Набор для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц

 

Изобретение относится к ветеринарной микробиологии и биотехнологии. Предлагаемый набор содержит очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, а также дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 сухую положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, сухую отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, при этом каждый из указанных компонентов и катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас. %, 2:98-15:85. Из неспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор, фосфатно-цитратный буфер, краситель ортофенилендиамин или 2,2-азино-ди[3-этил] бензтиазолинсульфоновую кислоту, детергент твин-20 и гидроперит. Набор повышает активность и специфичность ИФА и снижает себестоимость. 11 з.п. ф-лы, 6 табл.

Изобретение относится к области диагностики, ветеринарной микробиологии и биотехнологии, в частности к получению наборов для обнаружения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц (РМП) в иммуноферментном анализе (ИФА), и может быть использовано при диагностике РМП в научно-исследовательских учреждениях, региональных и областных ветеринарных лабораториях и при изготовлении указанных наборов на предприятиях биологической промышленности.

РМП (хроническая респираторная болезнь, болезнь воздухоносного мешка инфекционный синусит индеек) - хроническое инфекционное заболевание кур, индеек, фазанов, цесарок, характеризующееся поражением дыхания, истощением и потерей продуктивности. Возбудитель заболевания - Mycoplasma gallicepticum (MG), относящийся к плевропневмонийной группе микроорганизмов. Известны и другие патогенные и условно патогенные виды микоплазм, например, Mycoplasma meleagridis, которую часто удается выделить от индеек. Mycoplasma gallisepticum - полиморфный кокк величиной от 0,5 мкм до 1 мкм. Источником возбудителя является больная птица, а также вакцина, приготовленная из инфицированных эмбрионов. Летальность от 5 до 40% заболевшего поголовья птиц.

Диагноз на РМП устанавливают на основании эпизоотологических, клинических и патолого-анатомических данных с обязательными серологическими исследованиями патологического материала и постановкой биопробы. РМП необходимо дифференцировать от колисептицемии, аспергиллеза, инфекционного трахеита и бронхита, гиповитаминоза А, для чего обычно применяют культуральные или серологические методы. Для обнаружения возбудителя РМП или специфических антител к нему, свидетельствующих о контакте птиц с микроорганизмом, используют различные серологические тесты. Такими тестами являются: реакция подавления роста, реакция агглютинации (РА), реакция задержки гемагглютинации (РЗГА), метод прямой флюоресценции антител (МПФА), иммуноферментный анализ (ИФА) /1, 2, 3, 4, 5, 6, 7/.

Большинство методов, позволяющих контролировать уровень антител к возбудителю РМП в сыворотках крови птиц, а также присутствие антигена в биологических материалах, основано на ИФА /1, 2, 4, 8, 9/. Для выявления антител к возбудителю РМП и определения их концентрации в сыворотках крови получил распространение непрямой вариант ИФА, в котором исследуемый образец взаимодействует с антигеном, иммобилизованном на планшете из оптически прозрачного полимера с 96 лунками. Далее антитела в составе иммунных комплексов реагируют с конъюгатом. Результаты анализа с высокой точностью фиксируют средствами спектрофотометрии. Для обнаружения и оценки титра антигена возбудителя РМП в биологических материалах широко применяют непрямой сэндвич-вариант ИФА, при осуществлении которого исследуемый антиген вначале улавливается специфическими антителами, иммобилизованными на планшете, а затем выявляется детекторными антителами, с которыми взаимодействует конъюгат. Результаты анализа фиксируют также с помощью спектрофотометра.

Достоинством ИФА являются высокая чувствительность и специфичность, возможность проведения масштабных исследований в полевых условиях, оперативность проведения анализов, небольшие объемы исследуемых проб и возможность автоматизации практически всех стадий выполнения реакции, включая регистрацию и обработку получаемых результатов /8, 9/.

В настоящее время фирмы, специализирующиеся на производстве средств для молекулярно-биологической диагностики, выпускают специальные наборы для проведения ИФА с целью обнаружения сывороточных антител к вирусам и микробам, вызывающим различные заболевания кур, в том числе и РМП.

Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в крови, сыворотке крови или яичном желтке (полуколичественный метод) в ИФА. Антиген возбудителя РМП нанесен отдельно на пластиковую гребенку. Реакция протекает внутри ячеек проявляющих пластин. В состав набора включены 3 карточки гребенки "Immunocomb", 3 проявляющие пластины, 3 листка бумаги для образцов с предварительно нанесенными дисками, 4 ланцета для взятия проб крови, 1 пинцет, 1 калибровочная цветовая шкала "CombScale", 1 пробирка с сывороткой для положительного контроля, 1 пробирка с сывороткой для отрицательного контроля, график "CombScore". Набор используется для оценки эффективности вакцинации, определения наиболее приемлемых сроков вакцинации и периодического серологического анализа стад с целью быстрой и эффективной диагностики заболеваний /10/.

Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, отрицательную сыворотку крови, положительную сыворотку крови к MG, антикуриный пероксидазный конъюгат, раствор для разведения и промывки сывороток и конъюгата, окрашивающий раствор 2,2'-азино-ди[3-этил] бензтиазолинсульфоновой кислоты (АБТС) и раствор, останавливающий окраску реакции - 5% SDS. Измерение оптической плотности проводят с использованием фильтра 405-410 нм. С помощью данного набора исследуют полевые сыворотки на наличие антител к возбудителю РМП и проводят количественную оценку титра антител /11/.

Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, отрицательную сыворотку крови кур, щелочной фосфатазный конъюгат овечьих антител к куриным IgG, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов (фосфатный буфер с белковыми стабилизаторами), субстратный буфер (диэтаноламиновый буфер с энзимфакторами), таблетки pNPP, останавливающий раствор. С помощью данного набора можно измерять уровень антител к возбудителю РМП в сыворотках крови кур /12/.

Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, отрицательную сыворотку крови кур, препарат козьих антител к куриным IgG, конъюгированных с пероксидазой хрена, с гентамицином, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, буферный раствор для разведения концентрата субстрата ТМВ, останавливающий раствор. Данный набор позволяет измерять уровень антител к возбудителю РМП в сыворотках крови кур /13/.

Общим недостатком указанных наборов является то, что они импортные, что определяет высокую себестоимость соответствующих исследований.

Известен набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, отрицательную сыворотку крови кур, лиофильно высушенный антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, детергент твин-20, краситель, 5-аминосалициловую кислоту, гидроперит (14).

Недостатки данного набора состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления.

Известен также карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, который является органическим ионообменным веществом слабокислотного типа в натриевой форме. Известно его применение для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, для очистки катионного обмена (15).

Наиболее близким предлагаемому изобретению по совокупности существенных признаков является набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП, сухую отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов, субстратный буфер, краситель, детергент и гидроперит (16).

Недостатки набора - прототипа состоят в его низкой активности и специфичности, а также высокой себестоимости изготовления. Это объясняется тем, что в наборе-прототипе используются лиофилизованные биокомпоненты, сложность получения которых заключается в том, что для лиофилизации необходимо использовать оптимальные объемы нативного материала (минимум 0,5 см³), иначе невозможно получить оптимальную форму лиофилизованной "таблетки". Даже используя для лиофилизации такие минимальные объемы, существует опасность размораживания материала при загрузке и потери активности при высушивании, особенно конъюгата и специфической сыворотки. Процесс лиофилизации с предварительным замораживанием продолжается около 3 суток. Кроме того, при регидратации и разведении конъюгата до рабочего состояния, после использования излишки ценных биокомпонентов подвергают утилизации, так как они не подлежат хранению.

В задачу создания настоящего изобретения входила разработка набора для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, обладающего более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.

Технический результат от использования изобретения заключается в повышении активности и специфичности набора и снижении себестоимости его изготовления.

Указанный технический результат достигнут созданием изобретения, охарактеризованного следующей совокупностью признаков.

1. Набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА.

1.1. Очищенный инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.2.1. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Положительная сыворотка - 2-15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 1.2.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, полученная контактным обезвоживанием.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.3.1. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Отрицательная сыворотка - 2-15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 1.3.2. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.4.1. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%: Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15 Катионит КБ-4П-2 - До 100 1.4.2. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

1.5.1. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

1.6. Субстратный буфер.

1.6.1. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

1.7. Детергент.

1.7.1. Из детергентов набор содержит твин-20.

1.8. Краситель.

1.8.1. Из красителей набор содержит ортофенилендиамин (ОФД).

1.8.2. Из красителей набор содержит АБТС.

1.9. Гидроперит.

Предлагаемое изобретение включает следующую совокупность существенных признаков, обеспечивающих получение технического результата во всех случаях, на которые испрашивается правовая охрана.

1. Набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА.

1.1. Очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

1.6. Субстратный буфер.

1.7. Детергент.

1.8. Краситель.

1.9. Гидроперит.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими признаками, выражающими конкретные формы его выполнения или особые условия использования.

1. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, полученная контактным обезвоживанием.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

9. Из детергентов набор содержит твин-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД.

11. Из красителей набор содержит АБТС.

Признаками изобретения, характеризующими предлагаемый набор и совпадающими с признаками прототипа, в том числе родовое понятие, отражающее назначение, являются следующие.

1. Набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА.

1.1. Очищенный инактивированный антиген возбудителя РМП, иммобилизованный на твердом носителе.

1.2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП.

1.3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур.

1.4. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур.

1.5. Буферный раствор для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов.

1.6. Субстратный буфер.

1.7. Детергент.

1.8. Краситель.

1.8. Гидроперит.

По сравнению с набором-прототипом существенными отличительными признаками предлагаемого набора являются следующие.

1. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

2. Сухая отрицательная сыворотка кур, дополнительно содержащая карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

3. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащий карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

Предлагаемое изобретение характеризуется также другими отличительными признаками, выражающими конкретные формы выполнения или особые условия его использования.

1. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
2. Сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП, полученная контактным обезвоживанием.

3. Сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
4. Сухая отрицательная сыворотка крови кур, полученная контактным обезвоживанием.

5. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Антивидовой иммунопероксидазный конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
6. Сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулиьюв кур, полученный контактным обезвоживанием.

7. В качестве буферного раствора для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов набор содержит трис-буферный раствор.

8. В качестве субстратного буфера набор содержит фосфатно-цитратный буфер.

9. Из детергентов набор содержит твин-20.

10. Из красителей набор содержит ОФД.

11. Из красителей набор содержит АБТС.

Предлагаемый набор обладает более высокой активностью и специфичностью и низкой себестоимостью изготовления.

Проведенный заявителем анализ уровня техники, включающий поиск по патентным и научно-техническим источникам информации, и выявление источников, содержащих сведения об аналогах предлагаемого изобретения, позволил установить, что заявитель не обнаружил источники, характеризующиеся признаками, тождественными (идентичными) всем существенным признакам предлагаемого изобретения. Определение из перечня выявленных аналогов прототипа, как наиболее близкого по совокупности признаков, позволило установить совокупность существенных по отношению к усматриваемому заявителем техническому результату отличительных признаков предлагаемого набора, изложенных в независимом пункте формулы изобретения.

Следовательно, заявляемое изобретение соответствует условию патентоспособности "новизна".

Для проверки соответствия предлагаемого решения условию патентоспособности "изобретательский уровень" проведен дополнительный поиск известных решений для выявления признаков, включенных в отличительную часть независимого пункта формулы изобретения. В результате поиска установлено следующее.

Известно использование карбоксилсодержащего катионита КБ-4П-2 для селективного удаления небольших количеств двухвалентных катионов из смесей с большими концентрациями одновалентных катионов, а также для очистки стрептомицина и других реакций катионного обмена (13). Для высушивания микроколичеств иммуноспецифических компонентов предлагаемого набора авторами использован впервые карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2, при этом авторами обнаружено новое, ранее неизвестное, свойство катионита КБ-4П-2 не изменять нативные характеристики иммуноспецифических компонентов при обезвоживании и одновременно повышать их специфичность и активность.

Результаты поиска показывают, что предлагаемое изобретение не вытекает для специалиста явным образом из известного уровня техники, изложенного в соответствующем разделе описания (не выявлены аналогичные решения, имеющие признаки, совпадающие с отличительными признаками предлагаемого изобретения), а также не выявлено влияние предусматриваемых существенными признаками предлагаемого изобретения преобразований для достижения технического результата. Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "изобретательский уровень".

Сущность изобретения пояснена примерами его исполнения, которые не ограничивают объем изобретения.

Пример 1.

Набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА содержит следующие компоненты: очищенный и инактивированный антиген возбудителя РМП, штамм "S6", нанесенный на пластиковый планшет (два планшета), дополнительно содержащие карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 сухую положительную сыворотку крови кур к возбудителю РМП (одна ампула), сухую отрицательную сыворотку крови кур (одна ампула) и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур (одна ампула), а также набор солей для приготовления трис-буферного раствора, используемого для разведения и промывки иммуноспецифических компонентов и содержащего трис(оксиметил)аминометан в количестве 0,97 г, трис(оксиметил)аминометан гидрохлорид в количестве 6,61 г, хлористый натрий в количестве 11,7 г (три флакона), набор солей для приготовления субстратного буфера, содержащего натрий фосфорнокислый двузамещенный в количестве 5,37 г и лимонную кислоту в количестве 1,57 г (фосфатно-цитратный буфер - два флакона), ОФД (одна таблетка) или АБТС (одна таблетка), детергент твин-20 (один флакон), гидроперит (одна таблетка).

Пример 2.

Для изготовления антигена возбудителя РМП используют производственный штамм "S6" MG. Расплодкой штамма засевают колбы с микоплазма-бульоном, содержащим 15% лошадиной сыворотки. Культивирование проводят на установке УВМТ-2-250 при температуре 37,0±0,5^oС и перемешивании 120 об/мин. При достижении бульонной культурой оптической плотности на длине волны 650 нм 0,65 оптических единиц ферментацию останавливают. Чистоту роста определяют путем высева проб культуральной среды на микоплазма-агар, МПА, МПБ, среду Сабуро. На микоплазма-агаре через 24-48 ч должны формироваться характерные для микоплазм колонии с врастающим в толщу агара центром и прозрачной периферией, напоминающие яичницу "глазунью". После прекращения термостатирования в культуральную среду вносят аминоэтилэтиленимин (АЭЭИ) в концентрации 0,3%. Инактивацию проводят при температуре 20-25^oС и перемешивании в течении 24 ч. Затем культуральную жидкость центрифугируют при 22000 g в течение 35 мин. Надосадок декантируют, осадок ресуспендируют фосфатно-буферным раствором (ФБР) с рН 7,2. Отмывку повторяют. Осадок ресуспендируют в ФБР до 1/100 исходного объема и спектрофотометрически определяют концентрацию белка в материале. Материал обрабатывают додецил-сульфатом натрия (ДСН) (1 мг детергента на 1 мг белка) в течение 1 ч при 37,0±0,5^oС. Затем проводят диализ антигена в течение 48 ч при 4,0±0,5^oС против ФБР с добавлением этилендиаминтетроацетата (ЭДТА) в концентрации 0,01%. ФБР устанавливают концентрацию белка 1 мг/мл.

Активность и специфичность полученного антигена определяют в непрямом варианте ИФА. Для этого антиген иммобилизуют на планшет в различных концентрациях (разведения от 1:50 до 1:300) и исследуют в непрямом варианте ИФА. Определяют ту концентрацию (разведение), при которой специфичная к возбудителю РМП гипериммунная сыворотка кур демонстрирует титр не менее чем 1:9000. Исключают неспецифические реакции. Исследуемый антиген не должен специфически реагировать с сыворотками, имеющими антитела к вирусам: бронхита, ньюкаслской болезни, адено-, рео-, а также к бактериальным антигенам: сальмонеллеза и пастереллеза.

Прошедший необходимые тесты очищенный и инактивированный препарат антигена возбудителя РМП используют для иммобилизации на планшеты. Количество антигена, необходимое для изготовления партии наборов, размораживают и готовят рабочее разведение в буфере для разведения антигена. После инкубации в течение 18 ч при 4^oС или 2 ч при 37^oС раствор антигена удаляют, планшеты промывают буфером и вносят по 0,1 мл блокирующего раствора. Инкубируют 1 ч при комнатной температуре и промывают 3 раза буфером. Планшеты высушивают на воздухе и упаковывают в полиэтиленовые пакеты поштучно.

Пример 3. Для получения положительной сыворотки в качестве доноров используют безлейкозных цыплят в возрасте 21-42 дня. Для гипериммунизации используют антиген возбудителя РМП, полученный так, как описано в примере 2. Цыплятам внутримышечно в дозе 0,5 мл вводят суспензию очищенного и инактивированного антигена из производственного штамма "S6" с неполным адъювантом Фрейнда. Двукратно с интервалом в 10 суток птицу подвергают гипериммунизации. Спустя 10 суток после последней инъекции проводят пробное взятие крови для определения активности гипериммунной сыворотки. В случае высокой активности сыворотки цыплят тотально обескровливают с соблюдением правил асептики и антисептики в увлажненные физиологическим раствором пробирки. Если активность сывороток невысокого уровня, проводят дополнительную иммунизацию свежеприготовленным антигеном с адъювантом, а спустя 10 суток доноров тотально обескровливают. Индивидуальные пробы крови выдерживают сначала при +37^oС в течение 30-60 мин, а затем при +4^oС в течение суток. Отстоявшуюся сыворотку отсасывают в стерильные пробирки, не допуская попадания эритроцитов и других форменных элементов крови, инактивируют при +57^oС в течение 30 мин, консервируют хинозолом в соотношении 1:1000. Полученную сыворотку смешивают с карбоксилсодержащим катионитом КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 4.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Положительная сыворотка - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в табл. 1.

Представленные в табл. 1 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 5.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Положительная сыворотка - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в табл. 2.

Представленные в табл. 2 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученного методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 6.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухой положительной сыворотки крови кур к возбудителю РМП, дополнительно содержащей карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученной контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет мас.%:
Положительная сыворотка - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в табл. 3.

Представленные в табл. 3 данные свидетельствуют о том, что полученная методом контактного обезвоживания сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю РМП превосходит по активности и специфичности таковую прототипа, полученную методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 7.

Используемую в качестве компонента набора отрицательную сыворотку крови кур получают от здоровой безлейкозной птицы. К полученной сыворотке добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 8.

В предлагаемом наборе используют антивидовые коммерческие конъюгаты, выпускаемые НИИЭМ имени Н.Ф. Гамалея, представляющие собой глобулиновую фракцию, выделенную из антисыворотки, полученной иммунизацией кур и меченую пероксидазой хрена. К конъюгату добавляют карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 в соотношении, мас.%, 2:98-15:85 (указанные соотношения являются оптимальными) и подвергают контактному обезвоживанию.

Пример 9.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученный контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 2,0
Катионит КБ-4П-2 - 98,0
Результаты испытаний представлены в табл. 4.

Представленные в табл. 4 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 10.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет, мас.%:
Конъюгат - 7,0
Катионит КБ-4П-2 - 93,0
Результаты испытаний представлены в табл. 5.

Представленные в табл. 5 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Пример 11.

Проведены сравнительные испытания в ИФА сухого антивидового иммунопероксидазного конъюгата против иммуноглобулинов кур, дополнительно содержащего карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 и полученного контактным обезвоживанием, при этом содержание ингредиентов в данной смеси составляет. мас.%:
Конъюгат - 15,0
Катионит КБ-4П-2 - 85,0
Результаты испытаний представлены в табл. 6.

Представленные в табл. 6 данные свидетельствуют о том, что полученный методом контактного обезвоживания сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат превосходит по активности и специфичности таковой прототипа, полученный методом лиофильного высушивания, и хранится без снижения активности в течение 12 месяцев.

Таким образом, приведенная выше информация свидетельствует о выполнении при использовании предлагаемого изобретения следующей совокупности условий:
- набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, воплощающий предлагаемое изобретение, предназначен для использования в сельском хозяйстве, а именно в ветеринарной микробиологии и биотехнологии;
- для предлагаемого изобретения в том виде, как оно охарактеризовано в независимом пункте формулы изобретения, подтверждена возможность его осуществления с помощью описанных в заявке или известных до даты приоритета средств и методов;
- набор для определения антител к возбудителю РМП в ИФА, приготовленный в соответствии с предлагаемым изобретением, обладает высокой активностью и специфичностью, а также низкой себестоимостью изготовления.

Следовательно, предлагаемое изобретение соответствует условию патентоспособности "промышленная применимость".

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ,
принятые во внимание при составлении описания изобретения к заявке на выдачу патента РФ на "Набор для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц"
1. Avakian A.P., Kleven S.H., Glisson R. Evaluation of the specificity and sensitivity of two commercial enzime-linked immunosorbent assay kits, the serum plate agglutination test, and the hemagglutination-inhibition teat for antibodies formed in response to Mycoplasma gallisepticum. Avian. Dis., 1988, V. 32, pp. 262-272.

2. Ansari A. A. , Taylor R.F., Chang T.S. Application of enzyme-linked immunosorbent assay for detecting antibody to Mycoplasma gallisepticum infection in poultry. Avian Dis., V. 27, pp. 21-35
3. Clide W.A. Growth inhibition testes. In: Methods in Mycoplasmology, vol. 1, Mycoplasma characterization. S. Razin, Tully I,G., eds. Academic Press, NY, 1983, pp. 405-410.

4. Kempt I. , Gesbert F., Guittet M. e.a. Evaluation of two commercial enzime-linked immunosorbent assay kits for the detection of Mycoplasma gallisepticum antibodies. Avian Pathol., 1994, V. 23, pp. 329-338.

5. Kleven S. H. , Morrow C.I., Whithear K.G. Comparison of Mycoplasma gallisepticum strains by hemagglutination-inhibition and restriction endonuclease analysis. Avian Dis., 1988. V. 32, pp. 731-741.

6. Nougayrede P. , Toquin D., Andrae B. e.a. Depistage serologique des mycoplasmoses aviares: agglutination rapide surlame, inhibition de I'hemagglutination, inhibition metabolique, techniques appliques au dianostic des infections a Mycoplasma gallisepticum. Avian Pathol., 1984, V. 13, pp. 753-768.

7. Пат. США 4908305; G 01 N 33/53, 33/577, 13.03.90 г.

8. Егоров А. М., Осипов А.П. и др. Теория и практика иммуноферментного анализа. М.: Высшая школа, 1991, с. 77-100.

9. Сеймур П.Х. Иммуноферментный анализ антител // Иммуноферментный анализ. М.: Мир, 1988, с. 193-205.

10. Mycoplasma gallisepticum - synoviae antibody test kit. Instruction manual. Biogal Galed Labs. Kibbutz Galed 19240 Israel.

11. Mycoplasma gallisepticum antibody test kit. Instruction. Catalog 54-85-01/KPL (Kirkegaard and Perry Laboratories), US, @ Cessna Court Gaithersburg Maryland 20879, 8006383167.

12. Mycoplasma gallisepticum antibody test kit. Instruction. Catalog Code CK 113. BioChek C.V. Weth, Venteweg. 143.2805 J N Gonda, Holland.

13. IDEXX's instruction for an enzyme immunoassay for the detection of antibody in chicken serum. IDEXX Laboratories, Inc., Westbrook, USA, 1996, 30 р.

14. Временное наставление по применению набора для выявления антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц иммуноферментным методом. Утверждено Департаментом ветеринарии МСХП РФ 13.02.01 г.

15. Краткая химическая энциклопедия. М.: Сов. энциклопедия, 1963, т.2, с. 299-306.

16. Патент Японии JP 7236498, C 12 Q 1/68, 12.09.1995 г. (прототип).

Формула изобретения

1. Набор для определения антител к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц иммуноферментным анализом, содержащий очищенный и инактивированный антиген возбудителя инфекции, иммобилизованный на твердом носителе, сухую положительную сыворотку крови кур к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц, сухую отрицательную сыворотку крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, а также буферный раствор для разведения и промывки, субстратный буфер, детергент, краситель и гидроперит, отличающийся тем, что сухая положительная сыворотка крови кур к возбудителю респираторного микоплазмоза птиц, сухая отрицательная сыворотка крови кур и сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур дополнительно содержат карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2.

2. Набор по п.1, отличающийся тем, что сухая положительная сыворотка к возбудителю инфекции и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Положительная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
3. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую положительную сыворотку крови кур к возбудителю инфекции, полученную контактным обезвоживанием.

4. Набор по п. 1, отличающийся тем, что сухая отрицательная сыворотка крови кур и карбоксилсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Отрицательная сыворотка - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
5. Набор по п.1, отличающийся тем, что он содержит сухую отрицательную сыворотку крови кур, полученную контактным обезвоживанием.

6. Набор по п.1, отличающийся тем, что сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур и карбоксидсодержащий катионит КБ-4П-2 содержатся в соотношении, мас.%:
Конъюгат - 2-15
Катионит КБ-4П-2 - До 100
7. Набор по п,1, отличающийся тем, что он содержит сухой антивидовой иммунопероксидазный конъюгат против иммуноглобулинов кур, полученный контактным обезвоживанием.

8. Набор по п.1, отличающийся тем, что в качестве буферного раствора он содержит трис-буферный раствор.

9. Набор по п.1, отличающийся тем, что в качестве субстратного буфера он содержит фосфатно-цитратный буфер.

10. Набор по п,1, отличающийся тем, что из детергентов он содержит твин-20.

11. Набор по п.1, отличающийся тем, что из красителей он содержит ортофенилендиамин.

12. Набор по п. 1, отличающийся тем, что из красителей он содержит 2,2'-азино-ди[3-этил]бензтиазолинсульфоновую кислоту.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3