Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериоза кишечника

 

Изобретение относится к области медицины, биохимии. Способ определения проводят в супернатантах фекалий, свободных от бактерий, при помощи хлороформа, при котором 20 мкл супернатанта вносится в лунку со специальной питательной средой, в которую вносится казеин. 1,5%-ный раствор казеина на 0,2 Н NaOH вносят к расплавленному питательному агару в соотношении 1:10, автоклавируют при 121°С 15 мин, доводят рН до 7,2-7,4 и разливают в стерильные чашки Петри. После охлаждения чашек в агаре делают лунки диаметром 6 мм. После культивирования в термостате при 37°С 6-8 ч зоны протеолиза проявляют внесением на агар 5 мл 5%-ного водного раствора соляной кислоты. Диаметры зон протеолиза измеряют в миллиметрах (мм). В результате измерения зон протеолиза активность считали низкой при диаметре зон до 10 мм, средней - при 11-16 мм, высокой - при диаметре зон протеолиза выше 16 мм. Изобретение обеспечивает быстроту и легкость осуществления.

Изобретение относится к медицине, а именно к гастроэнтерологии, микробиологии и биохимии. В последнее время при самых разнообразных внешних воздействиях (загрязнение окружающей среды, повышенный радиационный фон, магнитные возмущения и др.), экстремальных условиях, стрессовых ситуациях, гиподинамии, нарушениях биоритмов, в случаях снижения иммунологического статуса, развития в желудочно-кишечном тракте патологических состояний и воспалительных процессов как инфекционной, так и неинфекционной этиологии происходят экологические сдвиги в микробном пейзаже кишечника (Соколова К.Я., Соловьева И.В. Дисбактериозы. Теория и практика. Н.Новгород, 1999; Ефимов Б.А., Володин Н.Н., Кафарская Л.И. и др. Характеристика микроорганизмов, колонизирующих кишечник человека. Журн. микробиол. 2002, 5:98-104).

Развитие дисбактериозов кишечника различной этиологии отягощает течение основного заболевания, ухудшает его прогноз. В ряде случаев дисбактериозы становятся в последующем определяющим фактором в формировании патологического состояния организма, приводят к выраженным функциональным нарушениям в пищеварительном тракте и могут быть причиной развития инфекционного заболевания. По данным многих авторов, дисбактериоз кишечника наблюдается среди 70-90% больных желудочно-кишечными, сердечно-сосудистыми, неврологическими, аллергическими и др. заболеваниями (Воробьев А.А., Абрамов Н.А., Бондаренко В.М., Шендеров Б.А. Дисбактериозы - актуальная проблема медицины. Вестн. РАМН, 1997, 3:4-7. Salminen S., Isolauri E., Onnela Т. Gut flora in normal and disordered states. Chemotherapy. 1995, 41 (suppl.l):5-15).

В медицинской практике для диагностики дисбактериозов кишечника используется, как правило, классический бактериологический анализ, требующий наличия большого количества дорогостоящих питательных сред и длительный во времени (не менее 5 дней). Следует отметить, что только в кишечнике человека обитают около 500 видов микроорганизмов нормальной микрофлоры. При этом соотношение анаэробов к аэробам 1000:1, и учесть все столь отдаленные в таксономическом отношении микроорганизмы при классическом бактериологическом анализе практически невозможно.

Для скрининговых исследований на дисбактериоз требуется разработка достаточно быстрых биохимических методов, легко осуществляемых на практике.

Аналогом, по мнению авторов, является метод определения казеинолитической (протеолитической) активности микробов на казеиново-агаровых пластинках, предложенный В.М. Никитиным (Справочник методов биохимической экспресс-индикации микробов. Кишинев, 1986, с.117-119).

Принцип. При взаимодействии протеиназ бактериальных культур с казеином, содержащимся в агаровой среде, происходит его расщепление. При добавлении коагулянта белка на мутном фоне агара выявляются зоны просветления вокруг роста казеинолитически активных микроорганизмов.

Реагенты и материалы. Исследуемые суточные культуры микробов на МПБ или МПА; раствор 1% казеина на 1/15 М фосфатном буфере рН 7,2; 2% агар на физрастворе, рН 7,2, в пробирке или колбочку; проявители для белка (казеина): а) 10% раствор трихлоруксусной кислоты во флаконе с притертой пробкой или б) ледяная уксусная кислота 1 г, метиловый спирт 4,5 мл, дист. вода 4,5 мл; красители для белка (казеина) - амидочерный 10 В или кумаси ярко-синий R-250 во флаконах из темного стекла с притертой стеклянной пробкой; пробирки, пипетки, чашки Петри, предметные стекла, пробойники для создания лунок (колодцев) в агаре и др. лабораторное оборудование.

Приготовление раствора-красителя, используемого для окраски белковых преципитатов казеина: амидочерный 10 В (или кумаси ярко-синий R-250) 50,0 г + этиловый спирт 96° 4,5 л + ледяная уксусная кислота 1,0 л + дист. вода 4,5 л. Краску растворяют, и раствор оставляют на ночь при комнатной температуре, затем фильтруют и используют. Применение красителя повышает чувствительность метода.

Методика внесения казеина в агар. В 10 мл расплавленного и охлажденного до 60-65°С 2% агара в пробирке приливают 1 мл 1% раствора казеина, перемешивают и содержимое быстро выливают в стерильную чашку Петри или на поверхность двух предметных стекол. После застывания агара в нем проделывают лунки диаметром 5-7 мм. В каждую лунку вносят густую взвесь испытуемых микробов, заполняя ее до краев. Чашки (предметные стекла) с посевами помещают в термостат при 37°С. Через 6-12 ч на поверхность агара с пробами наносят проявитель “а” или “б” в объеме 4-5 мл (пробы на предметном стекле опускают в чашку с проявителем), выдерживают 7-10 мин и удаляют.

Регистрация результатов осуществляется визуально. На мутном фоне казеинового агара при положительном результате отмечаются зоны просветления с казеинолитическими микробными культурами. При отрицательной реакции агаровая среда вокруг лунки остается равномерно мутной. Применение красителей способствует повышению чувствительности методики, поскольку мутные преципитаты казеина становятся более контрастными, приобретая черно-синий цвет, а зоны лизиса, наоборот, бывают неокрашенными и светлыми и лучше выявляются, особенно слабые степени бактериального казеинолизиса.

Некоторыми недостатками предлагаемого способа являются:

- плохая растворимость казеина в фосфатном буфере,

- неравномерное его введение в питательную среду.

В качестве прототипа авторы предлагают биохимический экспресс-метод, разработанный в лаборатории генетики вирулентности бактерий НИИЭМ им. Н.Ф. Гамалеи (Лучшев Л.И., Бондаренко В.М., Исаева Н.П., Земскова Л.И., Шахмарданов М.З., Грицевская Н.Ю. Косвенный метод экспресс-диагностики дисбактериозов кишечника у больных сальмонеллезом и дизентерией. Эпидемиология и инфекционные болезни. 1996, 1:52-54), основанный на определении протеолитической (казеинолитической) активности содержимого толстой кишки, что позволяет в общей сложности оценить состояние микробного биоценоза и дать ориентировочный ответ через 18 ч от начала исследования.

Тестирование казеинолитической активности проводили на чашках Петри с казеиновым агаром после 18-часовой инкубации в термостате. Зоны протеолиза проявляли добавлением 5% трихлоруксусной кислоты.

Активность считали низкой при диаметре зон до 10 мм, средней - при 11-15 мм и высокой - при диаметре зон протеолиза выше 16 мм.

Недостатками прототипа является отсутствие данных о заборе материала для исследований, о способе внесения в питательную среду казеина, о приготовлении питательной среды для определения казеинолитической активности.

Авторами предлагается способ определения казеинолитической (протеолитической) активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериозов в супернатантах фекалий.

Для анализа порции фекалий собирали в стерильную посуду либо сбор материала осуществляли стерильным зондом с декроновым или ватным тампоном, который вводили в прямую кишку как можно выше, и вращательными движениями, избегая соприкосновения со стенками кишечника, собирали материал, который переносили в пробирку с физиологическим раствором. До отправки в лабораторию образцы можно хранить в течение нескольких дней при +5-8°С.

Исследование протеолитической (казеинолитической) активности супернатантов фекалий осуществляли в порции фекалий 1-2 г, которую разводили физиологическим раствором 1:10. После 20 мин отстаивания жидкость над осадком отсасывали и переносили в пробирки, приливали к пробе не более 0,05 мл (1 каплю) хлороформа (для лизиса бактерий и обеззараживания), отстаивали в течение 30-40 мин и вносили в лунки (не более 9 на чашке) со специально приготовленной питательной средой по 20 мкл. В одну из лунок для контроля вносили казеинолитически активную пробу с известной степенью протеолиза.

Способ приготовления питательной среды с казеином состоит из следующих этапов. Вначале готовили 100 мл 3,5% стандартного питательного агара, содержащего дрожжевой или рыбный экстракт и другие ингредиенты (производство г.Махачкала и др.), предназначенного для 5 чашек Петри, и доводили до кипения. Затем готовили 1,5% раствор казеина на 0,2 Н NaOH (0,15 г казеина на 10 мл щелочи). При этом добивались полного растворения казеина в щелочном растворе. После этого питательный агар и раствор казеина смешивали 10:1, автоклавировали при 121°С 15 мин, доводили рН до 7,2-7,4 и разливали в стерильные чашки Петри. После охлаждения чашек на ровной поверхности в агаре делали лунки диаметром 6 мм специальным пробойником или штампом. Таким образом, питательная среда с казеином была готова для внесения в лунки супернатантов фекалий для определения в них казеинолитической (протеинолитической) активности.

После культивирования в термостате при 37°С 6-8 ч зоны протеолиза проявляли внесением на агар 5 мл 5% водного раствора соляной кислоты. При этом не требуется дополнительно подкрашивать агар для проявления зон протеолиза, что сокращает количество этапов и делает способ более экономичным.

Способ позволяет оценить состояние микробного биоценоза, обладает быстротой и легкостью осуществления, что позволяет использовать его в скрининговых исследованиях.

Предложенный способ позволяет полностью растворять казеин и вносить его без остатка в питательную среду. При этом можно увеличить концентрацию казеина в растворе, что повышает чувствительность определения. Время культивирования в термостате сокращается до 6-8 ч. При проявлении реакции не требуется дополнительного подкрашивания среды, т.е. исключается дополнительный этап реакции, что делает способ более экономичным во времени и в плане материальных затрат.

Диаметры зон протеолиза измеряли в миллиметрах (мм). В результате измерения зон протеолиза на нашей среде активность считали низкой при диаметре зон до 10 мм, средней - при 11-16 мм, высокой - при диаметре зон протеолиза выше 16 мм.

При параллельном исследовании фекалий на дисбактериоз с помощью классического бактериологического анализа и с использованием экспресс-метода, проведенным на большом количестве пациентов (543 чел.), была установлена корреляция между снижением популяционного уровня анаэробной облигатной и факультативной нормальной микрофлоры, повышением численности аэробной условно патогенной грамнегативной микрофлоры и размерами зон протеолиза супернатантов фекалий. Это связано с возрастанием количества бактерий, продуцирующих различные протеазы.

Совпадение результатов при использовании классического и экспресс-методов составило 89,8%. Прослеживалась прямая корреляция между диаметрами зон протеолиза и степенью выраженности дисбактериоза, что может применяться с диагностической целью и служить критерием эффективности проводимой терапии.

Формула изобретения

Способ определения казеинолитической активности микроорганизмов при экспресс-диагностике дисбактериозов кишечника, включающий определение протеолитической активности супернатантов фекалий по зонам лизиса на питательной среде, отличающийся тем, что помещенную в пробирку порцию фекалий массой 1-2 г разводят физиологическим раствором 1:10, после 20 мин отстаивания отсасывают жидкость и переносят ее в пробирки, приливают к пробе не более 0,05-0,1 мл хлороформа, после отстаивания в течение 30-40 мин вносят в лунки с питательной средой по 20 мкл супернатанта, а в одну из лунок - контрольную казеинолитически активную пробу, после чего культивируют в термостате 6-8 ч и зоны лизиса проявляют внесением на агар 5 мл 5%-ного водного раствора соляной кислоты и измеряют диаметры зон просветления, причем среду готовят из 100 мл стандартного питательного агара, доведенного до кипения, приготавливают 1,5%-ный раствор казеина на 0,2 Н NaOH и доводят до полного растворения его в щелочном растворе, после чего питательный агар и раствор казеина смешивают 10:1, автоклавируют при 121°С 15 мин, доводят рН до 7,2-7,4 и разливают в стерильные чашки Петри, а после охлаждения делают лунки диаметром 6 мм в количестве не более 9.