Способ подавления модуляции днк, набор

 

Изобретение относится к биотехнологии и может быть использовано для подавления модуляции ДНК, вызываемой mut p53. Модуляцию ДНК подавляют путем ингибирования связывания mut р53, содержащего мутантный коровый домен и/или мутантный С-концевой домен, с последовательностью ААТАТАТТТ или ее вариантами, в которых содержание АТ остатков не изменилось. Ингибирование осуществляют с помощью веществ, ингибирующих mut р53, в частности РАВ 240 и РАВ 241. Набор для идентификации веществ, пригодных для подавления модуляции ДНК, включает mut р53 и ДНК, содержащую ААТАТАТТТ или ее варианты. Изобретение позволяет идентифицировать вещества, пригодные для ингибирования модуляций ДНК, вызванных mut р53. 2 с. и 8 з.п. ф-лы, 5 ил.

Настоящее изобретение относится к способу ингибирования модуляции ДНК, вызванной мутантным р53. Кроме того, изобретение относится к системе идентификации веществ, пригодных для такого ингибирования.

В клетках присутствует протеин, обозначенный как р53. Он является супрессором опухоли и активируется при повреждениях ДНК. В этом случае он связывается с промоторами генов-мишеней и активирует их транскрипцию. В результате происходит остановка роста клеток с последующей репарацией повреждений ДНК, соответственно наступает гибель клеток.

Было установлено, что р53 во многих типах опухолей содержит мутации. В этой форме он не обладает активностью в отношении супрессии опухоли. Более того, он часто превращается в протеин, обладающий онкогенными свойствами. Предпринимались различные попытки ингибировать онкогенные свойства мутантного р53 (в дальнейшем обозначаемого как mut p53). Однако эти попытки не привели к достижению удовлетворительных результатов.

Таким образом, задачей настоящего изобретения является разработка средства, с помощью которого можно исследовать mut p53 и при необходимости ингибировать его онкогенные свойства.

Указанная задача решается с помощью объектов, представленных в формуле изобретения.

Таким образом, объектом настоящего изобретения является способ ингибирования вызванной мутантным p53 модуляции ДНК, предусматривающий ингибирование связывания mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи.

Настоящее изобретение базируется на сделанном авторами открытии того факта, что mut p53 в отличие от p53 дикого типа может вызывать модуляцию ДНК, в которой возможно размыкание цепи. Было обнаружено, что такой тип ДНК является распространенным и часто присутствует в MAR-ДНК. Понятием MAR-ДНК ("Matrix Attachment Region", "область присоединения матрикса") обозначают регуляторные элементы высшего порядка структурной организации хроматина, с помощью которых хроматин разделяется на топологически независимые "петли", что позволяет осуществлять независимую пространственную и временную регуляцию экспрессии гена и репликации ДНК. Кроме того, было установлено, что ДНК, в которой возможно размыкание цепи, часто включает последовательность ААТАТАТТТ или ее вариант. Наряду с указанной последовательностью ДНК часто имеет и другие области с высоким содержанием остатков AT. Далее, было обнаружено, что модуляция ДНК может быть различной, например она может представлять собой прочный комплекс, состоящий из mut p53 и ДНК, или ее разомкнутую цепь. Было установлено, что модуляция часто представляет собой разомкнутую цепь, если рассматриваемая последовательность и при необходимости пограничные последовательности в целом имеют высокое содержание остатков AT. С другой стороны, модуляция часто представляет собой прочный комплекс, когда последовательности не имеют или имеют лишь небольшое содержание AT. На основе этого было сделано заключение о том, что обусловленную mut p53 модуляцию ДНК можно ингибировать путем подавления связывания mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи.

Согласно изобретению открытие этого факта используется в способе ингибирования вызванной mut p53 модуляции ДНК. Такой способ предусматривает ингибирование связывания mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи.

Понятие "mut p53" обозначает любой p53 или его фрагмент, который может связываться с ДНК, в которой возможно размыкание цепи. p53 главным образом представляет собой протеин, который имеет мутантный коровый домен и/или мутантный С-конец. Примерами таких мутантных p53 являются Рrо273 p53 и MethA p53. mut p53 также может представлять собой протеин, который присутствует наряду с другим протеином в слитом протеине.

Понятие "ДНК, в которой возможно размыкание цепи" означает любую ДНК, которая может быть модулирована с помощью mut p53. Модуляция ДНК может иметь различный характер, например она может представлять собой прочный комплекс, состоящий из mut p53 и ДНК, в которой возможно размыкание цепи, или ее разомкнутую цепь. ДНК, в которой возможно размыкание цепи, главным образом представляет собой ДНК, которая имеет одну или несколько копий последовательности ААТАТАТТТ или ее варианта. Кроме того, ДНК может иметь и другие области с высоким содержанием остатков AT. ДНК, в которой возможно размыкание цепи, предпочтительно находится в MAR-ДНК.

Понятие "связывание" означает связывание любого типа и характера, в результате которого mut p53 может связываться с ДНК, в которой возможно размыкание цепи. Главным образом связывание представляет собой непосредственное связывание mut p53 с ДНК. Связывание также может осуществляться косвенным образом, т.е. в этом случае p53 связывается с ДНК посредством других факторов, таких как протеины.

Понятие "ингибирование" означает ингибирование любого типа и характера, в результате которого может подавляться связывание mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи. Тип ингибирования зависит от того, осуществляется ли связывание mut p53 с ДНК непосредственно или происходит косвенным образом. В случае косвенного связывания, например посредством других факторов, таких как протеины, ингибирование может осуществляться с помощью веществ, которые ингибируют эти другие факторы. Могут также использоваться вещества, которые ингибируют mut p53. В случае непосредственного связывания mut p53 с ДНК целесообразно использовать вещества, которые ингибируют mut p53. Такие вещества могут представлять собой, например, любые вещества, ингибирующие мутантный коровый домен p53 и/или мутантный С-конец p53. Примерами таких веществ являются поликлональные антитела (ПАт) ПАт 240 и ПАт 421.

Объектом изобретения является также система, предназначенная для идентификации веществ, которые пригодны для ингибирования вызванных mut p53 модуляций ДНК. Такая система включает mut p53 и ДНК, в которой возможно размыкание цепи, а также при необходимости вещество, ингибирующее действие которого в отношении связывания mut p53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи, требуется исследовать. В отношении отдельных компонентов системы соответственно применимы приведенные выше определения. Кроме того, следует отметить, что модуляция ДНК, соответственно ее ингибирование могут быть определены общепринятыми методами. Так, например, размыкание цепи ДНК, соответственно образование комплекса, и их ингибирование могут быть определены с помощью метода EMSA ("Electrophoretic Mobility Shift Assay", "анализ сдвига электрофоретической подвижности"). Для этой цели предлагается инкубировать mut p53 вместе с меченой двухцепочечной ДНК, в которой возможно размыкание цепи, и производить электрофоретическое разделение смеси, в результате чего можно обнаружить образование одноцепочечной ДНК, соответственно комплекса, и их ингибирование.

С помощью настоящего изобретения оказывается возможным ингибировать вызываемую mut p53 модуляцию ДНК. Такая модуляция может представлять собой прочный комплекс, состоящий из mut p53 и ДНК, в которой возможно размыкание цепи, или представлять собой вызванное этим протеином размыкание цепи ДНК. Модуляция ДНК играет большую роль во многих процессах, происходящих в клетке. Так, например, размыкание цепи ДНК представляет собой важный этап при экспрессии генов и репликации ДНК. Размыкание цепи ДНК находится под строгим контролем. С помощью mut p53 этот контроль может быть существенно ослаблен. В результате открывается путь, который может привести к перерождению клетки, т.е. к образованию опухоли.

Настоящее изобретение дает возможность осуществлять терапевтическое воздействие при заболеваниях, при которых mut p53 вызывает модуляцию ДНК. Такие заболевания прежде всего представляют собой опухолевые заболевания. Кроме того, настоящее изобретение отличается тем, что предоставляет возможность идентифицировать вещества, пригодные для ингибирования модуляций ДНК, вызванных mut p53, прежде всего в случае опухолей. Такие вещества также являются объектом настоящего изобретения.

Краткое описание чертежей

На прилагаемых к описанию чертежах показано:

на фиг.1 - вызванное mut p53 размыкание цепи ДНК в MARI-ДНК,

на фиг.2 - вызванное mut p53 размыкание цепи ДНК в MARII-ДНК,

на фиг.3 - вызванное mut p53 образование комплекса в MAR6- и MAR7-ДНК,

на фиг.4 - вызванное mut p53 образование комплекса в MAR1- и MAR5-ДНК и

на фиг.5 - ингибирование вызванного mut p53 размыкания цепи ДНК в MARI-ДНК.

Ниже изобретение поясняется на примере.

Пример: Модуляция ДНК с помощью mut p53 и ее ингибирование.

В этом примере проиллюстрирована модуляция ДНК в форме размыкания цепи ДНК, соответственно в форме образования комплекса.

(а) Индуцирование размыкания цепи ДНК, соответственно образования комплекса с помощью mut p53.

Из XbaI-фрагмента MAR иммуноглобулина IgE длиной 997 пар оснований, расположенного в области энхансера гена тяжелой цепи иммуноглобулина, конструировали две MAR-области в форме олигонуклеотидов. Они представляли собой MARI, т.е. 3'-фланкирующую область энхансера, и MARII, т.е. 5'-фланкирующую область энхансера. Олигонуклеотиды имели следующие последовательности:

MARI, 3'-фланкирующая область энхансера IgH:

MARII, 5'-фланкирующая область энхансера IgH:

5'-TTTTAACAATAATAAATTAAGTTTAAAATATTTGCG-3'.

MARI имела указанную выше последовательность ААТАТАТТТ. MARII имела вариант этой последовательности, при этом общее содержание остатков AT оставалось неизменным.

Затем конструировали олигонуклеотиды, имеющие варианты MARI, заключающиеся в том, что общее содержание остатков AT было уменьшено. Эти олигонуклеотиды имели следующие последовательности:

MAR6: ACTATGCTT;

MAR7:GCTCTCTTT.

После этого конструировали олигонуклеотиды, которые имели последовательность MARI наряду с пограничными "GC-сцеплениями". Эти "GC-сцепления" уменьшали общее содержание АТ-остатков.

Олигонуклеотиды синтезировали, их концы метили с помощью ³²P и подвергали реакции отжига, в результате чего они становились двухцепочечными. Их инкубировали с р53 дикого типа, соответственно с mut p53, например с MethA p53, соответственно с Pro 273 p53, и подвергали тестированию с помощью EMSA. При этом работали по следующей методике.

Смеси, содержащие p53 дикого типа и MethA p53, соответственно Pro 273 p53, подвергали предварительной инкубации в течение 20 мин с 2 мкг Poly dl:dC (неспецифический конкурент) в среде, содержащей 10 мМ Hepes (N-2-гидроксиэтилпиперазин-N'-2-этансульфоновая кислота) с рН 7,8, 50 мМ КСl, 1 мМ ЭДТК, 5 мМ MgCl₂, 10% глицерина.

После предварительной инкубации добавляли меченые олигонуклеотиды и смеси инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Затем смеси подвергали в течение 3 ч гель-электрофорезу в 4%-ном нативном полиакриламидном геле, после чего гели сушили и подвергали авторадиографии (фиг.1-4).

Было установлено, что mut p53, например MethA p53, соответственно Pro 273 p53, могут вызывать модуляцию ДНК, например размыкание цепи, соответственно образование комплекса с ДНК, в которой возможно размыкание цепи.

(б) Ингибирование вызванного mut p53 размыкания цепи ДНК

Осуществляли последовательность операций, описанную в разделе (а), за исключением того, что смеси с MethA p53 также содержали антитела ПАт 421, соответственно ПАт 240. В качестве олигонуклеотидов использовали олигонуклеотиды, содержащие MARI-ДНК (фиг.5).

Очевидно, что связывание mut p53 с веществом, которое ингибирует ДНК, в которой возможно размыкание цепи, таким как ПАт 421, соответственно ПАт 240, может приводить к ингибированию индуцированного mut p53 размыкания цепи ДНК.

Формула изобретения

1. Способ подавления модуляции ДНК, предусматривающий ингибирование связывания mut р53, содержащего мутантный коровый домен и/или мутантный С-концевой домен, с ДНК, в которой возможно размыкание цепи, причем ингибирование относится к связыванию mut р53 с последовательностью ААТАТАТТТ или ее вариантами, в которых содержание АТ-остатков не изменилось.

2. Способ по п.1, где модуляция представляет собой прочный комплекс mut р53 и ДНК, в которой возможно размыкание цепи.

3. Способ по п.1, где модуляция представляет собой размыкание цепи ДНК, в которой возможно размыкание цепи.

4. Способ по любому из пп.1-3, где вариант включает последовательность ААТАТАТТТ.

5. Способ по любому из пп.1-4, где ДНК, в которой возможно размыкание цепи, расположена в MAR-ДНК.

6. Способ по любому из пп.1-5, где ингибирование осуществляют с помощью веществ, ингибирующих мутантный коровый домен и/или мутантный С-концевой домен р53.

7. Способ по п.6, где вещества представляют собой антитела РАВ 240 и РАВ 421.

8. Набор, предназначенный для идентификации веществ, пригодных для ингибирования модуляции ДНК, и включающий следующие компоненты: (а) mut р53 с мутантным коровым доменом и/или мутантным С-концевым доменом, (b) ДНК, в которой возможно размыкание цепи, которая включает последовательность ААТАТАТТТ или ее варианты, в которых содержание АТ остатков не изменилось.

9. Набор по п.8, который дополнительно включает вещество, ингибирующее воздействие которого на связывание mut р53 с ДНК, в которой возможно размыкание цепи, требуется исследовать.

10. Набор по п.8 или 9, в котором вариант включает последовательность ААААТА

РИСУНКИРисунок 1, Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5