональных антител (Heinz и др., 1983, Guirakhoo и др., 1989), и точно такое же реакционное исследование, как описанное Holzmann и др. (1990), показывает наличие аттенуированного В 4-мутанта.

Пример 13. Характеристика вирулентных свойств рекомбинантного мутанта R В 4.

Для определения вирулентности используют взрослых Surss-Albino-мышей, которые как после внутримозговой, так и после подкожной инфекции с помощью штамма Neudörfl дикого типа заболевают протекающим со смертельным исходом энцефалитом. Группы по 10 мышей инфицируют одинаковыми количествами, а именно, смотря по обстоятельствам, по 100 БОЕ штамма Neudörfl и мутанта RB 4, путем внутримозговой и подкожной инфекции. Как следует из фиг.8, как нейровирулентность (внутримозговая инокуляция), так и также нейроинвазивность (подкожная инокуляция) сильно снижается мутантом R В 4 по сравнению со штаммом Neudörfl. Полученный с помощью инфекционного клона вирус R В 4 по своим вирулентным свойствам таким образом соответствует варианту V В 4, выделенному с помощью моноклонального антитела (Holzmann и др., 1990).

Формула изобретения

1. к-ДНК для получения рекомбинантного вируса клещевого энцефалита (TBEV), включающая последовательность, кодирующую TBEV, приведенную на фиг.5 или имеющую перед положением 1 дополнительный G и 3'-некодирующую последовательность, которая, по крайней мере, на 80% гомологична последовательности, приведенной на фиг.5а, причем к-ДНК кодирует инфекционный РНК-транскрипт.

2. к-ДНК по п.1, отличающаяся тем, что включает 3'-некодирующую последовательность, приведенную на фиг.5а.

3. к-ДНК по п.1 или 2, отличающаяся тем, что кодирующая ТВЕ-вирус последовательность образована от ТВЕ-вируса (W), ТВЕ-вируса (ЕЕ).

4. к-ДНК по любому из пп.1-3, отличающаяся тем, что находится под контролем промотора, выбираемого из прокариотических промоторов SP6, Т3, Т7 или из эукариотических промоторов CMV, RSV, β-актина, SV40 или адено-2.

5. к-ДНК по любому из пп.1-4, отличающаяся тем, что кодирует аминокислотную последовательность, которая имеет модификацию в участке N-гликозилирования при аминокислоте в позиции 154.

6. к-ДНК по любому из пп.1-5, отличающаяся тем, что кодирует аминокислотную последовательность, которая имеет, по меньшей мере, одну модификацию, снижающую вирулентность, согласно показанным в табл.3 аминокислотным заменам.

7. к-ДНК по любому из пп.1-6, отличающаяся тем, что кодирует аминокислотную последовательность, которая имеет модификацию аминокислоты Tyr после His в положении 384 аминокислоты Е-протеина ТВЕ-вируса.

8. к-ДНК по любому из пп.1-7, используемая для получения ТВЕ-вирусной вакцины.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9, Рисунок 10, Рисунок 11, Рисунок 12, Рисунок 13, Рисунок 14, Рисунок 15, Рисунок 16, Рисунок 17, Рисунок 18, Рисунок 19, Рисунок 20, Рисунок 21, Рисунок 22, Рисунок 23, Рисунок 24, Рисунок 25, Рисунок 26, Рисунок 27, Рисунок 28, Рисунок 29, Рисунок 30, Рисунок 31, Рисунок 32, Рисунок 33, Рисунок 34, Рисунок 35, Рисунок 36, Рисунок 37, Рисунок 38