Определение внутриклеточных концентраций цистеина и глутатиона

 

Изобретение может быть использовано в медицине и биотехнологии для определения внутриклеточной концентрации глутатиона. Клеточная культуральная среда включает забуференный, не содержащий сыворотки раствор, содержащий следующие ингредиенты: углевод, выбранный из группы, состоящей из глюкозы и соединения, биологически способного продуцировать глюкозу в лимфоцитах, биологически применимую форму пантотеновой кислоты, холин или биологически применимую форму вещества, способного продуцировать холин в лимфоцитах, неорганические ионы, включающие хлорид, фосфат, кальций, магний, калий, натрий и железо в биологически усваиваемой форме, L-бутионин-[8.К.]-сульфоксимин, деионизированную воду, и митоген в количестве, эффективном для стимуляции указанных лимфоцитов; причем указанный забуференный, не содержащий сыворотки раствор имеет рН в интервале от 6,8 до 7,6. Способ определения внутриклеточной концентрации глутатиона включает инокулирование клеточной культуральной среды лимфоцитами, дальнейшее ее инкубирование и сравнение с контролем. Предложенная клеточная культуральная среда и способ эффективны для определения уровней внутриклеточной функции глутатиона в лимфоцитах и для биохимического анализа антиоксидантной функции указанных лимфоцитов. 2 с. и 4 з.п. ф-лы, 6 табл.

Настоящее изобретение относится в основном к области питания и биохимии и к метаболизму клеточного глутатиона. Более конкретно, настоящее изобретение относится к измерению уровней внутриклеточных функций цистеина и глутатиона с тем, чтобы обеспечить одновременное измерение способности индивидуума к предотвращению дегенеративного заболевания и его сопротивления оксидативному стрессу.

В настоящее время общепринято, что ряд состояний здоровья человека, включая старение, артриты, рак, атеросклероз, инфаркт миокарда, удар, вирусную инфекцию, заболевания легких, кишечника и нейродегенеративные заболевания, может развиваться или усугубляться в результате присутствия реакционноспособных молекул кислорода, обычно называемых свободными радикалами. Эти вредные молекулы обычно являются побочными продуктами физиологических процессов и возникают в результате метаболизма кислорода; например, в результате клеточного дыхания или функционирования иммунной системы (уничтожения чужеродных материалов), и в результате многочисленных ферментативных реакций, существенных для метаболизма. Кроме того, свободные радикалы обычно существуют в окружающей среде. Источники свободных радикалов в окружающей среде включают дым, ионизирующую радиацию, загрязнения воздуха, химикалии (канцерогены, многие нефтехимические соединения, биоциды, красители, растворители, цитостатические лекарства и т.д.), токсичные тяжелые металлы и окисленные или протухшие жиры.

Некоторые из наиболее известных свободных радикалов являются надперекисями, гидроксильными радикалами, синглетным кислородом и перекисями, включая перекиси водорода. Железо и медь в определенных валентных состояниях могут являться катализаторами образования свободных радикалов, которые, хотя и являются короткоживущими, вызывают цепную реакцию образования радикалов с последующим возбуждением измененных, поврежденных биологических молекул.

Свободные радикалы токсичны по отношению к живым организмам, так как вызывают структурные повреждения биологических молекул. Повреждения молекул могут привести к изменениям генетических кодов, нарушению целостности клеточных мембран, неврологическим нарушениям, разбалансированию эндокринной системы, усилению аллергий, разрушению эндотелия сосудов, к деградации суставов и к воспалениям.

Защита от вредных воздействий свободных радикалов связана с широким кругом молекул, называемых антиоксидантами. Свободные радикалы и побочные продукты вызываемых ими цепных реакций можно нейтрализовать и превратить в менее вредные продукты с помощью антиоксидантов. Такими антиоксидантами могут быть ферменты (такие, как супероксид-дисмутаза, каталаза, глутатион-пероксидаза), незаменимые питательные вещества (например, бета-каротин, витамины С и Е, селен) или широкий спектр эндогенных соединений (таких как глютатион) или пищевые соединения (такие как биофлаваноиды). Таким образом, организм человека располагает природными нейтрализаторами свободных радикалов.

Исследования организма человека показали, что недостаток потребления антиоксидантов, находящихся в продуктах питания, связан с высокой степенью риска возникновения раковых заболеваний, сердечно-сосудистых заболеваний, артритов, катаракт и т.д. Также более высокое потребление антиоксидантов, находящихся в продуктах питания, связано с уменьшением вероятности возникновения хронических дегенеративных заболеваний. Обнадеживающие исследования показывают, что введение антиоксидантных пищевых добавок может оказать благоприятное терапевтическое воздействие на человека.

Лабораторные анализы антиоксидантного статуса до сих пор не стали рутинными по ряду причин. Свободные радикалы чрезвычайно быстро исчезают и обычно недоступны для непосредственных измерений. Можно измерять побочные продукты повреждений, вызываемых свободными радикалами, такие как малоновый диальдегид (MDA), реакционноспособные вещества тиобарбитуровой кислоты (TBARS) или перекиси липидов в сыворотке или моче; однако эти тесты могут быть показателями оксидативного стресса, но отражать всего лишь повреждения определенных типов биомолекул (по большей части, полиненасыщенных липидов и нуклеиновых кислот). Тем не менее способы измерения уровней антиоксидантных питательных веществ в сыворотке или клетках и активностей антиоксидантных ферментов в клетках могут помочь определить недостаточные уровни содержания специфических компонентов.

Глутатион является превосходным клеточным антиоксидантным веществом, которое в достаточном количестве содержится в цитоплазме, ядрах и в митохондриях. В дополнение к мощной антиоксидантной функции глутатиона, он служит также мощным антитоксином, обеспечивая организму возможность удаления многочисленных ксенобиотных и канцерогенных соединений. Далее, глутатион является существенным для опосредованных клетками иммунных функций, и это является критическим для сохранения целостности красных кровяных клеток. Более того, обычно оказывается, что дефицит в системе глутатиона ведет к существенному старению клеток, и, в конечном счете, к гибели клеток.

Концентрация клеточного глутатиона сильно сказывается на антиоксидантных функциях; и ограничение питательных веществ, работа и оксидативный стресс оказывают значительное воздействие на концентрации клеточного глутатиона. В оксидативных условиях функция глутатиона может существенно ослабляться в результате связывания с ксенобиотиками и удаления коньюгатов глутатиона и дисульфидов глутатиона из поврежденных клеток. Значительная часть глутатиона может оказаться связанной с протеином в процессе сильного оксидативного стресса. Однако, к счастью, такие соединения, как N-ацетил-L-цистеин, доступны для усиления внутриклеточной функции глутатиона.

Глутатион синтезируется в ряде биохимических реакций с участием АТР, магния и трех аминокислот: глицина, глутамата и цистеина. Обычно скорость синтеза гамма-глутамилцистеина определяет скорость синтеза глутатиона, и сульфгидрильная группа цистеина обеспечивает биологическую эффективность глутатиона. Таким образом, определение доступности цистеина существенно для определения функциональной пригодности глутатиона и для оценки антиоксидантной функции.

Определение цистеина и глутатиона помогает также для оценки дефицита селена. Когда глутатион функционирует в качестве антиоксиданта, он реагирует с перекисью водорода с образованием дисульфида глутатиона в реакции, катализируемой глутатион-пероксидазой. Глутатион-пероксидазе необходим селен в качестве функционального кофактора. Таким образом, соответствующее функционирование цистеина, наряду с недостаточными или средними результатами SPECTROX^ТМ, является показателем внутриклеточного дефицита селена и требует дальнейшей проверки.

До сих пор отсутствуют простые, дешевые и эффективные биохимические способы оценки уровней внутриклеточных функций цистеина и глутатиона в организме человека и, следовательно, способности индивидуума бороться с оксидативным стрессом. Настоящее изобретение восполняет эту давно назревшую в области биохимии необходимость.

Цель настоящего изобретения состоит в создании клеточной культуральной среды, пригодной для определения уровней внутриклеточной функции глутатиона в лимфоцитах и для проведения биохимического анализа антиоксидантной функции, причем указанная среда включает забуференный, не содержащий сыворотки, раствор, включающий следующие ингредиенты: углевод, выбранный из группы, состоящей из глюкозы или соединения, которое биохимически способно продуцировать глюкозу в клетках; биологически применимую форму пантотеновой кислоты, холин или биологически усвояемую форму вещества, способного продуцировать холин в клетках; неорганические ионы, включая хлорид, фосфат, кальций, магний, калий, натрий и железо в биологически усвояемой форме; L-бутионин-[S.R.]-сульфоксимин; деионизированную воду; и такое количество митогена, которого достаточно для стимуляции анализируемых лимфоцитов; причем рН указанного забуференного, не содержащего сыворотки раствора находится в интервале значений от 6,8 до 7,6; и где указанная клеточная культуральная среда отличается тем, что она позволяет эффективно определять уровни внутриклеточной функции глутатиона в лимфоцитах, дефицит питательных веществ, их несоответствие и нарушение баланса, и анализировать биохимически антиоксидантную функцию лимфоцитов.

Одно из воплощений настоящего изобретения включает дополнение клеточной среды настоящего изобретения питательной добавкой, выбранной из группы, состоящей из биологически усваиваемых форм аминокислот и витаминов, причем проверяют, чтобы питательное вещество в питательной добавке либо отсутствовало, либо присутствовало в ограниченных или ингибирующих количествах.

Другой целью настоящего изобретения является создание способа определения уровней внутриклеточной функции глутатиона и биохимического анализа клеточной антиоксидантной функции индивидуума; этот способ включает в себя стадии: инокулирования клеточной культуральной среды настоящего изобретения лимфоцитами подлежащего тестированию индивидуума; инкубирования инокулированной клеточной культуральной среды; и сравнения реакции лимфоцитов с усредненной реакцией лимфоцитов, полученных от контрольной группы индивидуумов.

Следующей целью настоящего изобретения является создание клеточной культуральной среды, пригодной для определения уровня внутриклеточной функции цистеина, и осуществления биохимического анализа антиоксидантной функции лимфоцитов человека, причем указанная среда, содержащая забуференный, не содержащий сыворотки раствор содержит следующие ингредиенты: углеводород, выбранный из группы, состоящей из глюкозы или соединения, которое биохимически способно продуцировать глюкозу в клетках; биологически усваиваемую форму пантотеновой кислоты, холин или биологически применимую форму вещества, способного продуцировать холин в клетках; неорганические ионы, включая хлорид, фосфат, кальций, магний, калий, натрий и железо в биологически усваиваемой форме; гидроперекись кумола; деионизированную воду; N-ацетил-L-цистеин; и такое количество митогена, которого достаточно для стимуляции анализируемых лимфоцитов; причем рН указанного забуференного, не содержащего сыворотки раствора находится в интервале значений от 6,8 до 7,6; и где указанная клеточная культуральная среда отличается тем, что она эффективно позволяет определять уровни внутриклеточной функции глутатиона в лимфоцитах, дефицит питательных веществ, их несоответствие и нарушение баланса, и анализировать биохимически антиоксидантную функцию лимфоцитов.

Одно из воплощений настоящего изобретения включает дополнение клеточной среды настоящего изобретения питательной добавкой, выбранной из группы, состоящей из биологически усваиваемых форм аминокислот и витаминов, причем проверяют, чтобы питательное вещество в питательной добавке либо отсутствовало, либо присутствовало в ограниченных или ингибирующих количествах.

Дополнительной целью настоящего изобретения является создание способа определения уровней внутриклеточной функции цистеина и биохимического анализа клеточной антиоксидантной функции индивидуума; этот способ включает в себя стадии: инокулирования клеточной культуральной среды настоящего изобретения лимфоцитами подлежащего тестированию индивидуума; инкубирования инокулированной клеточной культуральной среды; и сравнения реакции лимфоцитов с усредненной реакцией лимфоцитов, полученных от контрольной группы индивидуумов.

Другие и дополнительные аспекты, отличительные особенности и преимущества настоящего изобретения, будут очевидны из описания предпочтительных в настоящее время воплощений настоящего изобретения. Эти воплощения представлены с целью раскрытия изобретения.

Настоящее относится к способу, который можно использовать для биохимических уровней внутриклеточных функций цистеина и глутатиона в лимфоцитах человека. Такие анализы отражают физиологическое здоровье антиоксидантной системы индивидуума в периферических лимфоцитах. Способ настоящего изобретения позволяет точно оценить внутриклеточную функцию цистеина и глутатиона в лимфоцитах человека, с тем, чтобы можно было предпринять терапевтические меры для улучшения антиоксидантного профиля индивидуума.

Рассматриваемый способ, в котором используют лимфоциты, представляет определенные преимущества, так как лимфициты: (1) являются хозяевами опосредованной клетками иммунной системы и их легко стимулировать к росту (митогенез); (2) отражают усредненный по времени долговременный статус питательных веществ (срок жизни лимфоцитов около шести месяцев); (3) обладают схемой метаболизма, общей с другими клетками, и (4) легко получить стандартным способом взятия крови из вены.

Определяя рост лимфоцитов для оценки внутриклеточной функции цистеина и глутатиона, способ настоящего изобретения отражает уникальное состояние каждого пациента, которое меняется в широких пределах. Поэтому терапевтическое лечение можно приспособить для специфических биохимических требований конкретного индивидуума, а не для "среднего" пациента, как это определяют по так называемым нормам.

Специалисту должно быть очевидно, что различные изменения и модификации можно внести в раскрытое здесь изобретение, не выходя из объема и сути настоящего изобретения.

Нижеследующие примеры приведены с целью иллюстрации различных воплощений изобретения и никоим образом не ограничивают настоящее изобретение.

ПРИМЕР 1.

Взятие крови у пациента Для способа настоящего изобретения необходимы два образца по 10 мл цельной крови пациента, консервированные кислым цитратом-декстрозой. При этом не требуется голодать.

Все, что необходимо - это приспособления для взятия крови. Можно провести анализ по способу настоящего изобретения или же взятую у пациента кровь можно перенести при комнатной температуре в соответствующую лабораторию. Не требуется центрифугирования крови. Полные результаты тестов обеспечивают убедительный, научно-обоснованный анализ профиля глутатиона или цистеина у пациента.

ПРИМЕР 2.

Обработка образцов: Выделение клеток Все процедуры проводят, используя стерильные инструменты в боксе с ламинарным потоком для обеспечения стерильности. Каждому из образцов крови пациента присваивают регистрационный номер при поступлении в лабораторию. Этот регистрационный номер используют как номер образца, чтобы обеспечить слежение на всех стадиях обработки, сбора и анализа результатов. Каждую тестовую ампулу, центрифужную пробирку, микротитровальную пластину и распечатку данных помечают этим номером (регистрационным) образца.

Каждый образец пациента состоит из (2) двух пробирок вакуумного типа, содержащих кислый цитрат-декстрозу (с желтыми крышками), в каждой из которых находится 8 мл цельной крови. После присвоения регистрационного номера (образца) цельную кровь перемешивают, переворачивая пробирку 6 раз. Две пробирки цельной крови объединяют в 50 мл одноразовой центрифужной пробирке.

Из каждого образца асептически отбирают аликвоты по 500 мкл и помещают в пробирки размером 12•17 мм. Эти аликвоты используют для подсчета клеток цельной крови с помощью счетчика клеток Coulter Cell Counter Model T540. Распечатку количества клеток цельной крови Coulter помечают регистрационным номером и подкалывают к карте пациента.

Для каждого образца приготавливают по две (2) пробирки с градиентом фиколла, добавляя по 5,0 мл Histopaque 1077 (Ficoll/Sodium Diatrizoat, Sigma Chemicals, St. Louis, Missouri) в каждую 15 мл коническую центрифужную пробирку. Используя 10 мл пипетку и электрическое приспособление для работы с пипеткой, 8 мл цельной крови медленно помещают в каждую из пробирок с градиентом фиколла. Пробирки с градиентом фиколла закрывают и центрифугируют при 2160 об/мин в течение 20 мин.

После окончания центрифугирования пробирки с градиентом осторожно извлекают из центрифуги так, чтобы избежать нарушения градиента. Светлый слой кровяного сгустка (содержащий лимфоциты), обнаруживающийся у границы поверхности среднего слоя фиколла, переносят, используя 5 мл пипетку, в 15 мл одноразовую коническую центрифужную пробирку. Этот светлый слой кровяного сгустка объединяют со смесью забуференного фосфатом физиологического раствора - 0,72% раствора глюкозы (PBS-G) до конечного объема 12 мл. Пробирку закрывают и переворачивают 6 раз, чтобы смешать светлый слой кровяного сгустка и PBS-G.

Пробирки, содержащие светлый слой кровяного сгустка и PBS-G, центрифугируют при 2160 об/мин в течение 5 мин. После центрифугирования надосадочную жидкость отсасывают с клеточного осадка и сливают. Клеточный осадок снова суспендируют в 12 мл PBS-G, затем 6 раз переворачивают, обеспечивая равномерное распределение клеточного осадка. Затем образец снова центрифугируют, как указано выше.

После второго центрифугирования надосадочную жидкость отсасывают и сливают. Клеточный осадок взбалтывают и смешивают с PBS-G, используя 5 мл пипетку, присоединенную к электрическому устройству для работы с пипеткой. После получения гомогенной клеточной суспензии аликвоты по 200 мкл этой суспензии переносят в пробирки размером 12•17 мм. Эти аликвоты используют для подсчета исходной клеточной суспензии (ICS) с помощью счетчика для подсчета клеток модели Т540.

Распечатку этих аликвот помечают номером образца и подкалывают к карте. Если число лимфоцитов составляет величину от 3,9 до 1,2 тысяч клеток на мм³ (Ткл/мм³), образец готов для инокуляции пластины. Объем клеточной суспензии, который нужно добавить, представлен в таблицах I и IV. Если число лимфоцитов больше чем 3,9 Ткл/мм³, образец нужно снова разбавить. Однако если число лимфоцитов меньше чем 1,2 Ткл/мм³, образец исключают.

Количество дополнительного HBS-G, которое необходимо для соответствующего повторного разбавления, определяют, используя следующий расчет: C₁,V₁=C₂V₂ С=концентрация лимфоцитов (Ткл/мм³) V=объем Если С₂= 3,0 Ткл/мм³, это и есть нужная концентрация лимфоцитов в конечной суспензии. Например, если исходное количество в клеточной суспензии из 6,0 мл=(LY#) 5,6 Ткл/мм³ C₁,V₁=C₂V₂ (5,6) (6,0 мл)=(3,0) (X) X=11,2 мл конечный объем Соответствующий объем PBS-G добавляют к вновь суспендированным клеткам до конечного объема 11,2 мл. В этом примере следует добавить 5,2 мл к исходным 6,0 мл до конечного объема 11,2 мл. Необходимый объем PBS-G добавляют к (ИКС), чтобы получить значение для конечной клеточной суспензии (ККС). Количество LY# и объем PBS-G регистрируют на тестовой карте SPECTROX^ТМ.

После повторного разбавления аликвоты по 200 мкл вновь разбавленной клеточной суспензии переносят в новые 12•75 мм ампулы, и подсчет клеток осуществляют, как указано выше. Распечатку для повторного разбавления клеточной суспензии (LY# конечной клеточной суспензии) прикрепляют к карте и записывают инокулированный объем.

ПРИМЕР 3. ОЦЕНКА КОНЦЕНТРАЦИИ ГЛУТАТИОНА
А. Инокулирование пластины
Конечную клеточную суспензию помещают в стерильный лоток и микротитровальные пластины, содержащие среду, помещают в бокс с ламинарным потоком. Используя 12-канальную ручную микропипетку, снабженную стерильными 0-50 мкл наконечниками с фильтрами, в каждую из ячеек пластины помещают определенное количество (в соответствии с таблицей I) конечной клеточной суспензии. Ниже указаны объемы, которые используют для инокуляции пластины в расчете на количества лимфоцитов в конечной клеточной суспензии (LY#).

После добавления клеток к среде пластины накрывают и помещают в СO₂ инкубатор, температуру в котором поддерживают 37^oС, на 96 часов.

В. Введение метки
Все процедуры введения метки осуществляют в помещении для работы с радиоизотопами. Рабочий раствор меченного по тритию тимидина (³H-TdR) извлекают из холодильника и нагревают до 37^oС на водяной бане. Через 96 часов микротитровальные пластины извлекают из инкубатора. ³H-TdR рабочий раствор помещают в стерильный лоток, и 12-канальную ручную микропипетку, снабженную 0-50 мкл стерильными наконечниками с фильтром, используют для помещения 10 мкл ³H-TdR рабочего раствора в каждую ячейку микротитровальной пластины. Пластину возвращают в инкубатор с температурой 37^oС на 24 часа. Дату и инициалы лаборанта, осуществляющего введение метки, записывают на бланке образца.

С. Сбор материала
Все процедуры сбора осуществляют в комнате для работы с радиоизотопами. Один фильтр из фиброгласса (Packard Part # 6005416) помечают номером образца, используя карандаш 2. Включают вакуумный насос и температуру в термостате устанавливают 100^oС. Заполняют дистиллированной водой резервуар, присоединенный к харвестеру. Микротитровальные пластины извлекают из инкубатора через 24 часа после добавления ³H-TdR. Дату и инициалы лаборанта, осуществляющего сбор, регистрируют на бланке образца.

При открытом положении клеточного харвестера (Packard Model # C 9619) и экспонированных O-кольцах фильтр из стекловолокна помещают на харвестер, причем неровная сторона прилегает к O-кольцам. Клеточный харвестер закрывают и фильтр увлажняют дистиллированной водой из смывного лотка. Харвестер оставляют на вакуумном цикле (VAC). Крышку с микротитровальной пластины удаляют и пластину помещают под наконечники зонда харвестера. Пластину медленно поднимают на зонды харвестера до тех пор, пока наконечники зонда не коснутся дна пластины. После отсасывания среды остатки на донцах ячеек соскабливают наконечниками зонда медленными кругообразными движениями микротитровальной пластины. Такое соскабливание продолжают 10 секунд. Оставляя микротитровальную пластину в контакте с наконечниками зонда харвестера, соскабливание продолжают и нажимают кнопку "промывка" на 10 секунд. Жидкость отсасывают из ячеек, и вышеописанные стадии соскабливания повторяют. Пластину удаляют, промывочный лоток заполняют метанолом, лоток поднимают, метанол отсасывают и лоток опускают.

Харвестер открывают, причем фильтр прилегает к верхнему отделу и продолжают работу в режиме VAC в течение 5 секунд. Через 5 сек режим VAC отключают и фильтр удаляют с поверхности харвестера. Этот фильтр помещают неровной стороной вверх в сушилку на 10 минут. Фильтр извлекают из сушилки и охлаждают до комнатной температуры.

D. Определение радиоактивности
Все процедуры подсчета проводят в комнате для работы с радиоизотопами. Фильтр помещают в считывающую кассету неровной стороной вверх. Коллиматор, тонкую пластину из нержавеющей стали, которая удерживает фильтр на месте, помещают поверх фильтра. Кассету помещают в счетчик радиоактивности Packard Matrix 9600 Beta Particle Radioactivity Counter, и поток Q-газа (1,3% н-бутан в гелии) вводят в Matrix 9600. Нажимают кнопку "старт", активируя схему подсчета, и подсчитывают полную радиоактивность в каждой ячейке в течение 3 минут. Величина для каждого образца сохраняется на жестком диске Matrix 9600. Кроме того, распечатывается твердая копия необработанных результатов для радиоактивности.

Е. Обработка результатов
Результаты переносят с жесткого диска Matrix 9600 на 3,5-дискеты. Экспериментальные необработанные данные превращают в пригодные для публикации, используя преобразования в системе Microsoft Excel. Это сводится к вычитанию фоновых значений для каждой точки, вычислению среднего из трех значений для ячейки и представлению этого значения как процента от величины, полученной для контроля, которое принимают за 100%
F. Анализ результатов (Нормализация)
Антиоксидантную функцию глутатиона (GSH) исследуют с помощью анализа реакции роста лимфоцитов. Клетки помещают в химически определенную, не содержащую сыворотки среду, которая содержит 5 мкМ L-бутионин-(S,R)-сульфоксимина (BSO) и стимулируют рост клеток, добавляя соединение-митоген. Реакцию роста, измеряемую по включению ³H-тимидина, выражают как процент от контрольного роста. BSO подавляет синтез глутатион-трансферазы, которая необходима для синтеза глутатиона. Так, добавление BSO к среде и подавление им синтеза глутатиона сказывается на изменении роста клеток, что является показателем статуса глутатиона в лимфоцитах. Используемые дозы BSO (5 мкМ) были установлены в 1995 г.

Рост лимфоцитов индивидуума выражают как процент роста в среде с BSO или без него. Microsoft Excel используют для расчета отношения +BSO% роста к 100% роста (без BSO). Были введены отношения, полученные для более 1000 пациентов, и для них был проведен статистический анализ по стандартным Excel-программам для определения среднего и срединного значений, интервала и среднего отклонения для отношений. "Выпадающие" результаты, т.е. данные, расположенные вне интервала стандартной ошибки ±2, исключали из базы данных. Оставшиеся данные использовали для определения точек сравнения и установления интервала сравнения популяции.

Этот интервал сравнения популяции был представлен графически как график распределения рассеяния. Величина отношения нормального значения к значению для глутатиона была определена как превышающая 85% (>85%); поэтому любой пациент, у которого эта величина для глутатиона менее 85%, будет классифицироваться как индивидуум с дефицитом глутатиона.

G. оборудование и реагенты
В анализах настоящего изобретения было использовано следующее оборудование: бокс с ламинарным потоком; центрифуга Beckman GS-6; счетчик клеток (Coulter Model T540); 12 канальная автоматическая пипетка (5-500 мкл); электрический насос для пипеток (Drummond); стерильные 50 мл конические пластиковые пробирки с крышками; полипропиленовые трубочки размером 12 х 75 мм; стерильные центрифужные 15 мл конические пластиковые пробирки с крышками; пипетки (0-20, 0-200, 0-100 мкл диапазоны); стерильные стеклянные одноразовые пипетки - 5,0 мл и 10,0 мл; штатив для тестовых пробирок и наконечники для пипеток с аэрозольным фильтром (0-50 мкл) см. таблицу II.

Н. Растворы
Все растворы приготавливают, используя деионизированную воду степени чистоты для культуры тканей (tcd Н₂О).

1. Забуференный фосфатом физиологический раствор
Для получения забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) + 0,72% глюкозы (PBS-G), PBS приготавливают в соответствии с рекомендациями изготовителя, используя tcd Н20. Добавляют достаточное количество 10% раствора глюкозы, чтобы получить окончательную концентрацию глюкозы 0,72%. Раствор стерилизуют фильтрованием и хранят в холодильнике при 2-8^oС.

2. Исходная среда
Концентрированную (2Х) исходную среду получают следующим образом: (1) 23,80 г HEPES; (2) 14,02 г хлорида натрия; (3) 1,05 г двухосновного фосфата калия; (4) 0,241 г сульфата магния; (5) 1,0 мл (10 мкМ) аденингидрохлорида; (6) 30,0 мл (100 мМ) пирувата натрия; (7) 0,5 мл 0,5% фенольного красного; (8) 5,0 мл смеси антибиотиков; (9) 8,0 мл 5 н. гидроксида натрия; (10) 20,0 мл Fe/EDTA (1,0 мл FeSO₄/0,4 мМ Na₂EDTA) объединяют в tcd H₂O. После того, как все материалы тщательно перемешивают, рН устанавливают 7,60, используя 5 н. гидроксид натрия. Добавляя tcd H₂O, доводят до конечного объема 1,0 л. Полученный раствор стерилизуют, фильтруя через 0,2 мкМ фильтр, и хранят в холодильнике при 4^oС. Раствор стабилен в течение 4 недель.

3. Основная среда
Основную среду используют для 100% контроля за пластинами, и новый способ настоящего изобретения осуществляют следующим образом: после фильтрования следует использовать стерильные методики. Основную среду получают в боксе с ламинарным потоком; перечисленные в таблице III ингредиенты смешивают и, добавляя tcd Н₂О, доводят до нужного объема. Раствор стерилизуют вакуумным фильтрованием в стерильные бутылки. Добавляют соответствующий объем РНА исходного раствора.

4. Приготовление рабочего раствора L-бутионин-[S.R.]-сульфоксимина (BS) (5 мкМ/л)
0,2223 г BSO (Sigma В 2515) растворяют в 20 мл PBS-G для получения 50 мМ исходного раствора BSO. Затем этот раствор стерилизуют вакуумным фильтрованием в стерильной бутылке, используя асептические методики. Второй исходный BSO-раствор (500 мкМ) приготавливают, добавляя 100 мкл 50 мМ BSO к 900 мкл стерильного PBS-G. 5 мкМ BSO - рабочий раствор приготавливают, добавляя 2,5 мл второго, 500 мкМ BSO исходного раствора к 247,5 мл основной среды, и тщательно перемешивая.

Этот раствор стабилен в течение 1 недели.

5. Исходный раствор тимидина (Thy)
Холодный исходный раствор тимидина (Thy) (1,33 мМ Thy, 0,322 г/л) приготавливают следующим образом: взвешивают 0,161 г Thy (Sigma Т 9250) и растворяют в tcf H₂O до конечного объема 500 мл. Этот раствор стерилизуют вакуумным фильтрованием в стерильные бутылки, используя асептические методики. Аликвоты этого раствора по 50 мл помещают в центрифужные ампулы. Для кратковременного хранения раствор можно поместить в холодильник (4^oС), при этом раствор стабилен в течение 1 месяца. Для длительного хранения раствор можно заморозить (-70^oС), при этом раствор остается стабильным в течение 6 месяцев. Рабочий раствор тимидина следует использовать для разбавления радиоактивного тимидина (³H-TdR) для введения меток в клетки.

При приготовлении рабочего раствора тимидина, ThY + ³H-TdR, в 300 мл стерильного, дегазированного tcd H₂O добавляют следующие химикалии: 1,15 мл 1,33 мМ ThY (холодный), 1,70 мл ³H-TdR (ICN part #24066) со специфической активностью 300 мкКюри/ммоль. После приготовления этот раствор можно хранить в холодильнике (4^oС) в течение 1 недели.

ПРИМЕР 4. ОПРЕДЕЛЕНИЕ КОНЦЕНТРАЦИИ ЦИСТЕИНА
А. Инокулирование пластины
Конечную клеточную суспензию помещают в стерильный лоток и микротитровальную пластину, содержащую среду, помещают внутрь бокса с ламинарным потоком. Используя 12-канальную ручную микропипетку, снабженную стерильными 0-50 мкл наконечниками с фильтром, определенное в таблице IV количество конечной клеточной суспензии помещают в каждую ячейку пластины.

После добавления клеток к среде в колонки 1-9 в три ряда пластин добавляют 10 мкл раствора N-ацетил-L-цистеина (150 мМ как конечная концентрация).

В колонки 1-3 других шести рядов пластины добавляют 10 мкл 200 мкМ гидроперекиси кумола (CuOOH). В колонки 4-6 в шести рядах пластины добавляют 10 мкл 300 мкМ гидроперекиси кумола (CuOOH). В колонках 7-9 в шести рядах пластины добавляют 10 мкл 400 мкМ гидроперекиси кумола (CuOOH). После добавления к пластинам гидроперекиси кумола пластины покрывают и помещают в инкубатор с СО₂, поддерживая температуру 37^oС, на 96 часов.

В. Введение метки
Все процедуры введения метки осуществляют в помещении для работы с радиоизотопами. Рабочий раствор меченного тритием тимидина (³H-TdR) извлекают из холодильника и нагревают до 37^oС на водяной бане. Через 96 часов микротитровальные пластины достают из инкубатора. Рабочий раствор (³H-TdR) помещают в стерильный лоток и для введения 10 мкл ³H-TdR в каждую из ячеек микротитровальной пластины используют 12-канальную ручную микропипетку, снабженную 0-50 мкл стерильными наконечниками. Пластины возвращают в инкубатор при 37^oС на 24 часа. Дату и инициалы лаборанта, осуществляющего введение метки, регистрируют на бланке.

С. Сбор материала
Все процедуры сбора осуществляют в комнате для работы с радиоизотопами. Один фильтр из фиброгласса (Packard Part # 6005416) помечают номером образца, используя карандаш 2. Включают вакуумный насос и температуру в термостате устанавливают 100^oС. Заполняют дистиллированной водой резервуар, присоединенный к харвестеру. Микротитровальные пластины извлекают из инкубатора через 24 часа после добавления ³H-TdR. Дату и инициалы лаборанта, осуществляющего сбор, регистрируют на бланке образца.

При открытом положении клеточного харвестера (Packard Model # C9619) и экспонированных O-кольцах фильтр из стекловолокна помещают на харвестер, причем неровная сторона прилегает к O-кольцам. Клеточный харвестер закрывают и фильтр увлажняют дистиллированной водой из смывного лотка. Харвестер оставляют на вакуумном цикле (VAC). Крышку с микротитровальной пластины удаляют и пластину помещают под наконечники зонда харвестера. Пластину медленно поднимают на зонды харвестера до тех пор, пока наконечники зонда не касаются дна пластины. После отсасывания среды остатки на донцах ячеек соскабливают наконечниками зонда, медленными кругообразными движениями микротитровальной пластины. Такое соскабливание продолжают 10 секунд. Оставляя микротитровальную пластину в контакте с наконечниками зонда харвестера, соскабливание продолжают, и нажимают кнопку "промывка" на 10 секунд. Жидкость отсасывают из ячеек, и вышеописанные стадии соскабливания повторяют. Пластину удаляют, промывочный лоток заполняют метанолом, лоток поднимают, метанол отсасывают и лоток опускают.

Харвестер открывают, причем фильтр прилегает к верхнему отделу и продолжают работу в режиме VAC в течение 5 секунд. Через 5 сек режим VAC отключают и фильтр одновременно удаляют с поверхности харвестера. Этот фильтр помещают неровной стороной вверх в сушилку на 10 минут. Фильтр извлекают из сушилки и охлаждают до комнатной температуры.

D. Определение радиоактивности
Все процедуры подсчета проводят в комнате для работы с радиоизотопами. Фильтр помещают в считывающую кассету неровной стороной вверх. Коллиматор, тонкую пластину из нержавеющей стали, которая удерживает фильтр на месте, помещают поверх фильтра. Кассету помещают в Packard Matrix 9600 Beta Particle Radioactivity Counter и поток Q-газа (1,3% н-бутан в гелии) вводят в Matrix 9600. Нажимают кнопку "старт", активируя схему подсчета, и подсчитывают полную радиоактивность в каждой ячейке в течение 3 минут. Величина для каждого образца сохраняется на жестком диске Matrix 9600. Кроме того, распечатывается твердая копия необработанных результатов для радиоактивности.

Е. Обработка результатов
Результаты переносят с жесткого диска Matrix 9600 на 3,5-дискеты. Экспериментальные необработанные данные превращают в пригодные для публикации, используя преобразования в системе Microsoft Excel. Это сводится к вычитанию фоновых значений для каждой точки, вычислению среднего для трех значений для ячейки и представлению этого значения как процента от величины, полученной для контроля, которое принимают за 100%.

F. Анализ результатов (нормализация)
Этот тест представляет собой оценку внутриклеточной концентрации цистеина, которая является одним детерминантом антиоксидантной способности клеток. Используя лимфоциты, рост которых стимулирован митогеном, антиоксидантную функцию выражают, сравнивая разницу в реакции роста лимфоцитов с цистеином или без него, в присутствии гидроперекиси кумола (CuOOH). СuООН вызывает оксидативный стресс, который используют для измерения общего антиоксидантного статуса отдельного пациента. Добавление к среде цистеина придает антиоксиданту способность восстанавливать нарушения, вызываемые оксидативным стрессом, вызванным CuOOH. Дозы CuOOH и цистеина составляют 300 мкМ и 150 мкМ, соответственно.

Рост лимфоцитов индивидуума выражают как процент роста в среде с BSO или без него. Microsoft Excel используют для расчета отношения +BSO% роста к 100% роста (без BSO). Были введены отношения, полученные для более 1000 пациентов, и для них был проведен статистический анализ по стандартным Excel программам для определения среднего и срединного значений, интервала и среднего отклонения для отношений. "Выпадающие" результаты, т.е. данные, расположенные вне интервала стандартной ошибки ±2, исключали из базы данных. Оставшиеся данные использовали для определения точек сравнения и установления интервала сравнения популяции. Этот интервал сравнения популяции был представлен графически как график распределения рассеяния. Величина отношения нормального значения к значению для глутатиона была определена как превышающая 8-5% (>85%); поэтому любой пациент, у которого величина для глутатиона менее 85%, будет классифицироваться как индивидуум с дефицитом глутатиона.

G. Оборудование и реагенты
В анализах настоящего изобретения было использовано следующее оборудование: вытяжной шкаф с ламинарным потоком; центрифуга Beckman GS-6; счетчик клеток (Coulter Model Т540); 12 канальная автоматическая пипетка (5-500 мкл); электрический насос для пипеток (Drummond); стерильные 50 мл конические пластиковые ампулы с крышками; полипропиленовые трубочки размером 12 х 75 мм; стерильные центрифужные 15 мл конические пластиковые ампулы с крышками; пипетки (0-20, 0-200, 0-100 мкл диапазоны); стерильные стеклянные одноразовые пипетки 5,0 мл и 10,0 мл; штатив для тестовых ампул и наконечники для пипеток с аэрозольным фильтром Aerosol Barrier (0-50 мкл).

В таблице V представлены различные реагенты и их источники, которые были использованы в способе настоящего изобретения.

Н. Растворы
Все растворы приготавливают, используя деионизированную воду степени чистоты для культуры тканей (tcd H₂O).

1. Забуференный фосфатом физиологический раствор
Для получения забуференного фосфатом физиологического раствора (PBS) + 0,72% глюкозы (PBS-G), PBS приготавливают в соответствии с рекомендациями изготовителя, используя tcd ₂О. Добавляют достаточное количество 10% раствора глюкозы, чтобы получить окончательную концентрацию глюкозы 0,72%. Раствор стерилизуют фильтрованием и хранят в холодильнике при 2-8^oС.

2. Исходная среда
Концентрированную (2Х) исходную среду получают следующим образом: (1) 23,80 г HEPES; (2) 14,02 г хлорида натрия; (3) 1,05 г двухосновного фосфата калия; (4) 0,241 г сульфата магния; (5) 1,0 мл (10 мкМ) аденингидрохлорида; (6) 30,0 мл (100 мМ) пирувата натрия; (7) 0,5 мл 0,5% фенольного красного; (8) 5,0 мл смеси антибиотиков; (9) 8,0 мл 5 н. гидроксида натрия; (10) 20,0 мл Fe/EDTA (1,0 мМ FeSO₄/0,4 мМ Na₂EDTA) объединяют в tcd Н₂О. После того, как все материалы тщательно перемешивают, рН устанавливают 7,60, используя 5 н. гидроксид натрия. Добавляя tcd Н₂О, доводят до конечного объема 1,0 л. Полученный раствор стерилизуют, фильтруя через 0,2 мкМ фильтр, и хранят в холодильнике при 4^oС. Раствор стабилен в течение 4 недель.

3. Основная среда
Основную среду используют для 100% контроля за пластинами и новый способ настоящего изобретения осуществляют следующим образом: после фильтрования используют методики стерильные. Основную среду получают в боксе с ламинарным потоком; перечисленные в таблице III ингредиенты смешивают и, добавляя tcd H₂O, доводят до нужного объема. Раствор стерилизуют вакуумным фильтрованием в стерильные бутылки. Добавляют соответствующий объем РНА исходного раствора.

4. Исходные растворы гидроперекиси кумола (CuQOH)
Гидроперекись кумола (Sigma С 0524) имеет ограниченный срок хранения. Срок годности материала составляет (3) месяца с даты получения от Sigma. При отборе СuООН с помощью пипетки из бутылки нужно быть готовым к повышенной вязкости СuООН. Нужно позаботиться о том, чтобы аспирация жидкости в наконечник пипетки была полной. Обеспечение соответствующего заполнения наконечника пипетки требует дополнительного времени и внимания. Кроме того, следует протереть наконечник, чтобы удалить избыток СuООН с внешней стороны наконечника пипетки. Аналогично, следует полностью выдавить СuООН из пипетки. После этой процедуры раствор можно хранить в условиях охлаждения (2-8^oС) и он будет стабилен вплоть до 3 месяцев.

Для приготовления первого исходного раствора СuООН (1,0 М СuООН в PBS-G) 9,5 мкл гидроперекиси кумола смешивают с 990,5 мкл PBS-G.

После этой процедуры раствор можно хранить в условиях охлаждения (2-8^oС) и он будет стабильным вплоть до трех месяцев.

Второй исходный раствор СuООН (100 мМ в PBS-G) нужно приготавливать ежедневно перед выделением клеток и его нельзя хранить в течение ночи. Для приготовления второго исходного раствора СuООН 200 мкл первого исходного раствора смешивают с 1800 мкл PBS-G.

Для приготовления рабочих растворов гидроперекиси кумола 4 рабочих раствора приготавливают ежедневно перед выделением клеток. Раствор добавляют к пластине для переноса СuООН (отдельная микротитровальная пластина) для загрузки пластин пациентов. Эти растворы нельзя хранить в течение ночи. В качестве рабочего раствора используют 300 мкМ СuООН: 330 мкл второго исходного СuООН раствора смешивают с 4670 мкл PBS-G.

5. Исходный раствор тимидина (Thy)
Холодный исходный раствор тимидина (Thy) (1,33 мМ Thy, 0,322 г/л) приготавливают следующим образом: взвешивают 0,161 г Thy (Sigma Т 9250) и растворяют в tcd H₂O до конечного объема 500 мл. Этот раствор стерилизуют вакуумным фильтрованием в стерильные бутылки, используя асептические методики. Аликвоты этого раствора по 50 мл помещают в центрифужные ампулы. Для кратковременного хранения раствор можно поместить в холодильник (4^oС), при этом раствор стабилен в течение 1 месяца. Для длительного хранения раствор можно заморозить (-70^oС), при этом раствор остается стабильным в течение 6 месяцев. Рабочий раствор тимидина следует использовать для разбавления радиоактивного тимидина (³H-TdR) для введения меток в клетки.

При приготовлении рабочего раствора тимидина, ThY + ³H-TdR, в 300 мл стерильного, дегазированного tcd H₂O добавляют следующие химикалии: 1,15 мл 1,33 мМ ThY (холодный), 1,70 мл ³H-TdR (ICN part #24066) со специфической активностью 300 мкКюри/ммоль. После приготовления этот раствор можно хранить в холодильнике (4^oС) в течение 1 недели.

6. Рабочий раствор N-ацетил-L-цистеина (NAC)
0,0702 г N-ацетил-L-цистеина (Sigma A 8199) растворяют в 4 мл раствора PBS-G до получения конечной концентрации 0,1 М исходного раствора. Аликвоты этого исходного раствора помещают в 12 х 75 мм стерильные пробирки и эти аликвоты можно хранить вплоть до 1 недели в морозильной камере при -70^oС. Для получения рабочего раствора нужно взять 990 мкл одной аликвоты 0,1 М исходного раствора NAC и добавить к 29,01 мл раствора PBS-G, и тщательно перемешать. Рабочий раствор следует стерилизовать вакуумным фильтрованием в стерильные бутылки, используя асептические методики. И наконец, 10 мкл такого раствора нужно добавить в тестовые ячейки (в трех экземплярах). Важно, что рабочий раствор N-ацетил-L-цистеина нужно приготавливать свежим каждый день перед осуществлением тестирования.

Любые патенты или публикации, упомянутые в этом описании, являются показателями известных специалистам уровней, к которым настоящее изобретение имеет отношение. Далее, эти патенты и публикации включены сюда для ссылки, в той же степени, как если бы каждая отдельная публикация была специфически и отдельно включена для ссылки.

Специалисту будет легко понять, что настоящее изобретение хорошо подходит для достижения целей и получения упомянутых результатов и преимуществ, также как цели, результаты и преимущества, которые ему присущи. Приведенные примеры, наряду с методами, процедурами, обработками, молекулами и конкретными соединениями, здесь описанными, представляя предпочтительные воплощения, являются примерами, и не предназначены для ограничения объема настоящего изобретения. Специалистам очевидны изменения и другие применения, которые соответствуют сути изобретения, объем которого определен формулой изобретения.

Формула изобретения

1. Клеточная культуральная среда, эффективная для определения уровней внутриклеточной функции глутатиона в лимфоцитах и для проведения биохимического анализа антиоксидантной функции указанных лимфоцитов, причем указанная среда включает в себя забуференный, не содержащий сыворотки раствор, содержащий следующие ингредиенты: углевод, выбранный из группы, состоящей из глюкозы и соединения, биологически способного продуцировать глюкозу в указанных лимфоцитах, биологически применимую форму пантотеновой кислоты, холина или биологически применимую форму вещества, способного продуцировать холин в указанных лимфоцитах, неорганические ионы, включая хлорид, фосфат, кальций, магний, калий, натрий и железо в биологически применимой форме, L-бутионин-[S. R. ] -сульфоксимин, деионизированную воду и митоген в количестве, эффективном для стимуляции указанных лимфоцитов, причем указанный забуференный, не содержащий сыворотки раствор имеет рН в интервале от 6,8 до 7,6.

2. Клеточная культуральная среда по п. 1, отличающаяся тем, что указанная среда дополнена питательной добавкой, выбранной из группы, состоящей из биологически усваиваемых форм аминокислот и витаминов.

3. Клеточная культуральная среда по п. 1, отличающаяся тем, что указанные витамины выбраны из группы, состоящей из биотина, фолиновой кислоты или биологически применимой формы фолиевой кислоты, никотинамида или никотиновой кислоты, рибофлавина, тиамина, витамина В₆ и витамина В₁₂, и соединений, способных продуцировать их в клетках; и где указанные аминокислоты или соединения, биологически способные продуцировать аминокислоты, выбраны из группы, состоящей из L-аргинина, L-цистеина, L-глутамина, глицина, L-гистидина, L-изолейцина, L-лейцина, L-лизина, L-метионина, L-фенилаланина, L-серина, L-треонина, L-триптофана, L-тирозина и L-валина.

4. Клеточная культуральная среда по п. 1, отличающаяся тем, что указанный L-бутионин-[S. R. ] -сульфоксимин присутствует в концентрации 5 мкМ.

5. Клеточная культуральная среда по п. 1, отличающаяся тем, что указанная культуральная среда дополнена одним или более из стимулирующих питательных веществ, выбранных из группы, состоящей из пирувата, аденина и инозита.

6. Способ определения уровней внутриклеточной функции глутатиона и биохимического анализа клеточной антиоксидантной функции у индивидуума, включающий в себя стадии инокулирования клеточной культуральной среды по п. 1 лимфоцитами указанного индивидуума, инкубирования инокулированной клеточной культуральной среды и сравнения ответа лимфоцитов на бутионинсульфоксимин с усредненным ответом лимфоцитов от контрольной группы индивидуумов.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6, Рисунок 7, Рисунок 8, Рисунок 9

TZ4A - Поправки к описаниям изобретений

Часть описания, где обнаружена ошибка: Текст опис.,Кол.11, строки 22-23

Напечатано: …переносят в новые 12 · 75 мм ампулы,…

Следует читать: …переносят в новые 12 х 75 мм ампулы,…

Номер и год публикации бюллетеня: 21-2004

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2003

Извещение опубликовано: 27.07.2004        

TZ4A - Поправки к описаниям изобретений

Часть описания, где обнаружена ошибка: Текст опис., Кол.20, строки 19-20

Напечатано: …растворы гидроперекиси кумола (CuQOH)

Следует читать: …растворы гидроперекиси кумола (CuOOH)

Номер и год публикации бюллетеня: 21-2004

Номер и год публикации бюллетеня: 31-2003

Извещение опубликовано: 27.07.2004        

---