Способ прогнозирования оптимального температурного режима проведения гипертермии у гнойно-септических больных
Изобретение относится к медицине и может быть использовано для прогнозирования оптимального температурного режима проведения гипертермии у гнойно-септических больных. Перед сеансом гипертермии у каждого больного проводят исследование микроорганизмов, используя культуральный метод, при разных температурных режимах от 40 до 43С. Определяют оптимальную температуру, при которой рост микроорганизмов наименьший, сохраняется их максимальная чувствительность к антибиотикам, а пролиферативная активность лимфоцитов крови больного, оцениваемая путем реакции бласттрансформации, наименее отличается от исходной. Способ позволяет повысить эффективность прогнозирования оптимального температурного режима проведения гипертермии у гнойно-септических больных. 3 з.п. ф-лы.
Изобретение относится к медицине, а именно к травматологии и ортопедии, гнойной хирургии, и может быть использовано при лечении гнойно-септических осложнений в послеоперационном периоде.
Известны различные способы исследования микробной флоры при гнойных осложнениях для идентификации возбудителя и определения ее чувствительности с целью проведения целенаправленной антибактериальной терапии.Культуральное исследование включает посев на искусственные питательные среды, выделение и идентификацию чистой культуры микроорганизмов, определение чувствительности к антибактериальным препаратам, определение минимальной ингибирующей концентрации препарата в отношении выявленного возбудителя [3, 4].В соответствии с Методическими материалами по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств МЗ СССР для оценки влияния фармакологических средств на иммунный статус изучается:- влияние на гуморальный иммунный ответ (определение антител в сыворотке крови, метод Ерне и Нордин, ГНТ);- влияние на клеточный иммунный ответ (ГЗТ, реакция торможения миграции макрофагов, РТПХ);- воздействие на моноциты и макрофаги (спонтанная миграция макрофагов, фагоцитарная активность);- влияние на систему комплемента;- воздействие на пролиферацию и кооперацию Т- и В-лимфоцитов (РБТЛ под влиянием Т- и В- клеточных митогенов, оценка митогенных свойств исследуемого препарата, кооперация Т- и В-лимфоцитов);- митостатическое и лимфотоксическое действие;- аллергизирующее действие.Наиболее близкими к заявленному способу являются унифицированные бактериологические (культуральные) методы исследования [2], а также способ оценки митостатических и лимфотоксических свойств лекарственных препаратов по пролиферации Т- и В-лимфоцитов [1].Данные методы не позволяют оценить функциональные свойства микроорганизмов и лимфоцитов крови больного при повышении температуры, поэтому в условиях гипертермии при проведении стандартного исследования мы не можем оценить реальную патогенность возбудителя.Задача изобретения: разработка эффективного и безопасного способа проведения гипертермии и оптимизация адаптационных реакций со стороны клеток иммунной системы в постгипертермическом периоде.При решении поставленной задачи имеет место положительный лечебный эффект. Способ позволяет определить оптимальный режим для проведения гипертермии индивидуально у каждого больного в целях повышения эффективности антибактериальной терапии, а также для модуляции биохимических свойств микроорганизмов и прогнозировать интенсивность развития адаптационных реакций со стороны клеток иммунной системы; в результате этого улучшаются результаты лечения послеоперационных гнойно-септических осложнений.При использовании способа имеет место экономический эффект, который заключается в сокращении стоимости лечения больных с гнойно-септическими послеоперационными осложнениями за счет уменьшения использования дорогостоящих антибактериальных препаратов, сокращения сроков нетрудоспособности больного.При использовании способа имеет место социальный эффект - уменьшается риск инвалидизации пациентов.Технический результат достигается за счет того, что при проведении бактериологического метода исследования возбудителя гнойно-септических осложнений при разных температурных режимах определяют температуру, при которой отмечен минимальный рост культуры возбудителя и при этом сохраняется максимальная чувствительность его к антибиотикам. Оценивают изменение биохимических свойств, что в свою очередь отражает изменения патогенности выделенного возбудителя. Полученные данные и температурный режим сопоставляются; одновременно оценивают, как изменяется по сравнению с исходной пролиферация лимфоцитов крови больного in vitro при полученной температуре и будут ли достаточны возможности иммунной системы, ее ответ при гипертермии.Поставленная задача решается за счет того, что проводят исследование микроорганизмов при разных температурных режимах, регистрируют температуру, при которой рост микроорганизмов наименьший; одновременно определяют температуру, при которой сохраняется максимальная чувствительность к антибиотикам. Выбирают оптимальные температурные условия, при которых сохраняется наименее отличающаяся от исходной пролиферативная активность лимфоцитов крови больного. Определяют температуру гипертермии, сопоставляя температуру наименьшего роста микроорганизмов, максимальную чувствительность к антибиотикам с температурой оптимальной пролиферативной активности лимфоцитов. Определение температурного режима проводят у каждого больного перед сеансом гипертермии.Способ осуществляется следующим образом.При возникновении гнойно-септических осложнений у больного в послеоперационном периоде проводится исследование раневого отделяемого для идентификации возбудителя. После взятия мазка из раны для выделения возбудителя производят посевы на питательные среды [3, 4]. Контрольная культура выращивается при 37С, опытная - при различных температурных режимах (40,0; 40,5; 41,0; 41,5; 42,0; 42,5; 43С). По окончании периода культивирования определяют размер колоний, их морфологию. Например, колонии золотистого стафилококка имеют ярко-золотистый цвет. Для определения лецитиназной активности используют селективную среду - желточно-солевой агар (ЖСА). При расщеплении лецитовителлина вокруг лецитиназоположительных колоний на поверхности среды образуется радужный венчик.Протеолитическую активность оценивали по отношению к протеину молока на молочно-солевом агаре по величине зоны просветления вокруг колонии. Выделение чистой культуры золотистого стафилококка проводили повторным высевом из идентифицированной колонии на простом агаре. Биохимическая идентификация золотистого стафилококка проводилась по следующим параметрам:- плазмокоагуляция: при заражении кроличьей плазмы и инкубации в течение 18 часов плазма становится желеобразной, так как под действием фермента плазмокоагулазы активируется естественная система свертывания крови. Реакцию учитывают через 1, 2, 4 и 18 часов при инкубации в термостате при 37С. Отсутствие свертывания плазмы через 18 часов расценивается как отрицательная реакция;- определение ДНК-азы: под действием ДНК-азы, добавленной в плотную среду, высокополимерная ДНК распадается на фрагменты, при этом мутная среда становится прозрачной. (Вокруг культуры - прозрачная зона, в 4 раза превышающая зону микробного роста.);- ферментация маннита: в анаэробных условиях при окислении маннита образуется уксусная кислота, которая закисляет среду, что выявляется при помощи индикатора (появляется желтое окрашивание). При внесении культуры в столбик среды и последующей инкубации изменяется цвет питательной среды из розового в желтый;- хлопьеобразование: при внесении культуры золотистого стафилококка в кроличью плазму рост в ней происходит неравномерно, хлопьями, в виде “снежной бури”.При наличии обязательного положительного теста на плазмокоагулазу, а также положительных результатов указанных выше тестов делается заключение об идентификации золотистого стафилококка.Чувствительность к антибиотикам определяли на среде АГВ. Микробная суспензия, разведенная до необходимой концентрации (5 млн микробных тел в 5 мл 0,9% р-ра хлорида натрия) по стандарту мутности, наслаивается на чашку Петри со средой, подсушивается в термостате в течение 15 мин. Диски с антибиотиками накладываются на культуру стафилококков и культивируются. Чувствительность к данному антибиотику определяется по величине зоны задержки роста вокруг диска при инкубации в термостате в течение 18-20 часов при 37С. По окончании этого срока проводят учет результатов на темной матовой поверхности. При помощи линейки измеряют зону задержки роста вокруг диска.При величине зоны задержки роста в 15-20 мм определяется умеренная чувствительность к данному антибиотику, более 20 мм - высокая чувствительность.При культивировании на питательных средах в термостате при 42С золотистый стафилококк утрачивал свою патогенность и по биохимическим тестам проявлял себя как эпидермальный стафилококк (отсутствовал пигмент, лецитиназа, гемолиз, отрицательная реакция плазмокоагуляции, не определялась ДНК-аза, окисления маннита в анаэробных условиях не происходило). Уменьшалось количество выросших колоний на плотных питательных средах. При определении чувствительности к антибиотикам при 42С увеличивалась зона просветления вокруг диска с антибиотиками.Одновременно с исследованием влияния повышенной температуры на идентифицированный возбудитель раневой инфекции проводится изучение воздействия гипертермии на иммунокомпетентные клетки больного, в частности на их пролиферативную активность.Учитывая то, что снижение количества иммунокомпетентных клеток и уменьшение их функциональной активности является неблагоприятным фактором в течении гнойного процесса, а исходная функциональная активность у каждого больного различна, предложен способ прогнозирования развития гематологических осложнений при проведении гипертермии. До проведения процедуры гипертермии у больного берется 10 мл периферической венозной крови в стерильную пробирку с добавлением гепарина. Кровь наслаивается на градиент фиколла - верографина с плотностью 1,078 г/см3 и центрифугируется при 1500 об/мин в течение 45 минут. Клетки интерфазы, полученные в результате центрифугирования, собираются, трижды отмываются в физиологическом растворе, осаждаются и используются для исследования [5]. Контрольной культурой являются интактные клетки, опытной - клетки, подвергнутые нагреванию в различных температурных режимах: (40,0; 40,5; 41,0; 41,5; 42,0; 42,5; 43С). Клетки культивируются в СО2 96-луночных планшетах, в асептических условиях, в концентрации 1000000/мл в питательной среде RPMI - 1640, с добавлением 2мМ L-глутамина, 80 мкг/мл гентамицина, 5% инактивированной нагреванием сыворотки крови АВ IV, 10 мМ HEPES-буфера, 510-5 М 2 - меркаптоэтанола, в течение 72 часов, при 37С и 5% содержании CO2 в атмосфере.Пролиферативную активность клеток оценивали по включению меченного тритием тимидина в ДНК во время деления. За 18 часов до окончания инкубационного периода тимидин вносили в лунки в количестве 1 мк/Кюри на лунку. По окончании периода культивирования клетки собирали на стекловолокнистые фильтры при помощи 12-канального полуавтоматического харвестера. Высушенные фильтры помещали в виалы с 10 мл толуолового сцинтиллятора и проводили измерение радиоактивности в жидкостном сцинтилляционном счетчике в импульсах в минуту [6]. Пролиферативная активность в культурах, подвергнутых нагреванию, выражается в виде индекса влияния, который представляет собой отношение среднего числа имп./мин в опытной культуре к среднему числу имп./мин в контрольной культуре. При получении индекса влияния менее 0,5 делают заключение о высоком риске развития гематологических осложнений. Для проведения гипертермии выбирается тот режим, при котором происходит наименьшее снижение пролиферативной активности мононуклеарных клеток крови, и наиболее эффективный по отношению к микрооганизму.На основании сочетания этих данных определяется оптимальная температура гипертермии для конкретного больного, при достижении которой больному внутривенно вводится антибиотик согласно полученной чувствительности.Пример конкретного выполнения.Больной К. 46 л. поступил 10.04.2001 г. (№ ист. 917) в отделение эндопротезирования и эндоскопической хирургии суставов Новосибирского НИИТО. При поступлении жалобы: на наличие свищей в области послеперационного рубца левого бедра с гнойным отделяемым, периодический подъем температуры до 37,2-37,4С, боли в левом бедре при ходьбе.Из анамнеза: в 1986 г. появились боли в левом тазобедренном суставе. В 1995 г. по поводу двустороннего идиопатического коксартроза 3 ст. выполнено эндопротезирование левого тазобедренного сустава эндопротезом ЭСИ. В апреле 2001 г. по поводу асептической нестабильности эндопротеза ЭСИ левого тазобедренного сустава в НИИ травматологии и ортопедии г. Новосибирска проведено ревизионное эндопротезирование левого тазобедренного сустава с использованием индивидуальной антипротрузионнной вертлужной чашки и ревизионной бедренной ножки с костной аллопластикой и фиксацией цементом Полакрис. В послеоперационном периоде больному выполнена ревизия раны по поводу свернувшейся гематомы, санация и дренирование. Заживление вторичным натяжением. В декабре 2000 г. самопроизвольно вскрылся абсцесс в области левого бедра и сформировался свищ. Лечился в поликлинике по месту жительства. Консервативное лечение его неэффективное. При бактериологическом исследовании свищевого отделяемого обнаружен золотистый стафилококк. Чувствительность к антибиотикам ограничена. Направлен в НИИТО г. Новосибирска.При поступлении больного проведено клинико-рентгенологическое обследование. Поставлен диагноз: Глубокая хроническая парапротезная инфекция. Хронический постимплантационный остеомиелит проксимального конца левого бедра, свищевая форма.По результатам предоперационного обследования (общий анализ крови - эр. - 4,41012/л; гем. – 135 г/л; л. - 5,4 10%, э - 6, п - 3 с - 59 л - 28 м - 4; ЛИИ 0,18; абсолютное число лимфоцитов 3,0510%; СОЭ 28 мм/ч. Биохимия крови - общий белок 74 г/л; мочевина 9,0 ммоль/л; общий билирубин 2,04 мкмоль/л; К плазмы 4,0 ммоль/л; глюкоза крови 4,6 ммоль/л; АПТВ 42 с; протромбиновый индекс 98%; фибриноген 5,3 г/л; общий анализ мочи: цвет - желтый; уд. вес-1018; прозрачность - сл. мутная; белок - отр.; сахар - отр.; реакция - кислая; лейкоциты 1-3 в п/зр.; эп. плоский 0-1 в п/зр, экспрессия RGH отрицательная, экспрессия йнтерлейкина 1 и 4 отрицательная, экспрессия TNF -положительная) получены данные за вялотекущий воспалительный процесс.Руководствуясь клиническими данными и стандартными лабораторными исследованиями, определены показания к оперативному лечению, и 18.05.2000 г. была проведена операция: Фистулотомия, ревизия эндопротеза левого тазобедренного сустава, остеонекрэктомия, санация и дренирование парапротезной области. Рана дренирована сквозными хлорвиниловыми дренажами. Рана постояно промывалась раствором бетадина. При бактериологическом исследовании раневого отделяемого выделены Е. Coli, Enterococcus faecium. На контрольных посевах из дренажей выделялась mix-инфекция: St. aureus и Ps. aeruginosae.В связи с этим больному проведено культуральное исследование выделяемых микроорганизмов и определение их чувствительности к антибиотикам при разных температурных режимах. Одновременно проведено исследование пролиферативной активности лимфоцитов при тех же температурных режимах. Определив температурный режим, при котором рост колоний микроорганизмов минимальный (42,5С), а максимальная чувствительность при такой температуре определяется к ампицилину (диаметр 32 мм) и при этом сохраняется достаточная пролиферация лимфоцитов, не отличающаяся от исходной, проведен сеанс гипертермии. Сеанс проводился на 10 сутки после операции. Гипертермия проведена под наркозом и при достижении температуры 42,5С с экспозицией 20 минут введен внутривенно ампициллин 10 г. Дренажи удалены на 14 сутки после операции. Рана зажила первичным натяжением. В постгипертермическом периоде проводилась иммуномодулирующая терапия (полиоксидоний, тиофан, коредон, ветом). Проводились многократные пункции парапротезной области. После эвакуации пунктата (в среднем 100 мл) вводился концентрированный бетадин в объеме 10 мл. Удаляемый пунктат многократно исследовался на наличие возбудителя. Результаты исследования пунктата были отрицательные. Рентгенологический контроль области левого тазобедренного сустава и левой бедренной кости без ухудшения.Больной в удовлетворительном состоянии 11.07.2001 г. (проведено 92 койко/дня) выписан на амбулаторное лечение. На момент выписки клинико-лабораторных данных за воспалительный процесс не выявлено. Функция левого тазобедренного сустава и спорность левой нижней конечности сохранена. Общий анализ крови: эр. 3,81012/л; гем 109 г/л; л 4,610%, п - 5, с - 73 л - 16 м - 6; ЛИИ 3,77; абсолютное число лимфоцитов 0,7410%; СОЭ 41 мм/ч. Биохимия крови: общий белок 60 г/л; мочевина 5,8 ммоль/л; молекулы средней массы 0,354 (норма - 300); общий билирубин 7,24 мкмоль/л; К плазмы 5,1 ммоль/л; глюкоза крови 4,9 ммоль/л; АПТВ 33 с; протромбиновый индекс 87%; фибриноген 4,0 г/л. Общий анализ мочи: цвет - желтый; уд.вес 1018; прозрачность - сл. мутная; белок отр.; сахар отр.; реакция кислая; лейкоциты 1-3 в п/зр.; эп. плоский 0-1 в п/зр.Источники информации1. Методические материалы по экспериментальному (фармакологическому) и клиническому испытанию иммуномодулирующего действия фармакологических средств / МЗ СССР, Фармакологический комитет. - Москва, 1984. - С. 7-22.2. Методические указания по применению унифицированных бактериологических (культуральных) методов исследования. - Москва, 1985.3. Приказ Министерства Здравоохранения СССР № 720 от 18.07.1978 г. “Об улучшении медицинской помощи больным с гнойными хирургическими заболеваниями и усилении мероприятий по борьбе с внутрибольничными инфекциями”.4. Приказ Министерства Здравоохранения СССР № 535 от 25 апреля 1985 г. “Об унифицировании микробиологических (бактериологических) методов исследования, применяемых в клинико-диагностических лабораториях и лечебно-профилактических учреждений”.5. Фримель Г. Иммунологические методы. - М.: Медицина, 1987. - С. 244-248.6. Phillips R., Rabson A.R. The effect of interleukin 1 (IL1) containing supematants on murine thymocyte maturation // J. Clin. Lab. ImmunoL, 1983. - V. 11. P. 101-104.Формула изобретения
1. Способ определения оптимального температурного режима проведения гипертермии у гнойно-септических больных, отличающийся тем, что проводят исследование микроорганизмов при разных температурных режимах от 40 до 43С, с определением оптимальной температуры, при которой рост микроорганизмов наименьший, сохраняется их максимальная чувствительность к антибиотикам, а пролиферативная активность лимфоцитов крови больного наименее отличается от исходной.2. Способ по п.1, отличающийся тем, что исследование микроорганизмов проводят путем использования культурального метода, а оценку пролиферативной активности лимфоцитов - путем реакции бласттрансформации.3. Способ по п.1, отличающийся тем, что оптимальный температурный режим проведения гипертермии определяют, сопоставляя температуру наименьшего роста микроорганизмов, их максимальной чувствительности к антибиотикам с температурой оптимальной пролиферативной активности лимфоцитов.4. Способ по п.1, отличающийся тем, что определение температурного режима проводят у каждого больного перед сеансом гипертермии.