Способ ранней диагностики карцином

 

Изобретение относится к медицине и касается раннего диагностирования карциномы. Сущность изобретения включает способ ранней диагностики карциномы верхних дыхательных путей посредством определения в биообразце сверхэкспрессии протеина - регулятора клеточного цикла, представляющего собой зависящий от циклина ингибитор киназы р16. Изобретение также включает набор для осуществления этого способа, включающий реагент, подтверждающий экспрессию зависящего от циклина ингибитора киназы р16, и общепринятые вспомогательные вещества. Преимущество изобретения заключается в снижении сроков диагностирования карциномы. 2 с. и 5 з. п. ф-лы, 2 табл. 2 ил.

Настоящее изобретение относится к способу ранней диагностики карцином, а также предшествующих им изменений, прежде всего карцином верхних дыхательных путей или аногенитального тракта.

Начиная с середины 50-х годов предлагались профилактические программы для различных видов карцином. В части, касающейся карциномы шейки матки, они основаны большей частью на морфологическо-цитологическом исследовании клеточных мазков, взятых из шейки матки, с помощью так называемого Рар-теста (мазок Папаниколау), которое проводится для женщин периодически, начиная с 20-летнего возраста, в рамках обычных гинекологических обследований. В зависимости от морфологии клеток мазки подразделяют на группы с различной степенью выраженности диспластических клеточных изменений. Эти степени выраженности, соответствующие нормальной, слабой дисплазии, средней дисплазии, тяжелой дисплазии, соответственно инвазивной карциноме, обозначают как Pap I-V. В случае положительного результата Рар-теста берут небольшую биопсию и проводят гистопатологическое исследование, в ходе которого определяют вид и степень выраженности дисплазии и классифицируют как цервикальную интраэпителиальную неоплазию (CINI-III).

Несмотря на все профилактические программы карцинома шейки матки, на долю которой приходится свыше 400000 новых заболеваний в год, представляет собой вторую из наиболее часто встречающихся карцином у женщин. Причиной этого, в частности, является то, что данные Рар-теста почти в 30% случаев оказываются неправильными, т.е. дают отрицательный результат.

Исходя из вышеизложенного в основу настоящего изобретения была положена задача разработать способ, который позволял бы на ранней стадии надежно диагностировать карциному шейки матки. Кроме того, такой способ должен обеспечить проведение различий между доброкачественными воспалительными или метапластическими изменения и диспластическими предопухолевыми состояниями.

Указанная задача решается с помощью объектов, представленных в формуле изобретения.

Настоящее изобретение основано на том неожиданном факте, что при многих типах карцином, например карциноме верхних дыхательных путей или аногенитальных карциномах, прежде всего при карциноме шейки матки, соответственно предшествующих этим карциномам изменениях, происходит сверхэкспрессия протеинов - регуляторов клеточного цикла. Примерами протеинов - регуляторов клеточного цикла - являются циклины. Следует особо отметить зависимые от циклина киназы, которые регулируют циклины. Кроме того, необходимо отметить зависимые от циклина ингибиторы киназ, которые в свою очередь регулируют зависимые от циклина киназы. Примерами зависимых от циклина ингибиторов киназ являются протеины р14, р15, р16, р19, р21 и р27. При создании изобретения было установлено, что интенсивность сверхэкспрессии протеинов - регуляторов клеточного цикла - коррелирует со степенью клеточной дисплазии.

Полученные при создании изобретения результаты предназначены для применения в способе ранней диагностики карцином и предшествующих им изменений, который предусматривает выявление сверхэкспрессии протеинов - регуляторов клеточного цикла в биообразце.

Понятие "карцинома и предшествующие ей изменения" включает карциному любого вида и происхождения, соответственно предшествующие ей изменения. В качестве примеров можно назвать карциномы верхних дыхательных путей или аногенитальные карциномы, прежде всего карциному шейки матки. Для последней следует особо отметить предшествующие ей изменения, например церивикальную внутриэпителиальную неоплазию (CINI-III), карциному на месте (внутриэпителиальный рак, CIS) и т.д.

Понятие "протеины - регуляторы клеточного цикла" - включает протеины - регуляторы клеточного цикла любого типа и происхождения. В качестве примера можно назвать циклины. Особо следует отметить зависимые от циклина киназы, которые регулируют циклины. Примерами зависимых от циклина киназ являются протеины cdk4 и cdk6. Особо следует отметить также зависимые от циклина ингибиторы киназ, которые в свою очередь регулируют зависимые от циклина киназы. Примерами зависимых от циклина ингибиторов киназ являются протеины р14, р15, р16, р18, р19, р21 и р27, среди которых предпочтительным является р16.

Понятие "биообразец" включает любые образцы, в которых может быть установлено присутствие протеинов - регуляторов клеточного цикла. Примерами таких биообразцов являются кровь, мазок, мокрота, моча, стул, спинномозговая жидкость, желчь, желудочно-кишечный секрет, лимфа, костный мозг, пункции органов и биопсии. Если речь идет о выявлении аногенитальных карцином, например карциномы шейки матки, то следует особо отметить мазки и биопсии.

Понятие "выявление сверхэкспрессии протеинов - регуляторов клеточного цикла" включает любые способы, пригодные для выявления экспрессии протеинов - регуляторов клеточного цикла или кодирующих их мРНК, соответственно амплификации соответствующих генов. Обнаружение сверхэкспрессии предполагает сравнение исследуемого биообразца с соответствующим образцом, взятым у здорового человека. Такой образец может быть представлен в стандартной форме. Выявление (сверх)экспрессии протеинов - регуляторов клеточного цикла - может осуществляться на уровне нуклеиновых кислот, соответственно протеинов. Для выявления на уровне протеинов могут использоваться, например, антитела к протеинам - регуляторам клеточного цикла. Эти антитела могут применяться согласно различным методам, таким как вестерн-блоттинг, ELISA (твердофазный иммунноферментный анализ) или иммунопреципитация. Может оказаться предпочтительным фиксировать (иммобилизовать) антитела на твердых носителях, таких как предметные стекла или частицы латекса.

Настоящее изобретение позволяет диагностировать карциномы на ранних стадиях, т.е. при предшествующих им изменениях.

Следующим объектом настоящего изобретения является набор для осуществления способа по изобретению. Такой набор включает (а) реагент для выявления экспрессии протеина - регулятора клеточного цикла, например антитело к такому протеину или кодирующую его нуклеиновую кислоту, соответственно ее фрагменты, (б) общепринятые вспомогательные вещества, такие как буфер, носитель, маркер и т.д., и при необходимости (в) средство для контрольных реакций, например протеин - регулятор клеточного цикла, кодирующую его нуклеиновую кислоту, соответственно ее фрагменты, или клеточный препарат, например срез ткани или иммобилизованные на носителе клетки.

В отношении отдельных компонентов набора справедливо все cказанное выше. Кроме того, каждый из отдельных компонентов может быть представлен в наборе одним или несколькими представителями.

Настоящее изобретение позволяет диагностировать карциному на ранних стадиях. Прежде всего следует отметить, что можно выявлять предшествующие карциномам изменения на ранних стадиях. Следует также отметить, что с помощью такого способа можно отличать доброкачественные воспалительные или метапластические изменения от диспластических предопухолевых состояний. Необходимо отметить далее, что полученные при осуществлении способа по изобретению результаты не подвержены субъективной оценке, что позволяет, например, избежать неправильных отрицательных или неправильных положительных оценок Рар-теста или гистологических препаратов. Кроме того, способ по настоящему изобретению отличается тем, что он является быстрым и простым в осуществлении, вследствие чего он применим для широкомасшабного скрининга, прежде всего в странах третьего мира. Тем самым настоящее изобретение является важным вкладом в современные методы диагностики раковых заболеваний.

Краткое описание чертежей.

На фиг.1 представлены данные о сверхэкспрессии cdk4 в трансформированных с помощью HPVIб (вирус папилломы человека) клетках линии CaSki карциномы шейки матки. Надписи 4 ч, 8 ч, 12 ч, 24 ч обозначают моменты времени, в которые делали анализы клеточных экстрактов. Надпись "со" обозначает контроль, а "аrr" обозначает добавление сыворотки.

На фиг. 2 представлены данные о сверхэкспрессии cdk6 и р19 в трансформированных с помощью HPV16 клетках линии NIH3T3. Надпись "со" обозначает контроль.

Ниже изобретение проиллюстрировано на примерах.

Пример 1. Выявление сверхэкспрессии р16 в биопсии шейки матки (А).

Из 20 биопсий шейки матки, которые охватывали все стадии диспластического прогрессирования, начиная со здоровой ткани (n=2), включая нарушения промежуточных степеней CIN I (n=4), II (n=4), III (n=5) и заканчивая инвазивной карциномой (n=5), приготавливали парафиновые срезы толщиной 3-5 мкм. Их депарафинировали с помощью ксилола (2х10 мин) и регидрировали этанолом. Выявление антигенов осуществляли в 10 мМ цитратном буфере (рН 6,0) в автоклаве при 110^oС в течение 10 мин. Затем эндогенные пероксидазы инактивировали с помощью 0,25%-ного Н₂О₂ в ЗФР. После блокады неспецифических сайтов связывания с помощью лошадиной сыворотки (набор Vectastain ABC detection kit, фирма Vector Laboratories, Бурлингем, шт. Калифорния, США) в течение 20 мин при комнатной температуре срезы инкубировали в течение 45 мин при комнатной температуре со специфическим в отношении р16 моноклональным антителом (фирма Neomarkers, Фремонт, шт. Калифорния, США) в присутствии 3% фетальной телячьей сыворотки. Для выявления связывания р16 - антитело добавляли на 30 мин биотинилированное вторичное антитело (лошадиное антитело к мышиному IgG, набор Vectastain, указанный выше). Затем с использованием реагентов и инструкций для набора Vectastain и окрашивания ядер в контрастный цвет с помощью раствора гемалауна Мейера выявляли связанные с реагентами вторичные антитела.

Было установлено, что в клетках, характеризующихся дисплазией, происходит сверхэкспрессия р16. Кроме того, было установлено, что уровень сверхэкспрессии р16 коррелирует со степенью клеточной дисплазии.

(Б) Далее приготавливали парафиновые срезы для 78 биопсий шейки матки. Биопсии включали здоровую ткань (n=12), диспластические нарушения степеней CIN I (n=15), II (n=14) и III (n=18), а также инвазивную карциному (n=19). Парафиновые срезы обрабатывали аналогично разделу (А). Полученные результаты представлены в таблице 1.

Данные, представленные в таблице 1, свидетельствуют о том, что р16 сверхэкспрессируется в клетках, характеризующихся дисплазией и инвазивной карциномой, при этом уровень сверхэкспрессии возрастает при увеличении степени дисплазии и переходе к инвазивной карциноме.

Далее по методике, описанной в разделе (А), обрабатывали парафиновые срезы 180 биопсий. Кроме того, определяли процент клеток, которые реагировали с вышеуказанным специфичным в отношении р16 моноклональным антителом. На основе этого можно выявить различия между HPV-позитивной и HPV-негативной дисплазией, соответственно инвазивной карциномой. Полученные данные представлены в таблице 2.

Данные, приведенные в таблице 2, свидетельствуют о том, что р16 сверхэкспрессируется при дисплазии и инвазивной карциноме как в HPV-позитивных, так и в HPV-негативных клетках. Это подтверждается сравнением с контрольными образцами, представляющими собой здоровые ткани. Кроме того, эти данные показывают, что процентное количество клеток, реагирующих с р16, возрастает при увеличении степени дисплазии и переходе к инвазивной карциноме.

Пример 2. Выявление сверхэкспрессии протеинов - регуляторов клеточного цикла в клетках, трансформированных HPV.

(А) Клетки карциномы шейки матки линии CaSki, трансформированные HPVI6, культивируют в отсутствие сыворотки в течение 72 ч. После добавления сыворотки через определенные промежутки времени отбирают клеточные экстракты, подвергают анализу с помощью электрофореза в полиакриламидном геле в присутствии додецилсульфата натрия и переносят на поливинилиденфторидные мембраны (фирма Du Pont). Уровень экспрессии cdk4 определяют с помощью поликлональной антисыворотки (1:1000) Santa Cruz. Затем определяют экспрессию протеина HPV16-E7 с помощью моноклонального антитела к HPV16-E7 (1:50) в тритоне. Выявление отдельных иммунных реакций осуществляют с помощью связанного с пероксидазой вторичного антитела и хемилюминисцентной системы обнаружения (прибор типа NEN, фирма Du Pont).

Было установлено, что происходит сверхэкспрессия cdk4 (ср. фиг.1).

(Б) Клетки линии NIH3T3 трансформируют с помощью HPV16, в результате чего возникает экспрессия протеина HPV16-E7. Аналогично разделу (А) получают и обрабатывают клеточные экстракты трансформированных клеток. Для выявления экспрессии cdk6, соответственно р19, применяют поликлональные антисыворотки (1:1000) Santa Cruz. Выявление экспрессии протеина HPV16-E7 и выявление отдельных иммунных реакций осуществляют аналогично разделу (А).

Было установлено, что происходит сверхэкспрессия cdk6 и р19 (ср. фиг.2).

Формула изобретения

1. Способ ранней диагностики карцином и предшествующих им изменений, предусматривающий выявление сверхэкспрессии протеина-регулятора клеточного цикла в биообразце, причем протеин-регулятор клеточного цикла представляет собой зависящий от циклина ингибитор киназы р16, а карцинома представляет собой карциному шейки матки.

2. Способ по п.1, в котором биообразец представляет собой кровь, мазок, мокроту, мочу, стул, спинно-мозговую жидкость, желчь, костный мозг, желудочно-кишечный секрет, пункцию органа, соответственно биопсию и/или лимфу.

3. Способ по п.1 или 2, в котором определение сверхэкспрессии осуществляют на уровне нуклеиновых кислот.

4. Способ по п.1 или 2, в котором определение сверхэкспрессии осуществляют на уровне протеинов.

5. Способ по п.4, в котором определение осуществляют с помощью антитела к протеину-регулятору клеточного цикла.

6. Набор для осуществления способа по любому из пп.1-5, включающий:

(а) реагент, подтверждающий экспрессию зависящего от циклина ингибитора киназы р16, причем реагент представляет собой антитело к зависящему от циклина ингибитору киназы р16 и/или нуклеиновую кислоту, кодирующую зависящий от циклина ингибитора киназы р16, или соответственно ее фрагменты и (б) общепринятые вспомогательные вещества, такие, как буфер, носитель, маркер.

7. Набор по п.6, включающий средство для контрольных реакций, причем указанное средство представляет собой зависящий от циклина ингибитор киназы р16 или кодирующую его нуклеиновую кислоту соответственно ее фрагменты и/или срез ткани или клетки, иммобилизованные на носителе.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4