Питательная среда для выделения и выращивания микобактерий

 

Изобретение относится к биотехнологии и предназначено для бактериологической диагностики туберкулеза у животных и людей. Среда содержит в качестве источника азота дрожжевой аутолизат и аммоний щавелевокислый, в качестве источника углерода - глицерин и н-алканы, магний сернокислый, натрий лимоннокислый, железоаммиачные квасцы, калий фосфорнокислый однозамещенный, источник ростовых веществ - картофельный экстракт, а н-алканы вносятся в среду до стерилизации. Изобретение позволяет повысить скорость роста, частоту индикации микобактерий из различных биоматериалов. 3 табл.

Изобретение относится к медицине и ветеринарии, в частности для высевания патологического материала на индикацию микобактерий при бактериологической диагностике туберкулеза человека и животных.

Для бактериологической диагностики туберкулеза наиболее широко используют плотные питательные среды Левенштейна-Йенсена, Финна-П и менее популярны - глицериновый картофель, среда Петроньяни, "Новая" (Г.Г. Мордовского), среды 6 и 9 предложенные В.А. Аникиным с соавт. и т.д. Все перечисленные среды мало отличаются по химическому составу, физическим свойствам одна от другой и состоят из солевой основы с добавлением куриных яиц. Соответственно, частота индикации микобактерий и скорость их роста на разных средах незначительно расходятся в ту или иную сторону.

Известно также, что среды для микобактерий должны быть богатыми белком в виде легко усвояемых аминокислот как аспарагиновая, глутаминовая, аланиновая и, в меньшей степени, гликокол. Кроме того, испытано значительное количество веществ, которые могут быть использованы в качестве источника углерода. Поэтому роль глицерина в росте микобактерий туберкулеза на искусственных питательных средах считают исключительно важной. Общеизвестно огромное значение ростовых факторов в питании микобактерий, особенно первых генераций, полученных из патологического материала. Такое положение, вероятно, связано с тем, что развивающиеся в тканях макроорганизма микобактерии туберкулеза теряют способность самостоятельно синтезировать вещества, абсолютно необходимые для их роста и размножения, т.е. теряют способность биосинтезировать витаминоподобные факторы роста [1] . Поэтому исследования, направленные на дальнейший поиск наиболее пригодных компонентов для изготовления питательных сред, богатых белком, углеводами и ростовыми веществами, вместе с тем дешевыми и доступными для практических и научных лабораторий, считаются обоснованными и оправданными.

Недостатками упомянутых питательных сред являются низкая чувствительность индикации микобактерий при посевах гомогенатов патологического материала и малая скорость роста, что в конечном итоге удлиняет сроки диагностики, идентификации и лекарственной чувствительности выделенных культур.

Известна питательная среда, предложенная Г.К. Самилло и Е.Н. Ромашевой (1988), в которой в качестве источника азота (взамен L-аспарагина) содержится дрожжевой аутолизат и аммоний щавелевокислый, а в качестве источника углерода - глицерин. Такая модификация позволила авторам повысить частоту индикации микобактерий при посевах гомогенатов патологического материала и увеличить скорость их роста в сравнении с контрольной средой - Финн-П.

Т.В. Коронелли и Н.И. Фадеева сконструировали среду, в которой единственным источником углерода и энергии является жидкий очищенный парафин (смесь н-алканов от G₁₂ до G₁₈), а источником азота служит минеральная смесь аммония. Авторы утверждают, что на этой среде туберкулезные микобактерии образуют обильную бакмассу в 6-7 раз быстрее, чем на среде Левенштейна-Йенсена.

Наиболее близкой по технической сущности к заявляемому изобретению является среда, предложенная Р.А. Нуратиновым (Патент на изобретение 2121000 от 27 октября 1988 г.), содержащая в качестве источника азота дрожжевой аутолизат и аммоний щавелевокислый, а в качестве источника углерода - смесь н-алканов в следующих количествах: Куриные яйца, шт - 12 Дрожжевой аутолизат, мл - 30 Магний сернокислый, г - 0,15 Натрий лимоннокислый, г - 0,3 Железоаммиачные квасцы, г - 0,015 Калий фосфорнокислый 1 зам., г - 6,0 Щавелевокислый аммоний, г - 1,5 Глицерин, мл - 6 Дистиллированная вода, мл - До 300
н-Алканы, капли - 4-5
Малахитовая зелень, мл 2%-ного р-ра - 10
Недостатками этой среды являются низкая индикация микобактерий при посеве гомогенатов патологического материала и мокроты, малая скорость роста. Кроме того, процесс подготовки среды к посеву осложняется необходимостью нанесения н-алканов на поверхность готовой среды в пробирках за сутки до высева, что сопряжено с дополнительными затратами труда, рабочего времени и расходами.

Целью изобретения является повышение эффективности использования питательной среды для выделения и выращивания микобактерий за счет изменения состава среды и упрощение методики ее изготовления.

Поставленная цель достигается тем, что среда, предложенная Р.А. Нуратиновым, содержащая в качестве источника азота дрожжевой аутолизат и аммоний щавелевокислый, в качестве источника углерода - глицерин и н-алканы, содержит дополнительно в качестве источника ростовых веществ - картофельный экстракт, а н-алканы вносятся в среду до стерилизации в следующих количествах компонентов:
Куриные яйца, шт - 12
Дрожжевой аутолизат, мл - 35
Магний сернокислый, г - 0,15
Натрий лимоннокислый, г - 0,3
Железоаммиачные квасцы, г - 0,015
Калий фосфорнокислый 1 зам., г - 6,0
Щавелевокислый аммоний, г - 1,5
Глицерин, мл - 6
Картофельный экстракт, мл - 150
Дистиллированная вода, мл - 150
н-Алканы (G₁₂-G₁₈), об.% - 4,5
Малахитовая зелень, мл 2%-ного раствора - 10
Сопоставительный анализ с прототипом позволяет сделать вывод, что заявляемый состав среды отличается от известной введением нового компонента, а именно экстракта картофеля и количественным составом компонентов. Таким образом, заявляемое техническое решение соответствует критерию "новизна". Анализ известных составов сред, используемых для выделения и выращивания микобактерий, показывает, что картофель используется в изготовлении питательных сред (глицериновый картофель, среда Петроньяни, среда Гельберга). Однако ее использование в этих средах (в виде кусочков или картофельной муки) в сочетании с другими компонентами не обеспечивает средам такие свойства, которые они проявляют в заявляемом решении, а именно значительное обогащение углеродом и ростовыми веществами плотной яичной среды и внесением н-алканов в среду до ее стерилизации и, как следствие, упрощается методика изготовления при улучшении качества. Таким образом, данный состав компонентов придает среде новые свойства, что позволяет сделать вывод о соответствии заявляемого решения критерию "существенные отличия".

Для экспериментальной проверки заявляемого состава среды были подготовлены 4 серии в различных вариантах, отличающиеся количественным содержанием добавляемых компонентов. Для этого предварительно готовили солевой состав, растворяли в теплой дистиллированной воде и стерилизовали при 1 атм в течение 20 мин. Стерильный дрожжевой аутолизат добавляли к солевому раствору перед смешиванием со сбитыми яйцами. Туда же вносили жидкий парафин (смесь н-алканов) и экстракт картофеля. В стерильную колбу с бусами выливали 12 куриных яиц, встряхивали после добавления каждого яйца до образования однородной массы, доливали 10 мл 2%-ного водного раствора малахитового зеленого и 300 мл приготовленного солевого раствора. Затем фильтровали через марлю, разливали по пробиркам и выдерживали в аппарате свертывания в наклонном положении при температуре 85^oС в течение 45 мин. Готовые серии сред засевали микобактериями разных видов лабораторных штаммов (одномоментно, из одного разведения бакмассы). В табл. 1 представлены полученные свойства образцов сред в сравнительном аспекте.

Из таблицы следует, что на предлагаемой среде ( 3) микобактерии лабораторных штаммов растут значительно быстрее, чем на средах аналога и прототипа ( 1, 2).

Результаты сравнительного изучения эффективности различных питательных сред для выделения микобактерий из различного биоматериала и музейного штамма М. tuberculosis Н₃₇Rv отражены в табл. 2 и 3. Как видно, скорость роста и частота индикации микобактерий на предлагаемой среде была значительно выше, чем на средах аналога и прототипа. Следует также учесть, что при предлагаемом варианте нет необходимости наносить жидкий парафин на поверхность готовой среды, что на сутки ускоряет диагностику и сокращает трудовые и материальные расходы.

Таким образом, использование предлагаемой среды в бактериологии туберкулеза позволит ускорить диагностику, ускорить идентификацию, лекарственную чувствительность микобактерий, повысить частоту индикации и скорость роста микобактерий при посевах гомогенатов биоматериалов от людей и животных, исключить из состава среды остродефицитные ингредиентыв.

ЛИТЕРАТУРА
1. Васильев В. Н. Микобактериозы и микозы легких (возбудители - морфология, биология, диагностика). - София. "Медицина и физкультура". - 1971. - 383 с.

2. Самилло Г.К., Ромашова Е.Н. Пути повышения высеваемости и ускорения роста микобактерий туберкулеза на модифицированной среде Финна-П. // Проблемы туберкулеза. - 1988. - 12. - с.62-63.

3. Коронелли Т.В., Фадеева Н.И. Культивирование туберкулезных и условно-патогенных микобактерий на среде с н-алканами // Проблемы туберкулеза. - 1986. - 9. - с.44-46.

4. Нуратинов Р.А. Питательная среда для выращивания микобактерий. Патент на изобретение 2121000 от 27 октября 1998 года.

Формула изобретения

Питательная среда для выделения и выращивания микобактерий, содержащая куриные яйца, дрожжевой аутолизат, магний сернокислый, натрий лимонокислый, железоаммиачные квасцы, калий фосфорнокислый однозамещенный, щавелевокислый аммоний, глицерин, 2%-ный раствор малахитовой зелени, дистиллированную воду, н - алканы, отличающаяся тем, что она дополнительно содержит картофельный экстракт с количественным составом компонентов:
Куриные яйца ( шт) - 12
Дрожжевой аутолизат (мл) - 35
Магний сернокислый (г) - 0,15
Натрий лимоннокислый (г) - 0,3
Железоаммиачные квасцы (г) - 0,015
Калий фосфорнокислый однозамещенный (г) - 6,0
Щавелевокислый аммоний (г) - 1,5
Глицерин (мл) - 6,0
2%-ный Раствор малахитовой зелени (мл) - 10
Картофельный экстракт (мл) - 150,0
н-Алканы (С₁₂-С₁₈), об.% - 4,5
Дистиллированная вода (мл) - 150,0в

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2