Способ получения аллергена жидкого листериозного листерина для внутрикожной пробы

 

Изобретение относится к области медицины и может быть использовано для диагностики листериоза. Сущностью способа является получение аллергена листериозного для внутрикожной пробы путем наращивания культуры вакцинного штамма АУФ, инактивации, лиофильного высушивания, с проведением гидролиза 1% раствором уксусной кислоты на водяной бане в течение 6 часов при температуре 100±1^oС, затем в холодильнике в течение 18±1 часов. Техническим результатом является повышение специфичности и специфической активности препарата и возможность его промышленного получения.

Изобретение относится к препаратам для диагностирования физиологического состояния организма посредством постановки внутрикожной пробы, а именно для диагностики листериоза у людей и животных.

Известен способ приготовления аллергена, заключающийся в инактивации полученной двухсуточной культуры листерий прогреванием при 100^oС. Антиген из убитых нагреванием культур вызывал сильные реакции, как у иммунизированных, так и у контрольных животных и обладал неспецифическими свойствами, что является недостатком этого способа (1).

Известен способ получения аллергена, основанный на получении суточной агаровой культуры листерий, которую дважды промывали фосфатно-буферным физиологическим раствором (рН 7,4), в виде густой взвеси (до млрд. микробных клеток в 1 мл) подвергали ежедневному замораживанию и оттаиванию в течение 30 дней. После этого взвесь прогревали в течение 1,5 ч при 100^oС на водяной бане, затем центрифугировали до полной прозрачности надосадочной жидкости. Затем надосадочную жидкость прогревали в течение часа в тех же условиях, после этого в различных разведениях (1:100; 1:500; 1:1000; 1:10000) испытывали как аллерген на здоровых и инфицированных кроликах. Для внутрикожных проб было принято разведение 1:1000, которое в дозе 0,1 мл вызывало у 4-х из 5 пораженных кроликов гиперемию до 7-12 мм в диаметре через 24-48 часов и не вызывало никакой реакции у 4 здоровых кроликов (2).

Недостатком этого способа является длительность процесса получения препарата и то, что он может быть применен только в научных целях, а не для промышленного производства препарата.

Целью изобретения является повышение эффективности получения препарата - аллергена листериозного для диагностики листериоза у людей и животных.

Сущность изобретения заключается в том, что в способе получения жидкого аллергена листериозного, основанном на наращивании бакмассы и ее инактивации, проводят слабый гидролиз инактивированной бакмассы листериозного микроба после термической денатурации балластных белков.

Существенным отличительным признаком является следующее действие в способе получения аллергена жидкого листериозного - листерина для внутрикожной пробы: слабый гидролиз инактивированной и обезжиренной бакмассы листериозного микроба после термической денатурации балластных белков с последующей фильтрацией с корректировкой рН.

Этот отличительный признак необходим и достаточен для достижения технического результата заявляемого изобретения - ускорения процесса получения аллергена листериозного жидкого - листерина и возможность промышленного получения его. Это достигнуто благодаря проведенным исследованиям по производству аллергенного препарата, изучению свойств препарата, постановке аллергической пробы на морских свинках. Бакмассу листериозного микроба наращивали, лиофильно высушивали, инактивировали с последующим обезжириванием эфиром и хлороформом, проводили гидролиз обезжиренной бакмассы 1,0%-ным раствором уксусной кислоты, причем гидролиз шел при 100^oС на водяной бане в течение 6 ч и продолжался в холодильнике в течение 18±1 ч на шуттель-аппарате. Полученную взвесь фильтровали и корректировали рН до 7,2-7,5 10%-ным NaOH на ионометре. После определения концентрации белка на спектрофотометре препарат разливали в ампулы и стерилизовали.

Пример. Аллерген изготовлен из бакмассы вакцинного листериозного штамма АУФ. Для этого брали культуру вакцинного штамма АУФ, наращивали ее в матрацах на глюкозо-глицериновом агаре. Культивирование культуры производили при 37^oС. Параллельно контролировали чистоту культуры просмотром мазков, окрашенных по Грамму. Культуру смывали физиологическим раствором. Инактивирование бакмассы производили путем автоклавирования бакмассы при 1,5 атм в течение 1 часа. После проверки стерильности бакмассу лиофильно высушивали на лиофильной установке ТГ-5. Обезжиривание бакмассы производили эфиром и хлороформом в аппарате Сокслета. Гидролиз проводили 1% раствором уксусной кислоты на водяной бане в течение 6 часов при температуре 100±1^oС, а затем в холодильнике в течение 18±1 ч на шуттель-аппарате. Полученную смесь пропускали через фильтр, корректировали рН до 7,2-7,5 10% раствором NaOH. Концентрация белка, определяемая на спектрофотометре, равнялась 1,8 мг/мл. Аллерген запаивали в ампулы и автоклавировали при 1 атм 30 мин.

Препарат нетоксичен. Контроль токсичности определяли на трех белых мышах путем внутрибрюшинного введения смеси содержимого трех ампул по 0,5±0,05 мл.

Контроль препарата на специфическую активность проводилил на морских свинках породы "Arune" весом 300-350 г, в количестве 14 штук. Животных иммунизировали однократным введением 500 млн. м.к. подкожно в обе лапки по 250 млн. м. к. в каждую. Через 2,5 недели в депиллированную кожу боковой поверхности живота каждого животного, строго внутрикожно, асептически вводили аллерген листериозный в дозе 0,1 мл. Кожные реакции учитывались через 48 часов. На месте введения наблюдался отек и побледнение кожи, у некоторых свинок гиперемия. Отек и гиперемия равнялись 10•10 мм. Отек исчезал через четверо суток.

Для проверки наглядности постановку пробы проводили также на белых мышах весом 18-20 г. Для этого иммунизированным мышкам в подушечки задних лапок вводили аллерген в дозе 0,1 мл. Опыт показал, что реакция более наглядна у морских свинок.

Для проверки специфичности параллельно проводили иммунизацию морских свинок Staphyllococcus aureus и Streptococcus faecalis в той же дозе. После постановки аллергической пробы аллергеном реакция была отрицательной.

Источники информации 1. Егорова А. П. Мартынин М.Я., Малышев А.Н. Диагностическое значение внутрикожной аллергической пробы при листериозе. //ЖМЭИ. 1970 - 2. С.62.

2. Егорова А. П. Мартынин М.Я., Малышев А.Н. Диагностическое значение внутрикожной аллергической пробы при листериозе. //ЖМЭИ. 1970 - 2. С.63 (прототип).

3. Тропина Т. Д. , Хашимова П.Р., Кондратьева Л.А. Изучение антигенов листерий и выделенных из них белковых фракций. //ЖМЭИ. - 1988 - 9. С.16-19.

Формула изобретения

Способ получения аллергена листериозного для внутрикожной пробы, отличающийся тем, что наращивают культуру вакцинного штамма АУФ, инактивируют автоклавированием при 1,5 атм в течение 1 ч, лиофильно высушивают, обезжиривают эфиром и хлороформом, проводят гидролиз 1% раствором уксусной кислоты на водяной бане в течение 6 ч при 100±1^oС, затем в холодильнике в течение 18±1 ч, полученную смесь пропускают через фильтр и корректируют рН 10% раствором NaOH до 7,2-7,5.