Штамм вируса кори novo/96 для получения антигена - компонента тест-системы и иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу кори

 

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выявлению нового штамма вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента диагностической тест-системы и тест-система для диагностики антител к вирусу кори. Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание штамма-продуцента вируса кори NovO/96, обладающего более высокой продуктивностью, и иммуноферментной тест-системы на его основе для диагноститики антител к вирусу кори с более высокой чувствительностью, чем при использовании тест-системы на основе зараженной вирусом кори культуры клеток. Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор” под регистрационным номером №VB-04. 1 з.п. ф-лы, 1 табл., 1 ил.

Изобретение относится к медицинской вирусологии и микробиологии, а именно к выявлению нового штамма вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента диагностической тест-системы и тест-система для диагностики антител к вирусу кори.

Известен штамм вируса кори Ленинград 16 (Л-16), используемый для приготовления вакцины и в качестве компонента диагностической тест-системы (Руководство по вакцинному и сывороточному делу под ред. Академика АМН П.Н.Бургасова. М.: Медицина, 1978, - с.220-223).

Однако данный штамм вируса кори обеспечивает недостаточный урожай целевого продукта: на протяжении десяти пассажей концентрация вируса в культуральной жидкости не превышает (в среднем) 10^3,5 ТЦД₅₀/мл (Васильева Г.А., Бойчук Л.М. Отработка технологии получения вируса кори штамм Л-16 на тканевой культуре из эмбрионов японских перепелок. - Специфическая профилактика кори. - Материалы научно-практической конференции ЛНИИЭМ им. Пастера. - Л., 1970, - с.206-210).

Наиболее близким штаммом (прототипом) является штамм вируса кори Эдмонстон (Патент США №4211843, МПК А 01 N 1/02; А 61 К 39/12, опубл. 08.07.1980 г.). Штамм Эдмонстон депонирован в Американской Коллекции Клеточных Культур (АТСС - VR-24, 4/92). В ГНЦ ВБ "Вектор" прошел четыре пассажа на культуре клеток Vero. Подлинность штамма установлена методом положительной цепной полимеразной реакции со специфическими праймерами. Штамм относится к генотипу А. Максимальные титры вируса достигают на 5-6 сутки после заражения монослоя клеток Vero и составляют 5×10⁶ ТЦПД₅₀/мл. [Агафонов А. и соавт.//Вопр. вирусол., 1997, N 1, с.102-205]. Антигенные свойства штамма: выявляет антитела к вирусу кори в сыворотках больных и вакцинированных людей (см. Табл. 1). Штамм патогенен для человека.

Однако вышеприведенный штамм - прототип имеет недостаточную продуктивность: титр вируса не превышает 4-6×10⁶ ТЦПД₅₀/мл [Nobuyuki Ono, et al //J. of Virology, 2001, 75 (9): 4399-401].

Известна отечественная иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу кори "Корь-скрин" (разработчик и производитель тест-системы "Корь-скрин" - ЗАО Биотехнологическая компания "БИОСЕРВИС" (Инструкция по применению тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу кори "Корь-скрин", Москва, 2001г.). Указанная тест-система содержит:

- иммуносорбент - полистироловые планшеты для иммунологических реакций, в лунках которых сорбирован антиген вируса кори (АгВК). АгВК - в рядах планшета А, С, Е, G и контрольный антиген (кАг) - в рядах В, D, F, Н. АгВК представляет собой инфицированные вирусом кори клетки Vero, содержащие не менее 80% вируссодержащих клеток; кАг представляет собой незараженные клетки Vero;

- положительный контрольный образец (К+) - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу кори;

- отрицательный контрольный образец (К-) - сыворотка крови человека или сывороточный альбумин человека, не содержащие антител к вирусу кори;

- конъюгат - антитела диагностические против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена;

- субстратная буферная смесь с гидроперитом (БСГ) - для приготовления раствора хромогена;

- хромоген - ортофенилендиамин (ОФД);

- стабилизатор - бычий сывороточный альбумин (БСА) или казеин;

- концентрат фосфатно-солевого буфера для отмывания планшетов и приготовления разведений сывороток и конъюгата.

Однако указанная тест-система (аналог) имеет низкую чувствительность вследствие того, что в ней используют АгВК, представляющий собой неочищенный антиген - инфицированные (не менее 80%) вирусом кори клетки Vero.

Наиболее близкой тест-системой (прототипом) является иммуноферментная тест-система для выявления антител к вирусу кори американской фирмы Wampole Laboratories (Wampole Laboratories measles IgG ELISA// P/N 6000-29W REV В. - №4, 1996; Helfand R.F. et al. Comparative detection of measles and rebella IgM and IgG derived from filter paper blood and serum samples.// J.Med. Virol. 2001, 65(4): 751-7). Указанная иммуноферментная тест-система содержит планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат буфера, блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкая положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая отрицательная контрольная сыворотка (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент.

Однако в указанной тест-системе (прототип) в качестве антигена использован неочищенный NP-белок вируса кори, вследствие чего тест-система имеет недостаточную чувствительность (не выявляет антитела к другим белкам).

Техническим результатом предлагаемого изобретения является создание штамма-продуцента вируса кори, обладающего более высокой продуктивностью и иммуноферментной тест-системы на его основе для диагностики антител к вирусу кори с более высокой чувствительностью.

Указанный технический результат достигается созданием штамма вируса кори NovO/96 с более высокой продуктивностью и на его основе более чувствительной иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, включающей планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т), блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкая положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая отрицательная контрольная сыворотка (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент, согласно изобретению в качестве иммобилизованного инактивированного антигена вируса кори тест-система содержит высокоочищенный антиген, приготовленный на основе штамма вируса кори NovO/96.

Характеристика заявляемого штамма. Штамм NovO/96 относится к семейству вирусов Paramyxoviridae. Заявляемый штамм получен в НИИ молекулярной биологии Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор”, Министерство здравоохранения Российской Федерации, Кольцове, Новосибирская обл.

Штамм депонирован в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии "Вектор" под регистрационным номером №VB-04 (дата регистрации 24 апреля 2002 г., справка о депонировании штамма №0302 прилагается к заявке) и используется для производства антигена при выпуске тест-системы иммуноферментной для определения антител к вирусу кори “Анти-корь ИФА”.

Источник получения. Штамм выделен от больного К. во время вспышки 1996 в г. Новосибирске. Больной К. имел плотный контакт с инфекционным больным, у которого был серологически подтвержденный диагноз “корь”. Течение инфекции у больного К. было типичным: заболевание начиналось с повышения температуры до 37,8°С, появления сыпи на сгибах рук. Через 2 дня сыпь исчезла. На основании клинических проявлений и по нарастанию титров противокоревых антител в парных сыворотках, определенных с помощью РТГА и ИФА, больному К. был поставлен диагноз - корь. На 2-ой день после повышения температуры у больного К. были взяты образцы крови и соскоб со слизистой рта. Ватный тампон, которым делался соскоб со слизистой рта больного К., был помещен в 1 мл среды ДМЭМ, содержащей антибиотики и после стерилизации через фильтры 0,22 мкм помещали в пен/флакон с монослоем клеток Vero. После инкубирования при 37°С в течение 6 суток клетки снимали раствором трипсин-версена и помещали вместе с новой порцией свежих клеток Vero на культуральный сосуд объемом 75 мл. После инкубирования при 37°С в течение 6 суток (до появления на монослое симпластов) культуральный сосуд помещали на -20°С, затем производили оттаивание КВЖ (культуральной вируссодержащей жидкости). Полученную смесь КВЖ и лизата клеток Vero расфасовывали и одну часть стока лиофилизовали, а другую - хранили при минус 70°С.

Подлинность штамма. Проведена ПЦР-диагностика: положительная цепная полимеразная реакция со специфическими праймерами. Проведен сиквенс и изучен С-концевой участок генома вируса кори штамм NovO/96, отвечающий за кодирование NP белка. Проведено сравнение полученной последовательности аминокислот с последовательностью аминокислот штамма Эдмонстон. В позиции 1542 в штамме NovO/96 произошла замена нуклеиновой кислоты Т→А, приведшая к смене в позиции 478 аминокислоты Фенилаланин на Изолейцин.

На чертеже приведена карта сравнения аминокислотных последовательностей:

Из выше изложенного следует, что заявляемый штамм отличается генетически от известных штаммов вируса кори.

Генотип штамма. Генотип A [S.Santibanez,... A.Agafonov et al. // J. of Med. Virol. 1999, V.58, №3, P.313-320].

Культуральные свойства. Штамм NovO/96 при культивировании на монослое клеток Vero вызывает образование симпластов на 4-6 сутки (темпер. культивирования 37°С). Максимальные титры вируса достигали на 5-6 сутки после заражения монослоя клеток Vero и составляли 4×10⁸ ТЦПД₅₀/мл. Продуктивность: Из 3 литров КВЖ получается 5 мг антигена для ИФА.

Использование полученного из штамма NovO/96 антигена - 0,2-0,4 мкг/лунку позволяет выявлять противокоревые антитела в сыворотках вакцинированных и больных корью людей методом ИФА.

Антигенные свойства. Выявляет антитела к вирусу кори в сыворотках больных и вакцинированных людей (см. табл. 1). Выделенный штамм по серологическим свойствам близок к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16.

Патогенность для человека. По клиническим признакам заболевания у больного, от которого был выделен штамм NovO/96 (температура - 37,8°С, сыпь не обильная, исчезновение сыпи через 2 дня), можно считать, что штамм NovO/96 не является высокопатогенным. Штамм NovO/96 не является фито- и зоопатогенным.

Для длительного хранения штамм лиофилизируют с использованием в качестве защитной среды раствор желатина и сахарозы.

Для размножения штамма используют следующие питательные среды: Игла МЭМ, Игла МЭМ x 2АВК, ДМЭМ, содержащие 2-5% фетальной сыворотки КРС.

Изучение серологических свойств полученного штамма (NovO/96) выявило существенное сходство с референс-штаммом (прототип) вируса кори и со штаммом Л-16. Полученные от иммунизированных мышей линии BALB/c антисыворотки к штамму Эдмонстон и к заявляемому штамму, выделенному от больного, были исследованы в реакции иммуноферментного анализа. Результаты изучения перекреста между полученными сыворотками показаны в табл. 1. Как видно из результатов табл. 1, сыворотка от всех мышей, иммунизированных вирусом кори штамм Эдмонстон, реагировала как с вирусами кори штамм Эдмонстон и Л-16, так и со штаммом NovO/96, выделенным при вспышке. С другой стороны, сыворотки от всех мышей, иммунизированных заявляемым штаммом, выделенном при вспышке кори 1996 года, реагировали как с самим вирусом, так и с вирусами кори штамм Эдмонстон и Л-16. Исходя из полученных результатов можно заключить, что заявляемый штамм по серологическим свойствам близок к референс-штамму Эдмонстон и к вакцинному штамму Л-16.

Пример 1. Способ получения антигена вируса кори.

Очищенный и инактивированный антиген вируса кори используют для постановки реакции иммуноферментного анализа.

Получение вируссодержащей жидкости. Исходные клетки Vero хранят в жидком азоте и выращивают путем серийных пересевов. В качестве ростовой среды используют раствор Игла MEM с 8-10% эмбриональной сыворотки КРС. Культуру клеток выращивают в течение 3-4 суток при посевной концентрации клеток 5-10×10⁵ кл/мл среды и пересевают общепринятым способом.

Вирусом кори (штамм NovO/96) заражают 1-литровые матрасы с монослоем культуры клеток Vero или Л-68 (множественность заражения 1:10). После инкубации при 20-25°С в течение 40 мин приливают 200 мл питательной среды Игла МЭМ с добавлением (3,0±0,1) мл сыворотки крупного рогатого скота, 0,001% - трипсина, 200 ед/мл бензилпеницилина и 200 нг/мл стрептомицина, и после инкубации в течение 5-7 суток при (36±1)°С сливают питательную среду. Титр вируса в КВЖ - не менее 10⁸ ТЦПД₅₀/мл.

Получение лизата клеток Vero. При культивировании переход вируса из клетки в клетку осуществляется за счет образования симпластов без выхода основного количества последнего в КВЖ, поэтому накопления вируса происходит как в КВЖ, так и внутри клеток. В культуральный сосуд добавляют 5-7 мл 0,01 М Трис НСl, рН=9,0. Клетки разрушают трехкратным замораживанием-оттаиванием для выхода вируса из клеток. Клеточный лизат освобождают от клеточного детрита низкоскоростным центрифугированием в роторе JA-10 центрифуги J2-21 (ф. “Beckman”, США) при 1500 об/мин в течение 10 мин при температуре +4°С. Титр вируса в лизате клеток - 2-4×10⁶ ТЦПД₅₀/мл.

Проведение ультрафильтрации. Концентрирование и очистку вируса кори из КВЖ проводят на мембранах "Владипор" типа УАМ-100 (Россия) или РТНК 0005 (ф. “Millipore”, США). Линейная скорость подачи КВЖ на ячейку должна быть равна 0,6 л/мин. Давление на выходе должно быть не более 2,5 кг/см², давление на входе не должно превышать давление на выходе более, чем на 0,4 кг/см². Конечный продукт представляет собой КВЖ, сконцентрированную в 20 раз, освобожденную от низкомолекулярных соединений и клеточного детрита. Титр вируса кори в концентрате не менее 10⁹ ТЦПД₅₀/мл.

Ультрацентрифугирование вируссодержащего материала. Осаждение вируса. Антиген для ИФА получают из двух источников:

1 - из концентрата КВЖ;

2 - из лизата клеток после размораживания.

На первом этапе вирус осаждают через “подушку” 10%-ной сахарозы в роторе SW 28. Для этого в пробирки ротора осторожно наливают 5 мл 10%-ной сахарозы и сверху наслаивают 30 мл концентрата КВЖ или лизата клеток. Осаждение вируса проводят при 26000 об/мин, 4°С, 10 часов. Надосадочную жидкость осторожно отбирают пипеткой, а осадок растворяют в 0,5-1,0 мл NTE-буфера (0,1 М NaCl, 0,01 М Трис НС1, 0,001 М ЭДТА, рН=7,6).

Очистка антигена вируса кори. Антиген для ИФА очищают от чужеродных белков ультрацентрифугированием в градиенте плотности сахарозы. Осадки из всех пробирок (осадки из концентрата КВЖ и лизата клеток) объединяют, проводят обработку на ультразвуковом дезинтеграторе при 6000 Гц 3 раза по 10 с и наслаивают на раствор 20-60%-ной сахарозы. Для приготовления линейного градиента раствора сахарозы используют смеситель, состоящий из двух камер, которые можно изолировать перекрыванием крана между ними. Одну из камер (первую) соединяют гибким шлангом с перистальтическим насосом. Шланг, выходящий из насоса, опускают в пробирку вместимостью 12 мл таким образом, чтобы он касался стенки пробирки в верхней ее части. Смеситель устанавливают на магнитную мешалку. В первую камеру помещают якорек. Смеситель заполняют при закрытом кране следующим образом. В первую камеру наливают 4,5 мл 60%-ного раствора сахарозы, во вторую 4,5 мл 20%-ного раствора сахарозы. Затем включают магнитную мешалку, перистальтический насос и осторожно открывают кран между камерами. Раствор из второй камеры поступает в первую, перемешивается и через насос поступает в пробирку. Общий объем приготовленного линейного градиента составляет 9 мл в каждой пробирке. Осажденный антиген вируса кори осторожно наслаивают с помощью шприца с толстой иглой на линейный градиент сахарозы 20-60% в стаканы ротора SW-41 центрифуги Beckman L-8-70. Режим ценрифугирования-37000 об/мин при 4-6°С в течение 12 ч. Полосу на уровне 42-45%-ной сахарозы осторожно отбирают шприцом с толстой иглой и после определения чистоты антигена методом электрофореза и определения концентрации антигена по белку используют для проведения ИФА.

Выход пригодного для ИФА антигена с 3 л КВЖ и лизата клеток составляет 4-6 мг по белку.

Стадия инактивации вируса: очищенный в градиенте плотности сахарозы антиген вируса кори инактивируют прогреванием при 56°С в течение 30 мин [Жданов В.М., Гайдамович С.Я. Вирусология. М.: Медицина, 1966 г., с. 382].

Пример 2. Состав тест-системы.

Состав компонентов тест-системы иммуноферментной для выявления антител к вирусу кори (Анти-корь ИФА), которая представляет собой набор реагентов:

- контрольная положительная сыворотка (К+) - сыворотка крови человека, содержащая антитела к вирусу кори, инактивированная прогреванием, и краситель феноловый красный по ТУ 6-09-3070-84;

- контрольная отрицательная сыворотка (К-) - сыворотка крови здоровых доноров, не содержащая антител к вирусу кори;

- антитела против иммуноглобулинов класса G человека, меченые пероксидазой хрена по ТУ 6-09-10-1408-79 (конъюгат);

- субстрат пероксидазы ортофенилендиамин (ОФД) по ТУ 6-09-08-1127-76 или ВФС 42-76ВС-88;

- цитратно-фосфатный буферный раствор (ЦФР) (состав ЦФР: натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный по ГОСТ 4172-76 39,59 г; лимонная кислота моногидрат по ГОСТ 908-79Е или ТУ 6-09-584-75 5,21 г; вода дистиллированная по ГОСТ 6709-72 до 1 л; водорода перекиси до массовой доли 0,02 ГОСТ 177-88 рН 5,3±0,3. Коррекцию рН проводят гидроокисью натрия по ГОСТ 4328-77 в концентрации 1 моль/л);

- концентрат фосфатно-солевого буферного раствора двадцатипятикратный (ФСБТ-25Х) (состав ФСБ-Т (25Х) - натрий фосфорно-кислый двузамещенный 12-водный ГОСТ 4172-76 90,0 г; натрий фосфорно-кислый однозамещенный 2-водный по ГОСТ 245-76 4,75 г; натрий хлористый ГОСТ 245-76 22,0 г; твин-20 "Сигма", США 12,5 мл);

- стоп-реагент серная кислота по ГОСТ 4204-77 с концентрацией 2 моль/л;

- блокирующий раствор.

Иммуносорбент - планшет 96-луночный для иммунологических реакций по ТУ 64-2-375-86 или планшет разборный со стрипами типа "Nunc", Дания или аналогичные с иммобилизованным очищенным антигеном вируса кори.

Консервант - мертиолят натрия "Сигма" (США) содержится в К+, К-, конъюгате, блокирующем растворе в концентрации 0,01%; К+ и К-содержат антибиотик-гентамицина сульфат по ВФС 42-2626-89 в концентрации 1мг/мл.

Набор рассчитан на проведение 96 анализов (включая контрольные).

Соли последовательно растворяют при перемешивании в 0,9 л дистиллированной воды при температуре 40-50°С, рН 7,5±0,3, коррекцию проводят как описано выше. Объем раствора доводят до 1 л, добавляют твин-20 и перемешивают.

Пример 3. Состав и методика применения коммерческой тест-системы "Анти-корь ИФА"

1. Состав набора

1. Планшет с иммобилизованным антигеном вируса кори - 1 планшет (разборный).

2. Концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т) - 3 флакона объемом по 10мл.

3. Блокирующий раствор -1 флакон объемом 10 мл.

4. Цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР) - 3 флакона объемом 10 мл.

5. Ортофенилендиамин (ОФД) - 1 флакон, 3 таблетки.

6. Положительная контрольная сыворотка (К+), жидкая, красного цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.

7. Отрицательная контрольная сыворотка (К-), жидкая, желтоватого цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.

8. Антитела против иммуноглобулинов человека, меченые пероксидазой хрена (конъюгат), жидкие, синего цвета - 1 флакон объемом 0,5 мл.

9. Стоп-реагент, прозрачная бесцветная жидкость - 1 флакон объемом 5 мл.

2. Проведение иммуноферментного анализа

Очищенный антиген (вирус кори штамм NovO/96) разводят в карбонатном буфере (рН=9,6) до концентрации 2-4 мкг/мл и вносят по 100 мкл раствора антигена в лунки 96 луночного планшета. Адсорбцию антигена проводят при 4°С в течение 16-20 ч. После инкубации из планшета удаляют неиммобилизованный антиген и промывают три раза ФСБ-Т, при этом в каждую лунку планшета вносят объем раствора не менее 200 мкл. Затем во все лунки планшета вносят по 100 мкл блокирующего раствора, закрывают планшет крышкой, выдерживают при 37°С в течение 30 мин и затем промывают 2 раза ФСБ-Т. Для определения титра противокоревых антител сыворотки раститровываются в лунках по вертикали во вспомогательном 96-ти луночном планшете. Во все лунки вспомогательного планшета (кроме 1-го ряда - лунки с А-1 по А-11) вносят по 130 мкл р-ра ФСБ-Т. Во все лунки ряда А, начиная с лунки "А-1" (лунки 1-11), вносят по 225 мкл р-ра ФСБ-Т. Последний (12-ый ряд) планшета используется для контролей. Затем во все лунки ряда А, начиная с лунки "А-1" (лунки 1-11), вносят по 25 мкл испытуемых сывороток и раститровывают их каждую по своему ряду с шагом разведений 1:2. Например, из лунки А-1 отбирают 130 мкл испытуемой сыворотки в разведении 1:10 и переносят в лунку "В-1", тщательно пипетируют, отбирают 130 мкл и переносят в лунку "С-1". Процедуру повторяют и переносят 130 мкл в лунку "D-1" и так далее до лунки "Н-1". Аналогичным образом в лунках ряда 2 (от лунки "А-2" до лунки "Н-2") раститровывается следующая испытуемая сыворотка и так далее, до лунок 11-го ряда. Последний (12-ый ряд) планшета используется для контролей. Таким образом в планшете можно раститровать до 11 сывороток. Все разведения сывороток (100 мкл) из вспомогательного планшета переносятся в соответствующие лунки планшета с иммобилизованным антигеном вируса кори. В лунки А-12 и В-12 вносят К+ объемом по 100 мкл, в лунки С-12 и D-12 вносят СОП объемом по 100 мкл, в лунки Е-12 и F-12 вносят К - объемом по 100 мкл, в лунки G-12 и Н-12 вносят ФСБ-Т объемом по 100 мкл для контроля конъюгата. Затем планшет закрывают крышкой или клейкой лентой и инкубируют 30 мин при температуре (37±1)°С. После промывки и удаления влаги в каждую лунку вносят конъюгат в рабочем разведении объемом по 100 мкл. Планшет закрывают и инкубируют 30 мин при температуре (37±1)°С. По окончании инкубации планшет промывают ФСБ-Т не менее трех раз и удаляют остатки влаги из планшета. Далее вносят в каждую лунку планшета раствор субстрата объемом по 100 мкл. Планшет закрывают крышкой и помещают на 20 мин в защищенное от света место при температуре 20-25°С. Реакцию останавливают внесением стоп-реагента по 50 мкл в каждую лунку планшета.

3. Учет результатов

Результаты ИФА регистрируют на спектрофотометре. Оптическую плотность (ОП) измеряют при длине волны 492 нм. Результаты учитывают только в том случае, если среднее значение ОП в лунках с контролем конъюгата (ОП_кк) не превышает 0,15, в лунках с К - среднее значение ОП(ОП_к-) не более 0,2, а в лунках с К+ среднее значение ОП(ОП_к+) не менее 0,5.

Результаты теста считаются положительными, если ОП анализируемой сыворотки больше Оп_крит. При количественном определении титра антител к вирусу кори в сыворотке титром следует считать последнее разведение исследуемой сыворотки, значение ОП в которой превышает значение ОП_крит. ОП_крит рассчитывают по формуле: ОП_крит.=ОП_к-+0,2.

Тест-систему "Анти-корь ИФА" выпускают в виде набора, упакованного в полистироловую или картонную коробку. Один набор рассчитан на проведение 96 анализов, включая контрольные.

Пример 4. Использование тест-системы "Анти-корь ИФА" в клинической практике.

А. Во время вспышки инфекционного заболевания в г. Новосибирске в 2000-2001 г.г. тест-система "Анти-корь ИФА" была использована для серологического подтверждения клинического диагноза “корь” у 8 больных. Больные с клиническим диагнозом “корь” поступали в Новосибирский областной центр по профилактике и борьбе со СПИДом и инфекционными заболеваниями. На 2-3 сутки и через 2-2,5 недели после поступления у больных проводили забор парных сывороток для серологического подтверждения диагноза “корь”. Нарастание титров специфических антител изучали в реакции РТГА (по стандартной методике с использованием эритроцитов обезьяны Масаса mulatta) и методом ИФА (с помощью экспериментальных серий тест-системы "Анти-корь ИФА", основным компонентом которой является очищенный антиген вируса кори штамм NovO/96). Окончательный диагноз “корь” был поставлен после проведения ПЦР со специфическими праймерами на С-концевую часть гена, кодирующего NP белок вируса кори. У всех 8 больных было отмечено как минимум 4-х кратное нарастание специфических антител, определенное методом РТГА. У всех 8 больных в забранных образцах методом ПЦР был обнаружен генетический материал, специфичный для вируса кори. С помощью тест-системы "Анти-корь ИФА" также было зарегистрировано у всех 8 больных как минимум 4-х кратное нарастание антител к вирусу кори. Таким образом, тест-система "Анти-корь ИФА" может быть использована для определения специфических антител в парных сыворотках, полученных от больных, и таким образом для определения, снятия или подтверждения диагноза при протекании заболевания с клиническими проявлениями, характерными для кори.

Б. В период с 1996 по 1998 годы в п.Кольцово Новосибирской области проводились работы по изучению титра специфических антител к вирусу кори в сыворотках крови детей возраста 6 лет перед проведением второй вакцинации против кори. Титры специфических антител изучали в реакции РПГА (с помощью "Диагностикума эритроцитарного коревого антигенного для РПГА", производства “Предприятия по производству бакпрепаратов Ленинградского НИИЭМ им. Пастера”), РТГА (по стандартной методике с использованием эритроцитов обезьяны Macaca, mulatta) и методом ИФА (с помощью заявляемой тест-системы "Анти-корь ИФА", основным компонентом которой является очищенный антиген вируса кори штамм NovO/96).

Результаты сравнения двух методов определения противокоревых антител в сыворотке крови детей показывают, что с помощью метода иммуноферментного анализа специфические антитела определяются в 177 сыворотках из общего количества сывороток (187 сывороток), в которых были найдены противокоревые антитела и с помощью метода ИФА, и с помощью метода РТГА. В то же время методом РТГА антитела к вирусу кори определялись в 165 сыворотках. Таким образом, наибольший процент выявляемость положительных сывороток (95,5%) был получен в реакции ИФА. В реакции РТГА процент положительных реакций был ниже и составлял 89,2%. Средние арифметические величины титров антител в ИФА также были выше, чем в РТГА (1:245,5 и 1:28,4 соответственно).

Сопоставление результатов, полученных при использовании методов ИФА и РТГА, показало, что антитела к вирусу кори обоими методами выявляются в 155 сыворотках.

Таким образом, тест-система "Анти-корь ИФА" может быть использована для определения напряженности индивидуального иммунитета к заболеванию “корь”.

Формула изобретения

1. Штамм вируса кори NovO/96 для получения антигена - компонента иммуноферментной тест-системы для диагностики антител к вирусу кори, депонированный в коллекции культур микроорганизмов Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии “Вектор” под регистрационным номером №VB-04.

2. Иммуноферментная тест-система для диагностики антител к вирусу кори, включающая планшет с иммобилизованным инактивированным антигеном вируса кори, концентрат фосфатно-солевого буфера с твином (ФСБ-Т), блокирующий раствор; цитратно-фосфатный буферный раствор для субстрата с перекисью водорода (ЦФР); ортофенилендиамин (ОФД), жидкую положительную контрольную сыворотку (К+), жидкую отрицательную контрольную сыворотку (К-), антитела против иммуноглобулинов человека, меченные пероксидазой хрена (конъюгат) в жидкой форме, жидкий стоп-реагент, отличающаяся тем, что в качестве иммобилизованного инактивированного антигена вируса кори тест-система содержит высокоочищенный антиген, приготовленный на основе штамма вируса кори NovO/96 (регистрационный номер №VB-04).

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

PD4A Изменение наименования, фамилии, имени, отчества патентообладателя

(73) Патентообладатель(и):Федеральное бюджетное учреждение науки «Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии «Вектор» (RU)

Адрес для переписки:630559, Новосибирская обл., Новосибирский р-н., р.п. Кольцово, ФБУН ГНЦ ВБ «Вектор»

Дата публикации: 20.03.2012

---