Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта чародей с помощью agrobacterium tumefaciens

 

Изобретение относится к селекции растений. Экспланты растений картофеля сорта Чародей сокультивируют с трансформированным штаммом A. timefaciens, а затем помещают на питательную среду для инициации каллусообразования с последующей регенерацией из них фертильных трансгенных растений. Сокультивирование осуществляют контактированием эксплантов с бумажным фильтром, смоченным бактериальной суспензией, в течение 48±4 часа. Для инициации каллусообразования экспланты помещают на питательную среду, содержащую зеатин в количестве 0,1-1,5 мг/л, БАП 0,1-1,5 мг/л и НУК 0,005-0,45 мг/л. На восьмой день экспланты помещают на среду для регенерации, содержащую зеатин в количестве 0,1-1,5 мг/л, БАП 0,1-1,5 мг/л и ГК₃ 0,01-0,05 мг/л. В результате увеличивается выход трансформированных растений. 4 з.п. ф-лы, 2 ил., 7 табл.

Изобретение относится к селекции и биотехнологии растений, в частности генной инженерии. Изобретение может быть использовано для получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Чародей, экспрессирующего различные гетерологичные гены.

Способ получения трансгенных растений картофеля сорта Чародей заключается в генетической трансформации сегментов стебля (эксплантов) in vitro культивируемых растений картофеля методом сокультивирования с Agrobacterium tumefaciens, несущей рекомбинантные плазмиды с селективными, маркерными и полезными генами, и в последующей регенерации до фертильных трансгенных растений, имеющих внесенные гены и сохраняющих все признаки исходного сорта.

Картофель (Solanum tuberosum var. tuberosum) выращивается в России повсеместно, практически во всех климатических зонах. Относительно высокая продуктивность при известной простоте возделывания позволяет картофелю стабильно занимать второе место после злаковых культур в отечественном сельскохозяйственном производстве. Сегодня более 90% товарного картофеля производится в личных подсобных хозяйствах (ЛПХ), а для наименее обеспеченных слоев населения картофель находится на первом месте в рационе питания.

Таким образом, проблема получения стабильного урожая картофеля является одной из важнейших. В России решение этой проблемы осложняется рядом неблагоприятных факторов, среди которых основное место занимают потери урожая от болезней, вредителей и сорной растительности.

Первые работы по трансформации картофеля были начаты в восьмидесятых годах XX века [Ooms G., Hooykaas P.J.J., van Veen R.J.M., van Bellen P., Regensburg-Tuink T.J.G., Schilperoort R.A. Plasmid 1985 7: 15-29] и в 1986 году впервые была показана возможность получения картофеля с использованием Agrobacterium tumefaciens [An G., Watson B.D., Chiang C.C. Plant Physiology, 1986, v.81, p.301-305] сотрудниками Центра "Биоинженерия" РАН в 1990-1992 г. [Глагоцкая Т.Ц., Шульга О.А., Сидоров В.А., Захарьев В.М., Скрябин К.Г., Глеба Ю.Ю. ДАН СССР 314, №5, с.1240-1242, 1990, Feher A., Skryabin K.G, Balazs E., Preiszner J., Shulga O.A., Zakharyev V.M., Dudits D. Plant Cell Reports, 1992, v.11, p.48-52].

За первыми попытками последовало более 200 работ, многие из которых посвящены модификации и оптимизации процедуры трансформации [Tavazza R., Tavazza М., Ordas R.J., Ancora G., Benvenuto E. Plant Science, 1988, v.59, p. 175-181; Snyder G.W. & Belknap W.R. Plant Cell Reports, 1993, v.12, p.324-327]. Миновав первый этап разработки и освоения методов трансформации, к настоящему моменту во многих странах перешли к этапу внедрения полученных результатов в производство, что, в свою очередь, обусловило переход от работы с модельными, легко трансформируемыми генотипами к коммерческим генотипам (сортам). Однако подавляющее большинство коммерческих сортов картофеля, включая и основные российские сорта, не относится к легко трансформируемым.

Несмотря на усилия по созданию единой эффективной методики трансформации, такая система трансформации для различных генотипов (сортов) до сих пор не создана. При необходимости получения модифицированных растений трудно трансформируемых коммерческих сортов приходится проводить оптимизацию протокола для каждого генотипа [Wordragen M.F. & Dons H.J.M. Plant Molecular biology reporter, 1992, v.10(1), p.12-36].

Наиболее близким к предложенному является способ получения генетически модифицированных растений картофеля [Гулина И.В. Создание трансгенных растений картофеля, экспрессирующих модифицированный ген δ-эндотоксина из В. thuringiensis var tenebrionis. Диссертация, М., 1994, с.9, б-ка Института молекулярной биологии им. В.А.Энгельгардта].

Этот способ получения генетически модифицированных растений картофеля осуществляется следующим образом (модификация известного метода Horsch R.B., Rogers S.G., Fraley R.T. Transgenic plants. Cold Spring Harb Symp Quant Biol. 1985; 50:433-7).

Стеблевые сегменты картофеля получали из растений, выращенных асептически в течение четырех недель на среде S1, и переносили их в жидкую среду MS. Ночную культуру штамма Agrobacterium tumefaciens добавляли к стеблевым сегментам, находящимся в чашке Петри в 10 мл жидкой среды MS таким образом, чтобы соотношение культуры штамма Agrobacterium и среды инкубирования составляло 1:20. Сокультивирование штамма Agrobacterium и стеблевых сегментов растений картофеля проводили в течение 16-18 часов при 28°С в темноте. По окончании инкубации сегменты переносили на среду MS, содержащую агар в концентрации 0,7%. Через трое суток сегменты переносили на среду MSV с фитогормонами состава: 0,2 мг/л ИУК, 1 мг/л зеатина, 0,02 мг/л ГК₃, 1 мг/л БАП, соли MS, 0,7% агар, 100 мкг/мл цефотаксима, 200 мкг/мл карбенициллина, 50 мкг/мл канамицина. Регенеранты переносили на среду S1, содержащую селективный агент и цефотаксим, чтобы предупредить агробактериальное заражение растений. Изобретение относится к селекции и биотехнологии растений, в частности генной инженерии. Изобретение может быть использовано для получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Луговской, экспрессирующего различные гетерологичные гены. Данная методика не является эффективной для картофеля сорта Чародей.

В ближайшем аналоге раскрыта методика получения трансгенного картофеля на примере другого сорта. По мнению авторов заявки и большинства специалистов в данной области процессы регенерации и трансформации растений являются генотипзависимыми, то есть эффективность и возможность получения положительного результата во многом определяются самим генотипом (в данном случае сортом).

Из этого следует, что для достижения высокой эффективности необходимо заново подбирать все условия (параметры) регенерации - трансформации для каждого конкретного сорта (генотипа).

Авторы использовали известную методику для сорта Чародей и получили низкую эффективность регенерации и трансформации (эти цифры приведены ниже).

Задачей изобретения является создание эффективной методики для трансформации растений картофеля сорта Чародей.

Технический результат изобретения заключается в повышении эффективности трансформации данного генотипа.

Развитие биотехнологии привело к переходу от фундаментальных работ к решению практических задач сельского хозяйства, фармацевтики, медицины. Для решения таких задач возникает проблема не просто получения трансгенного растения, а получения достаточного (по разным оценкам от сотен до нескольких тысяч) количества первичных трансгенных растений - индивидуальных трансформационных событий, среди общего пула которых возможно будет выбрать удовлетворяющие всем требованиям селекционеров - оригинаторов (трансгенное растение не должно отличаться от исходного по сортовым характеристикам), требованиям биобезопасности (стабильности введенной вставки в геноме в поколениях и т.д.), требованиям пищевой безопасности (генетически модифицированное не должно отличаться от исходного растения по пищевым и токсикологическим характеристикам). Таким образом, чем большее количество первичных трансгенных растений будет получено, тем быстрее и эффективнее будет решена конкретная задача.

Эффективность трансформации, понимаемая как отношение количества первичных трансгенных растений (для которых подтверждено наличие вставки в геноме) к общему количеству полученных регенерантов, напрямую зависит от эффективности регенерации, которая определяется как отношение количества полученных регенерантов (среди них могут быть как трансгенные, так и “пустые” нетрансгенные растения) к количеству эксплантов (то есть к количеству затраченного исходного материала). Оба показателя обычно представляют в процентах.

Технический результат достигается тем, что в способе получения генетически модифицированных растений картофеля, заключающемся в сокультивировании эксплантов со штаммом Agrobacterium tumefaciens, несущим рекомбинантные плазмиды с селективными маркерными и полезными генами, помещении эксплантов на питательную среду для инициации каллусообразования и последующей регенерации до фертильных трансгенных растений, имеющих внесенные гены и признаки исходного сорта, сокультивацию эксплантов картофеля сорта Чародей предпочтительно осуществлять путем раскладывания эксплантов на влажном бумажном фильтре, смоченном разведенной суспензией штамма Agrobacterium, и выдержки в течение 48±4 часов при 18-21°С±1°С, для инициации каллусообразования используют питательную среду, содержащую зеатин в количестве 0,1-1,5 мг/л, БАП в количестве 0,1-1,5 мг/л и ИУК в количестве 0,005-0,045 мг/л, а на восьмой день экспланты переносят на среду для регенерации, содержащую зеатин в количестве 0,1-1,5 мг/л, БАП в количестве 0,1-1,5 мг/л и ГК₃ в количестве 0,01-0,05 мг/л.

Для подготовки штамма Agrobacterium tumefaciens целесообразно его предварительно засевать штрихом на питательную среду на 3±5 суток в темноте при 24-29°С, за двое суток до сокультивации засевать полученной смесью колоний первую ночную культуру штамма Agrobacterium в питательной среде, за одни сутки до сокультивации засевать вторую ночную культуру путем внесения в питательную среду первой ночной культуры, в день сокультивации концентрируют ночную культуру, то есть осаждают и разводят осадок в жидкой среде.

Кроме того, отмывку эксплантов предпочтительно осуществлять путем помещения эксплантов в раствор, содержащий жидкую среду и антибиотик, подавляющий развитие штамма Agrobacterium, на 5-40 минут при комнатной температуре.

В другом варианте после помещения эксплантов в раствор отмывку можно проводить с использованием ротационной качалки.

Перечень графических материалов

На фиг.1 приведена карта плазмиды рВI121.

На фиг.2 приведен пример электрофоретического анализа продуктов ПЦР на препаратах ДНК модифицированных линий сорта Чародей (негатив).

Дорожки:

1, 20 - маркер молекулярной массы GeneRuler Fermentas, 100bp;

5, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 18 - ПЦР на препаратах ДНК растений, в которых не обнаружена трансгенная вставка;

6, 7, 8, 17, 19 - ПЦР на препаратах ДНК растений, в которых обнаружен перенесенный ген thau II;

4 - ПЦР на препарате ДНК растений исходного нетрансформированного сорта Чародей;

2 - продукт ПЦР на плазмидной ДНК (0,1 нг/реакцию), использованной для трансформации растений;

3 - ПЦР в отсутствие ДНК-матрицы (контроль качества реакционной смеси).

Способ получения генетически модифицированных растений картофеля сорта Чародей осуществляют следующим образом.

Данный протокол рассчитан на постановку одного трансформационного эксперимента исходя из среднего количества исходных растений - 100±10 шт. Среднее количество эксплантов - 500±50 шт.

Культура исходных растений: исходные растения, свободные от вирусной и вироидной инфекции, культивировали в асептических условиях в культуре in vitro. Для этого стебли исходных растений нарезали на черенки с одной пазушной почкой и культивировали в вегетационных сосудах на питательной среде, содержащей минеральные соли и витамины (например, среда Msbase, табл.3) при температуре +18-21°С±1°С в дневное и +15-18°С±1°С в ночное время; фотопериодичности 16 часов день/8 часов ночь (освещенность 120 μЕ) 3-5 недель.

Подготовку штамма Agrobacterium проводили следующим образом.

Засевали штамм Agrobacterium tumefaciens штрихом на питательную среду (например, среда LB, табл.6) на 3±0,5 суток в темноте при +25-28°С±1°С.

За два дня до планируемой трансформации засевали смесью колоний первую (I) ночную культуру штамма Agrobacterium объемом 1-6 мл±0,2 в питательной среде (например, среда LB, табл.6) при +25-28°С±1°С, 100-140±10 об/мин.

За день до сокультивации засевали вторую (II) ночную культуру объемом 5-10±3 мл. Для этого вносили в питательную среду (например, среда LB, табл.6) ночную культуру I в количестве 1/100 от конечного объема. Культивировали при +25-28°С±1°С, 100-140±10 об/мин.

Первый день трансформации

1. Концентрировали ночную культуру II, осадив при 3,5-5±0,5 тыс. об/мин в течение 3-10±1 мин. Развели полученный осадок в 3-10±1 мл жидкой среды (например, среда СМ, табл.3).

2. Нарезали стебель на сегменты без пазушных почек длиной 5-10±2 мм.

3. Сокультивация:

В чашки Петри помещали стерильные бумажные фильтры, равномерно смачивали их небольшим количеством разведенной агробактериальной суспензии (1-3±0,5 мл), экспланты раскладывали на влажном фильтре для сокультивации на 48±4 часов при 18-21°С±1°С.

В контрольном варианте использовали вместо агробактериальной суспензии такое же количество жидкой питательной среды (например, среда СМ, табл.3).

4. Отмывка эксплантов:

Вариант I. Помещали экспланты в раствор (15-50±10 мл), содержащий жидкую среду (например, среда СМ, табл.3) и раствор антибиотика, подавляющего развитие штамма Agrobacterium tumefaciens, на 10-30±5 минут при комнатной температуре (18-20°С).

Вариант II. Экспланты в растворе жидкой среды и антибиотика, приготовленном как в варианте I, отмывали с использованием ротационной качалки (шейкера) при 50-70±10 об/мин в течение 15-30±10 минут при комнатной температуре (18-20°С).

Третий день трансформации

После сокультивации (включая этап отмывки, когда она необходима) помещали экспланты на питательную среду (например, среда CIM, табл.3) для инициации каллусообразования.

Использовали в питательной среде для инициации каллусообразования: зеатин в концентрации от 0,6 до 1,0±0,5 мг/л, БАП в концентрации от 0,6 до 1,0±0,5 мг/л и ИУК в концентрации от 0,01 до 0,04±0,005 мг/л.

Восьмой день

Переносили экспланты на чашки со средой RM для регенерации (например, среда RM, табл.3) с добавлением селективного агента, выбранного в зависимости от используемой генетической конструкции.

Для тестирования эффективности процесса регенерации в контрольных вариантах использовали среду для регенерации без добавления селективного агента (например, среда RM, табл.3).

Использовали в питательной среде для регенерации зеатин в концентрации от 0,6 до 1,0±0,5 мг/л, БАП в концентрации от 0,6 до 1,0±0,5 мг/л и ГК₃ в концентрации от 0,02 до 0,04±0,01 мг/л.

Через каждые 14 дней

Переносили экспланты на свежие чашки Петри со средой для регенерации того же состава.

При появлении регенерантов

Срезали регенеранты и переносили их в пробирки, содержащие среду для укоренения (например, среда RIM, табл.3).

Первичные регенеранты, укоренившиеся на селективной среде, считали прошедшими первичный отбор.

Далее прошедшие отбор первичные регенеранты проверяли на наличие перенесенной генетической конструкции при помощи ПЦР-анализа с праймерами, специфичными для кодирующей области трансгенной конструкции. Уровень экспрессии целевого гена проверяли при помощи иммуноферментного анализа [Towbin H., Staehelin Т., Gordon J. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1979, v.76(9):4350-4].

Эффективность регенерации для предлагаемого способа составила 82,3% по сравнению с 69,5% для ближайшего аналога.

Эффективность трансформации в целом для предлагаемого способа составила 21,6% по сравнению с 15,0% для ближайшего аналога.

Экспериментальный пример использования патентуемого способа получения трансгенных растений картофеля сорта Чародей

Эксперимент по получению трансгенных растений картофеля сорта Чародей, экспрессирующих ген thau II суперсладкого белка из тропического растения Thaumatococcus danielli.

Культура исходных растений: исходные растения, свободные от вирусной и вироидной инфекции, в количестве 100 шт. культивировали в асептических условиях в культуре in vitro. Для этого стебли исходных растений нарезали на черенки с одной пазушной почкой и культивировали в вегетационных сосудах на питательной среде, содержащей минеральные соли и витамины (среда Msbase, табл.3) при температуре +18-21°С±1°С в дневное и +15-18°С±1°С в ночное время; фотопериодичности 16 часов день/8 часов ночь (освещенность 120 μЕ) 4 недели.

Для трансформации использовали штамм Agrobacterium tumefaciens CBE 121, содержащий плазмиду рВI121 (фиг.1), в состав кассеты экспрессии которой входят генетические конструкции:

промотор pNOS - ген NPT II - NOS-T терминатор 35S промотор-ген thau II - NOS Т терминатор.

Подготовку штамма A. tumefaciens CBE 121 проводили следующим образом. Засевали штамм A. tumefaciens CBE 121 штрихом на питательную среду LB (табл.4) на 3±0,5 суток в темноте при +26°С±1°С.

За два дня до планируемой трансформации засевали смесью колоний первую (I) ночную культуру штамма A. tumefaciens CBE 121 объемом 6 мл ±0,2 в питательной среде - среда LB (табл.6) при +26°С±1°С, 100-140±10 об/мин.

За день до сокультивации засевали вторую (II) ночную культуру объемом 6±1 мл. Для этого вносили в питательную среду LB (табл.6) ночную культуру I в количестве 1/100 от конечного объема. Культивировали при +26°С±1°С, 100-140±10 об/мин.

Первый день трансформации

Сконцентрировали ночную культуру II, осадив при 3,5±0,5 тыс. об/мин в течение 3±1 мин. Развели полученный осадок в 5±1 мл жидкой среды (среда СМ, табл.3). Нарезали стебель на сегменты без пазушных почек длиной 5-10±2 мм. Для проведения этапа сокультивации в чашки Петри помещали стерильные бумажные фильтры, равномерно смачивали их небольшим количеством разведенной суспензии штамма A. tumefaciens CBE 121 (2±0,5 мл), экспланты раскладывали на влажном фильтре для сокультивации на 48±4 часов при 18-21°С±1°С.

В контрольном варианте вместо суспензии штамма A. tumefaciens CBE 121 использовали такое же количество жидкой питательной среды (среда СМ, табл. 3).

После проведения этапа сокультивации отмывали экспланты по следующей схеме:

Помещали экспланты в раствор (25±10 мл), содержащий жидкую среду (среда СМ, табл.3), и раствор антибиотика карбенициллина (500 мг/л), подавляющего развитие штамма A. tumefaciens CBE 121, отмывали с использованием ротационной качалки (шейкера) при 50-70±10 об/мин в течение 30±10 минут при комнатной температуре (18-20°С).

Третий день трансформации

После сокультивации (включая этап отмывки) помещали экспланты на питательную среду (среда CIM, табл.3) для инициации каллусообразования.

Использовали в питательной среде для инициации каллусообразования: зеатин в концентрации 1,0±0,01 мг/л, БАП в концентрации 1,0±0,01 мг/л и ИУК в концентрации от 0,02±0,005 мг/л.

Восьмой день

Переносили экспланты на чашки со средой RM для регенерации (среда RM, табл.3) с добавлением селективного агента антибиотика канамицина в концентрации 100 мг/л. В качестве селективного агента использовали антибиотик канамицин, так как генетическая конструкция содержит ген NPT II, кодирующий фермент неомицинфосфотрансферазу, экспрессия которого обеспечивает устойчивость к антибиотику канамицину.

Для тестирования эффективности процесса регенерации в контрольных вариантах использовали среду для регенерации без добавления селективного агента (среда RM, табл.3).

Использовали в питательной среде для регенерации зеатин в концентрации от 1,0±0,01 мг/л, БАП в концентрации 1,0±0,01 мг/л и ГК₃ в концентрации 0,02±0,01 мг/л.

Через каждые 14 дней

Переносили экспланты на свежие чашки Петри со средой для регенерации того же состава.

При появлении регенерантов

Срезали регенеранты и переносили их в пробирки, содержащие среду для укоренения (среда RIМ, табл.3). Первичные регенеранты, укоренившиеся на селективной среде, содержащей антибиотик канамицин в концентрации 100 мг/л, считали прошедшими первичный отбор.

Далее прошедшие отбор первичные регенеранты проверяли на наличие перенесенной генетической конструкции при помощи ПЦР-анализа с праймерами, специфичными для кодирующей области трансгенной конструкции. Для ПЦР-анализа генома растений на наличие гена thau II были использованы праймеры ThauF и ThauR, последовательность которых была сконструирована на основе данных генбанка о последовательности гена тауматина T. daniellii (gi|3319903|emb|AJ007626.1|CMV7626) и промотора E35S (gi|170190|gb|J01209.1 |TDATHAU2). Оба праймера находятся на расстоянии 907 нуклеотидов друг от друга.

TF primer: 5' - CTG CCG АСА GTG GTC CCA AAG ATG GAC CC - 3'29 bp

>gi|3319903 |emb|AJ007626.1 |CMV7626 Cauliflower mosaic vims 35S promoter with artifical insert of 80 bp Length=423

Score=58.0 bits (29), Expect=2e-07

Identities=29/29 (100%) Strand=Plus/Minus

Query: 1 ctgccgacagtggtcccaaagatggaccc 29

Sbjct: 294 ctgccgacagtggtcccaaagatggaccc 266

TR primer: 5' - CAG TAG GGC AGA AAG TGA CCC TGT AGT TG - 3'29 bp

>gi|170190|gb|J01209.1|TDATHAU2 T.daniellii preprothaumatin-2 mRNA, complete cds Length=931

Score=58.0 bits (29), Expect=2e-07

Identities=29/29 (100%) Strand=Plus/Minus

Query: 1 cagtagggcagaaagtgaccctgtagttg 29

Sbjct: 716 cagtagggcagaaagtgaccctgtagttg 688

Методика проведения ПЦР-анализа

Проведение ПЦР осуществляли на ДНК-амплификаторе Techne Genius. Центрифугирование осуществляли на настольной микроцентрифуге Eppendorf 5415С с максимальной скорость вращения ротора 14000 об/мин. Термостатирование образцов осуществляли в сухом термостате “Термо 28-23”. Анализ продуктов ПЦР производили путем электрофореза в агарозном геле соответствующей концентрации при напряженности электрического поля 6 В/см с последующим окрашиванием гелей бромистым этидием (концентрация красящего раствора 1 мкг/мл в воде, время окрашивания - 20 минут при комнатной температуре) и фотографированием полученной картины в ультрафиолете (длина волны - 260-280 нм) на фотопленку “Микрат-Изопан” при помощи TTL-фотоаппарата типа “Зенит” (светофильтр КС-8). Ввод полученных данных электрофореза в компьютер осуществляли посредством прямого сканирования негативов на сканере Mustek 9600. Обработку оцифрованной информации проводили при помощи пакета Adobe Photoshop 5.0.

Состав реакционной смеси для ПЦР:

- Праймеры - по 25 пМ каждого;

- 10X буфер - 2,5 мкл;

- 2 мМ dNTP - 2,5 мкл;

- BioTaq полимераза 5Е мкл - 0,5 мкл;

- ДНК-матрица - 100 нг;

- H₂O - до 25 мкл.

Условия проведения ПЦР были выбраны следующие: 43 цикла: 94°С - 5 сек, 55°С - 5 сек, 72°С - 20 сек, окончательная полимеризация - 7 минут.

Появление продукта ПЦР с указанными праймерами и длиной 907 нуклеотидов при условии отсутствия его в реакциях, поставленных на контрольной ДНК, свидетельствует о присутствии искомого гена в геномной ДНК анализируемой линии.

Иммуноферментный анализ белка тауматин II

Ткани трансформированных и контрольных растений замораживали в жидком азоте и разрушали растиранием в ступке. К полученным лизатам добавляли однократный буфер нанесения для SDS-элфектрофореза и разделяли растительные белки вместе с маркерными по Лэмми [Laemmli, 1970]. Фракционные белки электрофоретически переносили на нитроцеллюлозную мембрану и проводили иммунное проявление по Тоубину [Towbin et al., 1979]. Полученные блоты инкубировали со специфическими антителами против белка тауматин II, затем с антикроличьими антителами, конъюгированными с пероксидазой. Для визуализации сигналов на блотах их обрабатывали раствором диаминобензидина с перикисью водорода. Для количественной детекции белка тауматин II одновременно с исследуемыми образцами на форез наносили образцы с известной концентрацией белка тауматин II. После иммуноблотинга количество белка в исследуемых образцах определяли путем сравнения интенсивности сигналов с сигналами контрольных образцов.

Результаты эксперимента по получению трансгенных растений картофеля сорта Чародей, экспрессирующих ген thau II

В результате проведения одного трансформационного эксперимента (по описанному выше протоколу) было получено 451 регенерантов из 548 эксплантов от 100 исходных растений. Таким образом, эффективность регенерации (процентное отношение количества регенерантов к количеству эксплантов) составила 82,3%.

Последующий после получения регенерантов и первичного отбора на селективной среде первичный молекулярный анализ методом ПЦР подтвердил наличие перенесенного гена thau II в геноме 97 растений (фиг.2), следовательно, эффективность трансформации (процентное отношение трансформантов к количеству регенерантов) составила 21,6%.

Дальнейший молекулярно-биологический анализ не выявил различия в уровнях экспрессии белка тауматин II в полученных трансгенных линиях картофеля сорта Голубизна (табл.1).

В период с 15 июня 2001 по 20 сентября 2001 года на сертифицированном МВК ГИД участке ВНИИ Фитопатологии РАСХН, пос. Б. Вяземы, Московская обл., были проведены ограниченные полевые испытания отобранных трансгенных линий картофеля сорта Чародей, экспрессирующих ген белка тауматин II.

Были высажены 110 растений трансгенных линий (и.т.с.) сорта Чародей, также были высажены 30 контрольных нетрансформированных растений сорта Чародей. В конце вегетационного периода были получены клубни всех трансгенных линий.

Урожайность трансгенных линий (и.т.с.) оценивали по следующим показателям: средняя масса клубней, г/куст и среднее количество клубней на куст. Статистическую обработку полученных данных проводили при помощи пакета программ Statistica 5.5. Математический анализ урожайности контрольных и трансгенных линий (и.т.с.) картофеля показал, что между трансгенными и контрольными растениями нет существенных различий по показателям урожайности, т.к. уровень значимости (вероятность существенности различий) (см. табл.2) не превысил ни по одному показателю 95%.

В результате проведения полевых испытаний были отобраны 3 трансгенные линии (и.т.с.) сорта Чародей, экспрессирующие ген белка тауматин II. Отобранные линии жизнеспособны и фенотипически не отличаются от контрольных нетрансформированных растений исходного сорта.

Для приготовления сред, представленных в табл.3, готовили раствор MS-солей в деионизованной воде, доводя рН до значения 5,6-5,8±0,1 с помощью растворов 1N КОН и 1N HCl. Стерилизацию сред осуществляли в автоклаве при 1 атм, 121°С в течение 20 минут. После охлаждения среды до +45-50°С добавляли витамины (табл.4), гормоны, антибиотики и селективные агенты (методика приготовления и концентрации стоков см. табл.5) соответственно составу сред и заливали чашки Петри (⊘ 9 см) по 20±5 мл среды в каждую. В табл.6 приведен состав питательной среды Luria-Bertani. В табл.7 приведены наименования и происхождение препаратов.

Список сокращений и терминов

Сb - карбенициллин;

Cf - цефотаксим;

Km - канамицин;

LB - питательная среда Luria-Bertani;

Rf - рифампицин;

БАП (ВАР) - 6-бензиламинопурин;

ГК₃ (GA₃) - гиббереллиновая кислота;

ИМК (IBA) - индолил-3-масляная кислота;

ИУК (IAA) - индолилуксусная кислота;

ПЦР - полимеразная цепная реакция;

среда Msbase - среда базовая на основе смеси солей;

среда СМ - среда для сокультивации - co-cultivation media;

среда CIM - среда для инициации каллусообразования - callus induction media;

среда RM - среда для регенерации - regeneration media;

среда RIM - среда для корнеобразования - root induction media;

л - литр;

мл - миллилитр;

мкл - микролитр;

мкг/мл - микрограмм в миллилитре;

мг/л - миллиграмм в литре;

л/га - литров на гектар;

мМ - миллимоль вещества;

пМ - пикомоль вещества;

нг - нанограмм;

В/см - вольт на см;

шт. - штук;

об/мин - оборотов в минуту;

нм - нанометр;

мкм - микрометр;

см - сантиметр;

мм - миллиметр;

сек - секунда;

мин - минута;

°С - градусы по Цельсию;

атм - атмосфера;

МВК ГИД - Межведомственная комиссия по генно-инженерной деятельности;

РАСХН - Российская Академия Сельскохозяйственных Наук;

И.т.с. - индивидуальное трансформационное событие;

dNTP - дезоксирибонуклеотиды;

MQ - установка Milli Q для деионизирования воды;

рН - водородный показатель;

N - нормальность;

pNOS - промотор;

NPT II - ген, кодирующий белок неомицинфосфотрансферазу;

NOST - терминатор;

35S - промотор;

pBIBar - плазмида;

Bar - ген белка;

LBA 4404 - штамм Agrobacterium tumefaciens.

Формула изобретения

1. Способ получения генетически модифицированных растений картофеля, заключающийся в сокультивировании эксплантов со штаммом Agrobacterium tumefaciens, несущим рекомбинантные плазмиды с селективными маркерными и полезными генами, помещении эксплантов на питательную среду для инициации каллусообразования и последующей регенерации до фертильных трансгенных растений, имеющих внесенные гены и признаки исходного сорта, отличающийся тем, что для инициации каллусообразования эксплантов картофеля сорта Чародей используют питательную среду, содержащую зеатин в количестве 0,1-1,5 мг/л, БАП в количестве 0,1-1,5 мг/л и НУК - 0,005-0,45 мг/л, а регенерацию начинают на восьмой день с использованием среды, содержащей зеатин в количестве 0,1-1,5 мг/л, БАП в количестве 0,1-1,5 мг/л и ГК₃ - 0,01-0,05 мг/л.

2. Способ по п.1, отличающийся тем, что сокультивацию осуществляют путем раскладывания эксплантов на влажном бумажном фильтре, смоченном разведенной суспензией штамма Agrobacterium tumefaciens, с последующей выдержкой в течение (48±4) ч при 18-21°С±1°С.

3. Способ по п.1 или 2, отличающийся тем, что для подготовки штамма Agrobacterium tumefaciens его предварительно засевают штрихом на питательную среду на (3±0,5) суток в темноте при 24-29°С, за двое суток до сокультивации засевают полученной смесью колоний первую ночную культуру штамма Agrobacterium tumefaciens в питательной среде, за одни сутки до сокультивации засевают вторую ночную культуру путем внесения в питательную среду первой ночной культуры, в день сокультивации концентрируют ночную культуру, осаждают и разводят осадок в жидкой среде.

4. Способ по любому из пп.1-3, отличающийся тем, что после сокультивации помещают экспланты в раствор, содержащий жидкую среду и антибиотик, подавляющий развитие штамма Agrobacterium tumefaciens, на 5-40 мин при комнатной температуре для отмывки эксплантов.

5. Способ по пп.1-3, отличающийся тем, что помещают экспланты в раствор, содержащий жидкую среду и антибиотик, подавляющий развитие штамма Agrobacterium tumefaciens, и отмывают экспланты при комнатной температуре с использованием ротационной качалки в течение 5-40 мин.

РИСУНКИ

Рисунок 1, Рисунок 2

NF4A Восстановление действия патента Российской Федерации на изобретение

Извещение опубликовано: 27.08.2006        БИ: 24/2006

---