Способ определения скорости гидролиза мочевины уреазой в почвах

 

Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв. Способ включает определение скорости образования аммиака при взаимодействии мочевины с почвой. Мочевину перед внесением в почву переводят в кинетически гидрофобизованное порошкообразное состояние загущением расплава мочевины гидрофильным аэросилом при содержании последнего 30-50 вес.%. Способ позволяет определить скорость гидролиза мочевины уреазой в реальных почвенных условиях. 1 табл.

Изобретение относится к сельскому хозяйству и почвоведению, а именно к методам оценки биологической активности и почвенного плодородия по ферментативной активности почв.

Известен способ определения уреазной активности почв [1], заключающийся в определении остаточных количеств мочевины по Фоссу. В соответствии с этим способом 5 г почвы помещают в эрленмейеровскую колбу емкостью 50 мл и прибавляют 5 капель толуола. Через несколько минут вносят 25 мл 2%-ного раствора мочевины, после чего колбы закрывают корковыми пробками, встряхивают и помещают в термостат на 40 часов при температуре 30°С. После инкубации смесь фильтруют и определяют содержание мочевины. Активность уреазы выражают в миллиграммах гидролизованной мочевины на 1 г почвы за 1 час.

Основным недостатком данного способа является определение скорости ферментативной реакции гидролиза мочевины не в реальных почвенных условиях (влажность почвы, рН, состав почвенного поглощающего комплекса, содержание свободных солей, содержание органики и т.д.), в которых она протекает, а в суспензии почвы в растворе мочевины. Такой подход позволяет с определенным приближением характеризовать количество ферментов в почве [2, 3], но не дает возможности определять активность уреазы в условиях почвы и делать выводы о скорости ферментативной реакции в реальности.

Наиболее близким к заявляемому является метод И.Н.Ромейко [1], заключающийся в определении количества образовавшегося аммиака. Навеску (5 г) почвы помещают в колбу емкостью 100 мл, подливают по 20 мл фосфатного буфера (рН 6,7) и 2%-ного раствора мочевины. Колбу тщательно встряхивают и помещают в термостат при 37°С. Через 3 часа для приостановки ферментативных процессов в колбу добавляют йодистую ртуть. Затем раствор фильтруют через бумажный фильтр и определяют содержание аммиака с реактивом Несслера фотоэлектроколориметрически. Активность уреазы выражают в мг аммония на 100 г почвы за 3 часа.

Недостатки данного метода также заключаются в проведении опыта в суспензии почвы, а не в реальной почве, что не позволяет изучать влияние состава и физико-химических свойств почв на активность уреазы в почвах. Отметим, что в отличие от концентрации активность ферментов может в десятки раз меняться при изменении рН или ионной силы почвенных растворов, степени иммобилизации и других факторов, обусловленных свойствами почв. Поэтому получение данных, характеризующих концентрацию ферментов недостаточно информативно и не позволяет однозначно характеризовать активность ферментов и скорость ферментативных реакций.

Целью изобретения является определение скорости гидролиза мочевины уреазой в реальных почвенных условиях. Данный параметр является одной из характеристик почвенной биологической активности и почвенного плодородия [4,5].

Технической задачей изобретения является диспергирование мочевины с получением кинетически гидрофобных частиц, причем время сохранения гидрофобности должно позволять равномерно распределять эти частицы в почве.

Поставленная задача решается введением в мочевину гидрофильного аэросила при содержании аэросила 30-50 вес.% и переводе мочевины в порошкообразное состояние. Гидрофильный аэросил состоит из частиц размером 10-40 нм, которые сорбируют на своей поверхности воздух. Для смачивания необходимо вытеснение воздуха с поверхности, и смачивание слоя этих частиц происходит замедленно, что позволяет, варьируя толщину слоя, произвести однородное перемешивание аэросильной смеси (АС) с почвой.

Техническая сущность изобретения заключается в переводе мочевины перед внесением ее в почву в кинетически гидрофобизованное состояние загущением расплава гидрофильным аэросилом при содержании последнего 30-50 вес.%. Аэросил вносят в расплав мочевины при температуре 133-134°С в количестве, соответствующем 25% от АС, и тщательно перемешивают. На втором этапе полученную смесь охлаждают, добавляют аэросил до необходимого содержания в АС и тщательно перетирают. После приготовления навеска аэросильной смеси помещается в емкость, в которой уже находится почва и перемешивается с ней. Отбор проб из смеси берут через 1, 2 и 3 часа и определяют в них содержание аммония по стандартной для почв методике с реактивом Несслера. Скорость гидролиза мочевины уреазной в почвах в мг аммония на 100 г почвы за 3 часа.

Предлагаемый способ исключает неопределенность перенесения данных по активности уреазы в суспензии почвы, на активность уреазы в почве, так как позволяет проводить испытания непосредственно в почвах. Еще более важным достоинством способа является возможность проводить изучение влияния на скорость ферментативной реакции и биологическую активность почв различных внешних воздействий, что по существующим методикам невозможно в принципе.

Нижеследующие примеры раскрывают суть предлагаемого изобретения.

Пример 1.

Эксперименты показывают, что при содержании аэросила А-380 (размер частиц 10-40 нм) в аэросильной смеси меньше 30% не удается ее равномерно перемешать с почвой. Контакт с почвой этих аэросильных смесей приводит к почти мгновенному втягиванию в них влаги из почв и комкованию, что не позволяет провести перемешивание аэросильных смесей с почвой. В этих случаях количества аэросила в смеси недостаточно, чтобы замедлить процесс взаимодействия с влагой почвы до временных интервалов, позволяющих провести перемешивание почвы с аэросильной смесью.

Пример 2.

При содержании аэросила А-380 в аэросильной смеси больше 50% удается приготовить гомогенную смесь с почвой, но ферментативная реакция замедляется на 20-25%, что, по-видимому, связано с замедлением диффузии через аэросильный слой.

Пример 3.

При содержании аэросила А-380 в аэросильной смеси удается получить гомогенные смеси с почвой при высокой скорости ферментативной реакции гидролиза мочевины. Для определения активности уреазы в тепличном грунте брали 40 г почвы, помещали в стакан емкостью 200 мл. Туда же помещали навеску АС 1,07 (30%), 1,25 (40%) или 1,5 (50%) г, соответствующую одинаковому содержанию мочевины в почвенной смеси. Аэросильные смеси готовили введением аэросила А-380 в расплав мочевины при температуре 133-134°С при содержании аэросила в АС, соответствующем 25% и тщательно перемешивали. После охлаждения вносили аэросил в полученную АС до необходимого его содержания в АС (30, 40, 50%) и тщательно перетирали в ступке. Образцы тепличного грунта, содержащие аэросильные смеси, оставляли на 3 часа при комнатной температуре 23-24°С. После этого проводили определение аммония в почве по стандартной методике с реактивом Несслера. Для сравнения определили уреазную активность тепличного грунта по методике, являющейся ближайшим аналогом, и для возможности их сравнения отнесли полученные данные на 1 мг субстрата (см. таблицу).

Полученные результаты свидетельствуют, что между скоростью ферментативной реакции, определенной в реальных почвенных условиях (заявляемый способ) и в суспензии (ближайший аналог), существует более чем двукратное расхождение, причем в суспензии реакция протекает медленнее, несмотря на то, что проводится не при комнатной температуре, а при 37°С. Это позволяет сделать вывод о том, что суспензионный метод определения активности уреазы позволяет получать только оценочные данные по скорости ферментативной реакции в почве.

Таким образом, изобретение позволяет:

1). определять активность уреазы и скорость ферментативной реакции в реальных почвенных условиях, а следовательно, корректно оценивать их биологическую активность;

2). изучать влияние свойств почв на скорость гидролиза мочевины уреазой в них;

3). определять влияние внешних факторов воздействия на скорость ферментативной реакции.

Литература

1. Хазиев Ф.Х. Ферментативная активность почв. М.: Наука, 1976, 179 с.

2. Хазиев Ф.Х. Системно-экологический анализ ферментативной активности почв. М.: Наука, 1982, 203 с.

3. Звягинцев Д.Г. Проблемы биохимии почв. - Вестн. МГУ. Сер. 17, 1977, №1, с. 74-84.

4. Кольцова О.М., Стекольников К.Е., Казанджьян П.К. Ферментативная активность как метод диагностики плодородия почв. - Мелиорация и водное хозяйство. 1993, №2, с.29-31.

5. Михайловская Н.А. Ферментативная активность как показатель плодородия дерново-подзолистой легкосуглинистой почвы. Автореф. дис. канд. с-х наук. Минск, 1988, 17 с.

Формула изобретения

Способ определения скорости гидролиза мочевины уреазой в почвах, заключающийся в определении скорости образования аммиака при взаимодействии мочевины с почвой, отличающийся тем, что мочевину перед внесением ее в почву переводят в кинетически гидрофобизованное порошкообразное состояние загущением расплава мочевины гидрофильным аэросилом при содержании последнего 30-50 вес.%.