Аллерген из бактерий рода rhodococcus и способ его изготовления

 

Изобретение относится к ветеринарии, в частности к способам получения аллергенов для диагностики заболеваний, вызываемых бактериями из рода родококкус. В качестве диагностического аллергена используется активный белок, получаемый из культуральной жидкости Rhodococcus bronchialis, что обеспечивает высокую точность диагностики. Способ изготовления аллергена осуществляется осаждением активного белка из культуральной жидкости Rhodococcus bronchialis с использованием хлористого натрия. Способ является простым и эффективным и обеспечивает получение специфического аллергена. 2 с.п.ф-лы, 5 табл.

Изобретение относится к области ветеринарии, в частности может быть использовано при диагностике инфекций, вызванных микробами рода родококкус.

В практике ветеринарной медицины для аллергической диагностики инфекционных болезней используются различные аллергены. Наиболее широкое применение из них получили туберкулин - при туберкулезе, бруцеллин - при бруцеллезе, малеин - при сапе и др. В медицинской практике известны антраксин - при сибирской язве, пестин - при чуме, дизентерин - при дизентерии, нокардин - при нокардиозе и т.д.

Принцип аллергической диагностики с использованием аллергенов основан на так называемом "феномене Коха", заключающемся в проявлении повышенной чувствительности сенсибилизированного макроорганизма к повторному введению антигена. Благодаря высокой специфичности и возможности пожизненной диагностики аллергический метод нашел широкое применение в ветеринарии при многих инфекциях (бруцеллез, туберкулез, сап). Кроме того, разработаны аллергены для диагностики гельминтозов и вирусных болезней (1). Однако в доступной литературе мы не нашли описания о разработке и испытании аллергена из родококков. Известно, что некоторые виды родококков патогенны для человека и животных. Так, Р.бронхиалис вызывает легочные заболевания, септический артрит и остеомиелит (7, 3). Р.экви вызывает пневмонию у жеребят и взрослых лошадей, может вызвать заболевание крупного рогатого скота и свиней (2, 4, 6), слабо патогенен для человека (6). Также установлено, что родококки способны сенсибилизировать макроорганизм и это их свойство можно использовать в идентификации Р.терре и Р.рубропертинктус (5).

Наиболее близким по технической сущности заявляемому изобретению является аллерген микобактерий - туберкулин, используемый для аллергической диагностики туберкулеза у людей и животных.

Как известно, микобактерии, нокардии, коринебактерии и родококки имеют близкородственные генетические, иммунологические, хемотаксономические свойства, IV-тип клеточной стенки, высокое содержание в клетках липидов и синтезируют миколовые кислоты. Поэтому данные микроорганизмы объединены в пределах одного семейства. Теоретически предполагали, что имея общие группоспецифические антигены с нокардиями, микобактериями и коринебактериями, родококки также способны сенсибилизировать макроорганизм, а это свойство возможно использовать в конструировании специфического аллергена.

Недостатком известных аллергенов является неспецифическая чувствительность у животных с родококковой инфекцией, как следствие этого - невозможность правильной постановки диагноза.

Целью изобретения является разработка специфического родококкового аллергена.

Поставленная цель достигается тем, что на культуральную синтетическую среду Сотона с L-аспарагином для выращивания микобактерий и нокардий и далее используемую для осаждения активного белка с помощью аммония сернокислого и трихлоруксусной кислоты с последующим диализом, в качестве источника белка высеивается культура Р.бронхиалис, инкубируется при 37^oС в течение 2-х месяцев, периодически встряхивая, и автоклавируется при 120^oС в течение 30 минут. Бакмассу отделяют центрифугированием, а из культуральной жидкости активный белок осаждают в изоэлектрической точке с помощью NaCl в 20%-ной концентрации и декантированием. Полученный осадок растворяют в дистиллированной воде до концентрации по белку 0,7 мг/мл.

Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый аллерген отличается от известного введением новых компонентов, а именно источником получения белка (Р.бронхиалис) и способом его осаждения (с NaCl в изоэлектрической точке). Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию "новизна".

Анализ известных систем, используемых для получения аллергенов, показал, что в производстве аллергенов использовали сложные химические вещества, вследствие чего возникает необходимость дополнительной очистки осажденного белка диализом или хротатографией, что не требуется в заявляемом решении. Вместе с тем полученный таким путем аллерген оказался наиболее чувствительным и специфичным в экспериментах на кроликах, чем полученные иным путем. Таким образом, предлагаемый состав компонентов придает аллергену новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию "существенные отличия".

Для экспериментальной проверки заявляемого аллергена были подготовлены 4 серии препарата, отличающиеся реагентами, используемыми в качестве осадителей активного белка из культуральной жидкости: с NaCl, с трихлоруксусной кислотой (ТХУ), с гексаметафосфатом и с сернокислым аммонием. Все реагенты были использованы в различной концентрации и при разных значениях рН.

Для осаждения белка использовали автоклавированную и отделенную от бакмассы Р.бронхиалис культуральную жидкость одной серии. Осажденный с помощью ТХУ, ГМФ и сернокислым аммонием активный белок освобождали от остатков солей диализом.

Результаты этих исследований отражены в табл. 1-4. Как видно из данных табл.1-4, наибольший осадок белка был получен c NaCl при 15-20% концентрации соли и рН 4,1-3,9. В остальных случаях осадок был незначительный и требовалась дополнительная очистка от остатков солей и концентрация белка с помощью диализа или же слабо активный. В полученных таким путем сериях аллергенов подводили содержание остаточного азота к 0,7 мг/мл и проверяли на активность и специфичность в эксперименте на сенсибилизированных микобактериями, нокардиями и родококками кроликах. В табл. 5 рассмотрены полученные свойства различных серий аллергенов.

Приведенные в табл.5 данные подтверждаются актом испытаний аллергенов, прилагаемым к настоящей заявке.

Из табл. 5 следует, что наибольшая интенсивность реакций была на аллерген, полученный путем осаждения белка хлористым натрием у сенсибилизированных родококками кроликов, что указывает на его высокую специфичность. Это позволит значительно облегчить прижизненную диагностику родококковых инфекций и дифференцировать их от инфекций, вызываемых микобактериями и родококками.

ИСТОЧНИКИ ИНФОРМАЦИИ 1. Фрадкин В. А. Диагностические и лечебные аллергены. - М.: Медицина, 1990, 256 с.

2. Bergey's manual of determinative bacteriologу. - 8 col.-Baltimore: Williams and Willcins Co., 1974, 1268 p.

3. Broughton R. A., Wilson H.D., Goodman N.L. et. al. Septic arthritis and osteomielitis caused by an organism of the genus Rhodococcus.//L. Clin Microbiol. - 13. - N 1. P. 209-213.

4. Goodsellow M. , Minnikin D.E. The genera Nocarolia and Rhodococcus. //In. The Procariotes. - Berlin; Heidelberg: Springer. - 1981. - Vol.2. - P. 2017-2027.

5. Hyman I.S., Chaparas S.D. Acomparative study of the "rodochrous" complex and related taxa by delayed - type skin reactions on guinea pigs and by polyacrilamide gel elektrophoresis.//L. Gen. Microbiol. - 1977. - 100. - N 2. - P.363-371.

6. Lipsky B.A., Goldenberger A.C., Topkins L.S., Plorde I.I. Infections caused by nondiphtheria corynebacteria.//L. Rev. Infec. Dis. - 1982. - 4. - N 6. - P.1220-1235.

7. Tsukamura M., Shimoide H., Kita N. et. al. Lung disease due to Mycobacteria other than Mycobacterium tuberculosis in Japanase national Chest hospitals. - Kekkaku. - 1976. - 51. - N 4. - P.99-107.

Формула изобретения

1. Диагностический аллерген, используемый в аллергической диагностике инфекционных болезней, содержащий в качестве активного белка аллерген из микобактерий, отличающийся тем, что в качестве аллергена для диагностики родококковой инфекции используется активный белок, получаемый из культуральной жидкости Rhodococcus bronchialis.

2. Способ изготовления аллергена из культуральной жидкости бактерий осаждением активного белка трихлоруксусной кислотой и сульфатом аммония с последующим диализом, отличающийся тем, что осаждение белка из культуральной жидкости Rhodococcus bronchialis производят хлористым натрием в изоэлектрической точке.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2